2.1 溶血实验结果 阳性对照、阴性对照、TiO₂组、TiO₂:C组的吸光度值分别为0.782±0.012、0.020± 0.004、0.024±0.006、0.022±0.003。TiO₂组、TiO₂:C组的吸光度值低于阳性对照组(P < 0.05)，前两组间差异无显著性意义。经计算TiO₂组、TiO₂:C组的溶血率分别为0.524%，0.262%。一般认为材料的溶血率超过5%才会发生溶血，所以两种材料均不会引起急性溶血。

2.2 细胞毒性实验结果

各组细胞的形态学观察：倒置相差显微镜下培养4 d 各组细胞的形态，见图1，可见3组细胞生长旺盛，形态多为长梭形，均布满瓶壁，细胞数量各组间无明显差别，并可见圆形分裂细胞，细胞折光性强。

荧光显微镜下培养4 d各组细胞细胞死亡情况，见图2。

荧光显微镜下可见各组只有极少量细胞被PI染成红色，可能为正常凋亡细胞，各组未见明显差异。

各组MTT的实验吸光度值 见表1，TiO₂组、TiO₂:C组细胞相对增殖率测试结果见表2。

MTT实验结果表明：随着培养时间的增加，TiO₂组、TiO₂:C组与阴性对照组吸光值也相应增加，且3组间细胞增殖几乎无差异。

将各组细胞相对增殖率转化为0-5级材料毒性评级，结果表明纳米TiO₂及TiO₂:C的毒性等级均为0或1级，即未细胞产生明显毒性。

图3是L929细胞在不同组处理后4 d细胞周期的结果。

由图3A可见G₀/G₁期细胞占总的75.4%，峰位于横座标的83.5；G₂/M期占1.9%，峰位于横座标的155.7，S期占22.7%；G₂/G₁为1.864(即G₂期为4倍体细胞，而G₁期为2倍体细胞，比值为1.864)；峰的变异系数为4.8%。图3B可见G₀/G₁期细胞占总的73.8%，峰位于横座标的81.6；G₂/M期占3.1%，峰位于横座标的154.1，S期占22.7%；G₂/G₁为1.887；峰的变异系数为2.3%。图3C可见G₀/G₁期细胞占总的74.1%，峰位于横座标的81.7；G₂/M期占3.0%，峰位于横座标的155.5，S期占22.9%；G₂/G₁为1.902；峰的变异系数为2.4%。3组细胞周期分析未见明显差异。

2.3 短期全身毒性实验结果

临床毒性体征及动物行为观察：各组小鼠一般情况良好，活动自如，步态正常，未表现出中枢神经系统兴奋或抑制现象。进食如常，毛发、呼吸等无异常，未有稀便或便结情况。实验结束，脱颈处死动物，病理解剖宏观观察动物心、肺、消化道、肝、脾、胰、肾、肾上腺、生殖腺等重要脏器，未见充血、出血、水肿等明显病理性变化。

各组小鼠实验前后体质量变化，见表3。

数据经统计学处理，TiO₂组及TiO₂:C浸提液组小鼠体质量增长与对照组比较差异均无显著性意义(F=0.56，P=0.575)。表明小鼠连续灌服纳米TiO₂及TiO₂:C浸提液7 d未见对小鼠生长发育有影响。

组织学观察：对照组、TiO₂组及TiO₂:C组小鼠心、肝、脾、肺和肾的组织学切片在显微镜下均未出现变性、萎缩、坏死等病理变化。

2.4 口腔黏膜刺激实验结果

大体观察：处死仓鼠后，实验组和对照组试样固定良好，未脱落。与两组材料接触的颊黏膜表面及其周围无充血、糜烂、肿胀及溃疡反应等。

组织学观察：两组的组织学切片见图4。

动物按病理反应分级情况见表4。

实验材料组织切片均显示与之接触的颊黏膜上皮连续性完好，上皮细胞形态正常，无溃疡、糜烂，细胞层次清楚，排列均匀。皮下组织疏松，腺体形态规则，细胞排列整齐，结缔组织中仅有个别切片有少量炎症细胞浸润，无水肿。这些均与对照组的组织学表现相似，两组病理反应评分均相同，各有1侧病理反应评分为轻度外，其余均为0级。

设计：材料生物相容性实验。
时间及地点：于2009年6月至2010年6月在中山大学口腔医学研究所、广东省口腔医学重点实验室完成。
材料：
实验动物：6-8周龄健康BALB/C小白鼠60只，雌雄各半，体质量(22.6±2.6) g；成年雌性新西兰大白兔2只，体质量约2.5 kg；约2月龄雌性金黄色仓地鼠10只，同一品系，双侧口腔颊囊黏膜健康，无病变；均由中山大学动物实验中心提供。
实验试件：400 ℃下制备的纳米TiO₂薄膜涂层钛片及0.20% TiO2:C纳米涂层钛片试件经无水乙醇超声洗涤15 min，去离子水冲洗3次，121 ℃高压灭菌20 min备用；详细步骤见前期研究^[2-3]。
试剂和细胞株：
Reagents and cell lines：

实验方法：
溶血实验：从健康成年新西兰大白兔耳缘静脉抽取20 mL的新鲜全血，加入1 mL 2%草酸钾抗凝剂，然后加入生理盐水，调整生理盐水的用量，使0.2 mL稀释后的抗凝兔血在10 mL蒸馏水中于540 nm处的吸光度值为0.48。将TiO₂薄膜涂层钛片、TiO₂:C薄膜涂层钛片分别浸泡在 10 mL生理盐水的试管中，并设置阳性对照组(蒸馏水)和阴性对照组(生理盐水)，每组12支试管，置于37 ℃恒温水浴箱中30 min。每个试管加0.2 mL稀释兔血缓慢混合，再放入37 ℃恒温水浴箱60 min。将所有试管置入离心机中离心5 min(2 500 r/min)，分别吸取各试管上清液，分光光度计测定波长545 nm 的吸光度值(A)，每组6支试管的均值为该组的吸光度值。按以下公式计算溶血率：溶血 率=(A_t-A_nc)/(A_pc-A_nc)×100%；式中A_t为实验组的吸光度，A_nc为阴性对照的吸光度，A_pc为阳性对照的吸光度值。结果判断标准：若材料的溶血率小于或等于5%，可认为材料无溶血作用，否则有溶血作用。
细胞毒性实验：
TiO2薄膜涂层钛片、TiO₂:C薄膜涂层钛片浸提液的制备：使用无菌操作技术，以DMEM+含体积分数10%小牛血清为浸提介质，置于37 ℃恒温箱中72 h。浸提液采用R=3 cm²/mL比率，R为试样浸提液量与表面积的比率。
细胞接种、培养：将对数生长期的L929细胞用培养基配制成1×10⁸ L^-1细胞悬液，分注于96孔塑料培养皿内，分TiO₂组、TiO₂:C组与阴性对照组培养，每组设8 孔，置于37 ℃、体积分数5%CO₂的细胞培养箱内，培养基为DMEM+含体积分数10%小牛血清。24 h后弃去原培养基，PBS洗涤2次。实验组和阴性对照组分别加入100 μL TiO₂:C薄膜涂层钛片或TiO₂薄膜涂层钛片浸提液和未放试样的空白培养基继续培养2，4，6 d。①细胞形态观察：于培养第4天取1块培养板，在倒置相差显微镜下观察活细胞形态并摄影。②MTT测定及细胞相对增殖度计算：弃去培养皿内的浸提液和培养液，每孔加入20 μL MTT液(5 g/L)，培养6 h。吸取原液，每孔加150 μL DMSO，置于振荡器上10 min。酶联免疫检测仪测定各孔在570 nm 处的光吸收值，按以下公式计算细胞相对增殖率：细胞相对增殖度=实验孔A值/阴性对照孔A值。③荧光染色分辨细胞死亡情况：于培养第4天选用PI进行荧光标记，由于PI不能进入完整的活细胞膜，因此一般认为PI染色阳性的细胞是死亡细胞。标记染色后，死细胞则被PI染成红色。将待测细胞悬液与 1 mL，40 nmol/L的PI溶液混合后，设定在37 ℃，在培养箱中培养15min，荧光显微镜下观测。④细胞周期分析：收集的L929细胞悬液用PBS洗2次，再用体积分数70%冷乙醇在-20 ℃下固定过夜。用PBS洗涤细胞2次，加入RNase A(10 g/L in 1 mol/L Trisc1，pH 7.4)37 ℃处理1 h。随后加入PI(650 mg/L)对细胞进行染色。室温放置1 h后，上流式细胞仪检测，应用Cellquest软件获取数据，Modfit软件分析细胞周期。
短期全身毒性实验：将60只BALB/C小白鼠随机分成TiO₂组、TiO₂:C组和对照组，每组20只，实验前24 h内禁食，不禁水。然后按15 mL/kg剂量分别灌胃给予TiO₂浸提液、TiO₂:C浸提液和生理盐水，1次/d，连续7 d，常规饲料饲养14 d，观察动物行为。临床观察：毒性体征包括运动功能减退、呼吸困难、腹泻、眼睑下垂、震颤、虚脱及其他毒性症状或死亡，按程度严重分为无、轻、中、重度及死亡。每只动物取上述症状中最重者，按临床毒性体征分级^[5]。2周后处死动物，病理解剖，宏观观察动物心脏、肝脏、肾脏组织变化。组织学观察：麻醉、处死、解剖动物，大体观察动物心脏、肺、消化道、肝、脾、胰、肾、肾上腺、生殖系统等重要脏器有无充血、出血、水肿或其他变化。同时进行常规石蜡标本制备与组织学切片苏木精-伊红观察。
口腔黏膜刺激实验：
试样制备：将0.20% TiO2:C纳米薄膜涂层钛片切割成直径5.0-6.0 mm圆片。对照组为10个同样规格的口腔用牙胶圆片。将所有薄膜涂层钛片及牙胶圆片在中央制备4个等距离、直径1 mm的圆孔，以便缝线穿通。试件经无水乙醇超声洗涤15 min，去离子水冲洗3次，干燥备用。
实验步骤：腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉仓鼠，按无菌要求对小鼠口腔内外进行清洁消毒。左右侧随机选择，分别将纳米TiO₂:C薄膜涂层钛片(实验组)及牙胶(对照组)缝合固定于仓鼠两侧颊囊的黏膜上，缝线贯通黏膜全层达皮肤并固定于皮肤上，将试件与黏膜紧密贴在合，以无压迫且不影响进食为准。
实验观察：缝合后2周内，每天观察动物的活动情况及口腔内接触处黏膜的变化，观察圆片周围黏膜有无色泽异常、充血、糜烂、肿胀等现象。反应程度分为无、轻、中及重度。
组织学观察：术后喂养14 d后处死仓鼠，取与试样接触部位的颊囊部全层组织，体积分数10%甲醛固定，常规石蜡包埋，连续切片，苏木精-伊红染色。按照国标YY/T0268-2001中标准对每只动物的病理反应评分并进行病理反应分级。
主要观察指标：纳米TiO₂:C薄膜涂层的生物相容性。
统计学分析：计量资料结果采用x(_)±s表示，均数比较采用t 检验和方差分析。应用统计分析软件SAS 8.1进行统计分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

1  实验选取了溶血实验、细胞毒性实验、短期全身毒性实验(经口途径)和口腔黏膜刺激试验4项生物学实验对前期制备的纳米TiO₂:C薄膜涂层进行生物相容性检测，为其今后在临床的安全使用提供实验依据。

2  溶血实验、细胞毒性实验、短期全身毒性实验及口腔黏膜刺激实验结果显示，纳米TiO₂:C薄膜涂层具有良好的生物安全性。

本实验采用向胃内直接注射给药，不仅方法简单，而且保证了给药剂量，能够将宏观观察与微观观察结合起来，准确评价材料的毒性。实验过程中各小鼠一般情况良好，无重度临床毒性体征或死亡，实验结果有效，且实验动物临床毒性体征分级都是无症状。2周后处死动物，大体观察动物心、肺、肝、脾、胰、肾等重要脏器均未出现异常变化，组织学观察对照组、TiO₂组及TiO₂:C组小鼠心、肝、脾、肺和肾的组织学切片未出现变性、萎缩、坏死等病理变化，TiO₂:C组小鼠的组织学切片与对照组一样也未见异常。表明TiO₂:C浸提液对小鼠产生的影响与生理盐水无差异，无短期全身毒性。

本实验证实TiO₂:C纳米涂层与对照牙胶的口腔黏膜刺激实验表现相似，两组病理反应评分均为相同，各仅有1侧病理反应评分为轻度外，其余均为0级。根据国标YY/T0268-2001的病理反应分级标准，可以认为TiO₂:C纳米涂层对仓鼠口腔黏膜无刺激性，预期其与口腔黏膜组织长期接触将不会出现不良反应，具有良好的生物安全性。