碳化二亚胺交联改性脱细胞异种猪肌腱修复跟腱缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.12.009

摘要/Abstract

摘要：

背景：异体肌腱移植是目前修复肌腱缺损的理想方法，但移植后的排斥反应使其使用受到限制。
目的：观察碳化二亚胺交联改性脱细胞处理的版纳近交系微型猪肌腱移植修复兔跟腱缺损的效果。
方法：横向切除40只日本大白兔双侧跟腱，随机分组：实验组以碳化二亚胺交联改性脱细胞版纳近交系微型猪肌腱移植修复，对照组以自体肌腱移植修复。
结果与结论：①组织学观察：两组新生组织内细胞主要都是单核的成纤维细胞和纤维细胞，术后1-4周主要是呈椭圆形或圆形的成纤维细胞，细胞聚集区的细胞周围有新生胶原形成，这些胶原的走向较紊乱；局灶性条索状成熟胶原呈岛状分布，形成所谓“胶原岛”；术后12周时细胞越来越拉长，成为梭形和长条形的纤维细胞。②实验室检测：两组白细胞、C-反应蛋白水平、羟脯氨酸含量及抗拉强度差异均无显著性意义。说明碳化二亚胺交联改性的脱细胞版纳近交系微型猪肌腱能成功修复兔跟腱缺损，且具有组织相容性好、移植排斥反应轻、生物力学性能强的优点。

关键词: 生物材料, 材料生物相容性, 肌腱, 碳化二亚胺, 脱细胞, 猪, 异种移植, 羟脯氨酸, 跟腱缺损, 其他基金, 生物材料图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Heterogeneous tendon is an ideal method to repair tendon defects, but the post-transplantation rejection limits the application of heterogeneous tendons.
OBJECTIVE: To investigate the effect of transplantation of 1-ethy1-3-(3-dimethylaminopropy1) carbodiimide hydrochloride cross-linking acellular tendon of Banna inbred-lines miniature pig for repairing the rabbit Achilles tendon defects.
METHODS: Lateral resection of bilateral Achilles tendons from 40 Japanese rabbits was performed, and then the tendons were divided into experimental group and control group. The experimental group was repaired with transplantation of 1-ethy1-3-(3-dimethylaminopropy1) carbodiimide hydrochloride cross-linking acellular treated tendon of Banna mini-pig inbred-lines, and the control group was repaired with autologous tendon graft.
RESULTS AND CONCLUSION: Histological observation showed that the cells in the new tissue of two groups were mainly the mononuclear fibroblast and fibrocytes, and the cells were oval or circular fibroblasts at 1-4 weeks after operation; new collagen formation could be seen around the cells in the cell aggregation area, and the collagen represented disorderly; focal cord-like mature collagen was distributed in island shape and formed the so-called “collagen island”; at 12 weeks after operation, the cells were increasingly elongated and became spindle-shaped and long strip fibroblasts. Laboratory testing showed that there were no significant differences in white blood cells, C-reactive protein levels, hydroxyproline content and tensile strength between two groups. The results show that 1-ethy1-3-(3-dimethylaminopropy1) carbodiimide hydrochloride cross-linking acellular tendon from Banna mini-pig inbred-lines can repair rabbit Achilles tendon defects successfully with good histocompatibility, less transplant rejection and strong biomechanical performance.

Key words: biomaterials, material biocompatibility, tendon, carbodiimide hydrochloride, acellular, pig, xenogeneic transplantation, hydroxyproline, Achilles tendon injury, other grants-supported paper, biomaterials photographs- containing paper

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 40只兔均进入结果分析。

2.2 两组移植肌腱苏木精-伊红染色和Movat染色组织学光镜观察结果

术后1周：实验组在光镜下均见到密度极高的椭圆形或圆形成纤维细胞，细胞间可见到胶原纤维，虽然这些胶原的走向较紊乱，但胶原整体构架尚完整，较致密，尚能分辨出其主要走向与跟腱纵轴平行，同时还可见到血管，见图1A。对照组胶原纤维纵行紧密排列，长梭形肌腱细胞位于纤维束间，见图1B。

术后4周：两组均可见到大量椭圆形或圆形成纤维细胞聚集成团，细胞聚集区的细胞周围有新生胶原形成，这些胶原的走向较紊乱；局灶性条索状成熟胶原呈岛状分布，形成所谓“胶原岛”。在部分区域这些胶原条索形成的“胶原岛”分布较紧密，另一些区域“胶原岛”分布较疏散。“胶原岛”内胶原的走向与跟腱纵轴平行。整体胶原构架较疏松，出现一些“空白”的无组织区，见图1C，D。

术后8周：两组出现岛状分布的“胶原岛”连接成带，这些条带与以细胞聚集和不成熟胶原为特征的区域(称其为不成熟胶原区) 间隔交错排列，有些索带贯穿整个标本，胶原走向与跟腱纵轴平行。“空白”无组织区面积缩小。不成熟胶原区内细胞以椭圆形或圆形为主，但出现梭形的纤维细胞。细胞周围新生胶原的走向虽仍略显紊乱,但仍能分辨出大致的走向与跟腱纵轴平行，见图1E，F。

术后12周：两组均出现胶原条带连接成片，因而标本的大部分为成熟的胶原，胶原纤维的走向与跟腱纵轴平行，其中的细胞主要是梭形的纤维细胞。不成熟胶原区明显缩小，形成散在分布的局灶性区域，这些区域内细胞聚集，但细胞数量相对减少，细胞以椭圆形或圆形为主，见图1G，H。

Movat stain五套色染法成熟胶原纤维和新生胶原纤维，见图2。

2.3 两组移植肌腱羟脯氨酸含量比较 见表1。

羟脯氨酸含量测定结果显示，同期两组羟脯氨酸含量比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.4 两组移植肌腱生物力学性能检测结果 移植物近端修复点生物力学检测，检测片段为取材移植物0.7 cm和近端正常肌腱1.5 cm，测量各肌腱长度并计算样本横截面积。力学测试前先采用以下方法计算出每一取材肌腱横切面积：分别测量肌腱长度H(mm)，再将每条肌腱置入5 mL量筒，盛满蒸馏水，取出肌腱算出肌腱取出前后量筒水的体积差，即肌腱的容积V，V/H(mm³/mm)即所测肌腱的横截面积(mm²)。用单位面积的破坏载荷(N/mm²)表示肌腱的生物力学强度。将样本两端固定于生物力学测定仪的拉伸夹具上，夹具间测试段均预留为15 mm。对试件进行预拉伸后，以10 mm/min的速度进行单向拉伸试验，记录应力-应变关系的数据，计算材料力学参数。拉伸强度=断裂应力/横截面积，检测结果见表2。

生物力学检测结果显示，同期两组拉伸强度差异无显著性意义(P > 0.05)。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：于2011年1至5月在解放军昆明总医院全军骨科中心实验室完成。
材料：
实验动物：12月龄日本大白兔40只，雌雄参半，体质量2.3-2.6 kg，均由昆明医学院实验动物科提供。脱细胞版纳近交系微型猪由云南农业大学馈赠。
主要试剂及仪器：EDC、Trypsin、Triton X-100、DMSO、Ⅰ型胶原酶(美国Sigma公司)；硫酸(天津化学试剂厂)；羟脯氨酸测试盒(南京建成科技有限公司)；LEICA显微镜(DMLM，德国莱卡公司)；电子天平(PL203，瑞士梅特勒-托利多公司)；材料力学试验机(AG-Ⅰ50AUTOGRAPH，日本SHIMADZU公司)。
实验方法：
EDC交联改性的脱细胞版纳近交系微型猪肌腱的制备：无菌条件下切取猪趾伸肌腱，机械去除附着组织，PBS反复清洗，选取长度、直径较为相近的标本袋装密封后4 ℃冷藏备用。将取材肌腱置于0.5% Trypsin溶液中， 37 ℃水浴恒温振荡器上消化6 h，再用0.5% Triton X-100在37 ℃条件下浸泡并持续振荡消化48 h以去除细胞成分，然后将肌腱置于超声波清洗机中振荡洗涤，体积分数75%乙醇浸泡30 min，PBS振荡充分漂洗，袋装密封后⁶⁰Co照射灭菌(辐照总量25 kGy)，将其用EDC交联液[含50 mmol/L MES，5 mmol/L EDC，5 mmol/L NHS，用体积分数40%乙醇(pH值5.5)配制]室温交联 6 h，交联后用体积分数95%乙醇漂洗2次，20-30 min/次。PBS漂洗2次共24 h，Hepes缓冲液漂洗4次，15- 20 min/次。⁶⁰Co照射灭菌(辐照总量25 kGy)，4 ℃冷藏备用。
动物实验及分组干预：将40只日本大白兔随机分实验组与对照组，每组20只，实验前1周单独笼中饲养以适应环境，食物及水置于容易随意获取的容器内。
将1%戊巴比妥溶液以1 mL/kg的剂量经耳缘静脉缓慢注射麻醉。剔除两组兔双侧跟键处的兔毛，安尔碘消毒后，取俯卧位固定，消毒铺巾，于双侧跟腱边缘纵向切开皮肤、皮下脂肪，解剖分离跟腱，在跟骨附着点上方1.5 cm处横向切除2.5 cm跟腱，制成双侧跟腱缺损动物模型，实验组取出双侧跟腱，测量其直径，与EDC交联改性的脱细胞版纳近交系微型猪肌腱比较后，用直径匹配的脱细胞版纳近交系微型猪肌腱修补兔缺损的跟腱，对照组缺损的跟腱原位缝合。均在手术显微镜下采用3-0肌腱线改良Kessler缝合，最后缝合皮肤。
术后处理：术后动物采用毛毯保温，直至动物苏醒。分笼饲养，自由活动，术后3 d于大白兔臀部肌肉注射青霉素G，每只每次40×10⁴ U，2次/d，以预防感染。移植后1，4，8，12周通过过量空气栓塞杀死实验动物，切开原手术皮肤切口，游离移植肌腱，缓和牵引移植肌腱近端评估足活动范围，每次每组随机抽取5只兔的修复移植肌腱。
主要观察指标：检测分析取材标本中羟脯氨酸含量(吸收光谱法测定)、生物力学性能检测及组织学观察(苏木精-伊红染色和Movat-stained染色样本切片观察总细胞数、炎症细胞含量、排斥反应、血管分布、成熟胶原量及新生胶原沉积量)。
统计学分析：各组数据均用采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，两组间比较采用成组t 检验，组内两两比较用方差分析。实验数据以x(_)±s表示，以P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

从根本上说，EDC交联改性的脱细胞版纳近交系微型猪肌腱是一种异种异体生物支架材料，在实验中制备的EDC交联改性脱细胞肌腱的特点：肌腱细胞基本消失，细胞间间质较少，胶原纤维束间留下较多孔隙，这些空隙有利于宿主细胞爬行修复。

生理状况下肌腱的受力主要为轴向拉力，实验通过匀速轴向拉伸来检测材料的力学性能，结果显示：1周时，实验组肌腱的抗负荷力已接近对照组，表明桥接处正在愈合；术后4，8，12周时，实验组肌腱的抗负荷力已与对照组无异。羟脯氨酸含量测定结果显示：两组标本同期羟脯氨酸含量差异无显著性意义(P > 0.05)，这可能导致观察到实验组修复和修复胶原纤维沉积表现出的抗拉强度。组织的力学特性取决于其组成成分及空间排列情况。肌腱的组成主要包括胶原纤维、成纤维细胞，以及由蛋白聚糖、糖蛋白等组成的基质成分，胶原纤维紧密纵行排列，是承受拉力的最主要结构，其间分布有成纤维细胞或肌腱细胞，间隙中还有少量的基质成分，基质中的一种小分子蛋白聚糖—核心蛋白聚糖在调节胶原纤维形成过程中起着重要作用，有人推测核心蛋白聚糖可在纤维发生形变时组织纤维滑移，从而提高了胶原纤维的拉伸强度。深低温冷冻肌腱胶原纤维及束间结构未受到明显破坏，抗应力和抗应变能力和新鲜肌腱相比无明显差异。脱细胞肌腱破坏细胞间及细胞与结缔组织间的连接，使胶原纤维间间隙增多、增宽，减弱了核心蛋白聚糖对胶原纤维滑移的限制作用，从而减弱了肌腱材料的拉伸强度和抗应变能力。经EDC交联后的脱细胞肌腱可在胶原纤维间及纤维与基质间重新形成分子键连接(如上所述)，从而使肌腱材料结构更加紧密有序，有效限制纤维滑移，增强胶原纤维的拉伸强度，提高材料的力学性能^[9-13]。

对于评价肌腱移植的重要指标除了抗负荷拉力之外，还有是否存在炎症及免疫排斥反应，实验取材大体观察中，术后3 d两组手术切口均出现肿胀，但无流脓，无线结反应，两组之间肉眼下无明显差异。术后1周，两组手术切口肿胀均消退，无线结反应。4周后，两组手术皮肤的缝线大都自行脱落，皮肤切口均生长良好，无明显差异。实验中从术后1周到术后12周，组织学观察发现，两组新生组织内细胞主要都是单核的成纤维细胞和纤维细胞，术后早期(1，4周)主要是呈椭圆形或圆形的成纤维细胞，而相对晚期(12周)时细胞越来越拉长，成为梭形和长条形的纤维细胞。整个过程中，术后越早期组织内细胞越丰富，细胞的形态越接近圆形。术后1周时，组织内的细胞密度最高，而且主要是椭圆形或圆形的成纤维细胞，以后细胞密度和数量逐渐减少，细胞形态亦变化，成为梭形和长条形的纤维细胞。椭圆形或圆形成纤维细胞的功能活性高，而梭形和长条形纤维细胞的功能活性较低。这说明无论从数量上还是质量上，替代活动最活跃的时期是术后8周以内的术后早期，以后随着自身肌腱的形成和成熟，细胞功能活动下降。整个过程中两组各期标本组织学观察都未发现明显的淋巴细胞、浆细胞或脓细胞。这说明早在术后1周时就出现活跃的组织替代活动，但组织替代的方式不是以淋巴细胞或浆细胞吞噬原组织的免疫方式或炎性反应方式进行的，而是由成纤维细胞大量增殖，以加快代谢的方式进行的。作为人工肌腱的脱细胞版纳近交系微型猪肌腱植入兔体内后具有良好的生物相容性。上述现象表明，作为人工肌腱的脱细胞版纳近交系微型猪肌腱植入兔体内后，没有明显的炎症及免疫排斥反应。机体对脱细胞肌腱未表现出明显的免疫排斥反应或炎性反应，这主要与脱细胞肌腱的特性有关。脱细胞肌腱内细胞稀少，主要由胶原构成，而以胶原为主的材料的免疫原性通常很小，因而组织通过成纤维细胞增殖和加快代谢的方式就能清除原有的胶原。

致谢：感谢导师林月秋教授对本课题睿智、独到的见解和不懈的支持，使实验顺利完成，感谢云南农业大学曾养志教授、潘伟荣老师提供宝贵的版纳猪近交系材料并提供无私帮助。感谢昆明总医院动物科赵老师的帮助。感谢昆明医学院病理科钱忠义老师给予的指导和帮助。
基金资助：成都军区科研项目立项项目(MB07028)。
作者贡献：第一作者构思并设计本实验，具体实施实验操作、解析相关数据并成文，第一作者审校，并对本文负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验过程中对动物处置方法符合中华人民共和国科学技术部2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

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延伸阅读

对于评价肌腱移植的重要指标除了抗负荷拉力之外，还有是否存在炎症及免疫排斥反应，本实验取材大体观察中，术后3 d 两组手术切口均出现肿胀，但无流脓，无线结反应，两组之间肉眼下无明显差异。术后1 周，两组手术切口肿胀均消退，无线结反应。4周后，两组手术皮肤的缝线大都自行脱落，皮肤切口均生长良好，无明显差异。本实验中从术后1 周到术后12 周，组织学观察发现，两组新生组织内细胞主要都是单核的成纤维细胞和纤维细胞，术后早期(1，4 周) 主要是呈椭圆形或圆形的成纤维细胞，而相对晚期(12周) 时细胞越来越拉长，成为梭形和长条形的纤维细胞。整个过程中，术后越早期组织内细胞越丰富，细胞的形态越接近圆形。术后1 周时，组织内的细胞密度最高，而且主要是椭圆形或圆形的成纤维细胞，以后细胞密度和数量逐渐减少，细胞形态亦变化，成为梭形和长条形的纤维细胞。椭圆形或圆形成纤维细胞的功能活性高，而梭形和长条形纤维细胞的功能活性较低。这说明无论从数量上还是质量上，替代活动最活跃的时期是术后8 周以内的术后早期，以后随着自身肌腱的形成和成熟，细胞功能活动下降。整个过程中两组各期标本组织学观察都未发现明显的淋巴细胞、浆细胞或脓细胞。这说明早在术后1 周时就出现活跃的组织替代活动，但组织替代的方式不是以淋巴细胞或浆细胞吞噬原组织的免疫方式或炎性反应方式进行的，而是由成纤维细胞大量增殖，以加快代谢的方式进行的。作为人工肌腱的脱细胞版纳近交系微型猪肌腱植入兔体内后具有良好的生物相容性。同时，在白细胞分类计数中，尽管实验组在术后3d 的白细胞数明显高于术前3 d，但对照组的白细胞数也高于术前3 d ，两组白细胞数的增加值间是无差别的，这和术后应激反应有关。术后1 周及2 周，两组之间的白细胞数和C-反应蛋白量差异无显著性意义（P>0.05）。上述现象表明，作为人工肌腱的脱细胞版纳近交系微型猪肌腱植入兔体内后，没有明显的炎症及免疫排斥反应。机体对脱细胞肌腱未表现出明显的免疫排斥反应或炎性反应，这主要与脱细胞肌腱的特性有关。脱细胞肌腱内细胞稀少，主要由胶原构成，而以胶原为主的材料的免疫原性通常很小，因而组织通过成纤维细胞增殖和加快代谢的方式就能清除原有的胶原。

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