RhoA/ROCK信号通路在异常应力下关节软骨中的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.02.009

摘要/Abstract

摘要：

背景：RhoA/ROCK信号通路在活体内关节软骨退变或者骨性关节炎的病理过程中是否发挥着作用，为此设计了该实验。
目的：探索RhoA/ROCK信号通路在软骨退变过程中的作用。
方法：采用家兔右膝关节伸直位制动模型，对制动2，4，6 周及对照组家兔的右膝关节胫骨平台负重面全层软骨进行苏木精-伊红染色、番红O染色及RhoA、ROCK免疫组织化学染色，比较制动前后软骨组织学、病理积分及RhoA、ROCK表达变化情况。
结果与结论：随着制动时间的延长，关节软骨退变程度逐渐加重，Mankin评分逐渐增加，且各组评分之间差异有显著性意义(P < 0.05)。免疫组织化学提示RhoA、ROCK表达变化主要集中在切线层及中间层软骨，且二者在关节软骨退变过程中表达变化趋势一致，均为先增多后减少。结果表明，在关节软骨退变过程中，RhoA/ROCK信号通路表达先递增后逐渐降低，RhoA/ROCK信号通路在异常应力所致的关节软骨退变过程中发挥了效应。

关键词: 组织构建, 软骨组织构建, 异常应力, 关节软骨, RhoA, ROCK, 免疫组织化学, 制动, 组织构建图片文章

Abstract:

BACKGROUND: In order to confirm whether RhoA/ROCK transduction pathway play an active role in in vivo articular cartilage degeneration or osteoarthritis, we designed this experiment.
OBJECTIVE: To explore the role of the RhoA/ROCK transduction pathway in the process of articular cartilage degeneration.
METHODS: Totally 36 New Zealand white rabbits were randomly divided into a control and 2-, 4- and 6-week immobilization groups, and the right hindlimbs of rabbits were immobilized with plaster bandage in extension position except those in the control group. The articular cartilage of the lateral tibial plateau was harvested for hematoxylin-eosin staining and immunohistochemistry to observe the pathological changes and the content of RhoA and ROCK.
RESULTS AND CONCLUSION: The articular cartilage degenerated with time prolonged, and the Mankin scores showed there were significant differences among groups (P < 0.05). Immunohistochemical results showed that the RhoA/ROCK transduction pathway was motivated mainly in the tangent layer and the middle layer of the cartilage and inhibited with immobilization time prolonged. The RhoA/ROCK transduction pathway takes an important role in the process of articular cartilage degeneration.

Key words: tissue construction, cartilage tissue construction, abnormal stress, articular cartilage, RhoA, ROCK, immunohistochemistry, immobilization, tissue construction photographs-containing paper

中图分类号:

R318

张海翔，王宸. RhoA/ROCK信号通路在异常应力下关节软骨中的表达[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(2): 235-240.

Zhang Hai-xiang, Wang Chen. Variation of RhoA/ROCK transduction pathway in the articular cartilages under abnormal stress[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(2): 235-240.

图/表（结果） 5

2.1 普通光学显微镜观察对照组软骨表面光滑，层次由浅至深分为浅层、移行层、深层、钙化层，软骨细胞呈柱状排列，结构清晰可辨，潮线完整、未见簇集，见图1a；番红O染色均匀或轻染见图1b。制动2周组：软骨细胞散在肥大，软骨表层不平整，无裂隙，偶见少量簇集的软骨细胞，但软骨层次尚清晰，见图1c；番红O染色见切线层和移行层中上部略有失染，见图1d。

图1 对照组和制动2周组兔软骨组织病理学改变(×100)
Figure 1 Pathological changes of rabbit cartilages in the control and 2-wk immobilization groups (×100)

制动4周组：关节软骨表面欠光滑，软骨表层纤维化，出现裂隙，少量软骨细胞出现固缩，形成陷窝，细胞排列紊乱，潮线不规则，有血管翳通过，簇集细胞出现频率增加，见图2a；番红O染色细胞间区中等染色，见图2b。制动6周组：软骨变薄，粗糙、表面出现大量裂隙，有部分纤维化，切线层大部分缺失，移行层受损，软骨细胞大量簇聚，毛细血管侵入软骨下骨和钙化层并突破潮线。基质染色大部分层次失染，见图2c。番红O染色细胞间区变浅甚至失染，见图2d。

图2 制动4周和制动6周组兔软骨组织病理学改变 (×100)
Figure 2 Pathological changes of rabbit cartilages in the 4- and 6-wk immobilization groups (×100)

各组Mankin评分详见表1。

2.2 免疫组织化学染色结果比较RhoA及ROCK免疫组织化学染色，发现二者软骨分布层次相似，但染色深度不同。
对照组：RhoA及ROCK阳性染色分布于深层软骨层，呈淡褐色，切线层及中间层基本不着色，见图3a，b。
制动2周：深层软骨层阳性染色均匀，略深于对照组，切线层及中间层可见散在阳性染色软骨细胞，其中以切线层阳性细胞染色最明显，见图3c，d。

图3 对照组和制动2周组兔软骨组织RhoA及ROCK表达(免疫组织化学染色，×100)

Figure 3 Expression of RhoA and ROCK in the control and 2-wk immobilization groups (Immunohistochemistry staining, ×100)

制动4周：深层软骨细胞阳性染色略深于制动2周组，切线层及中间层细胞阳性染色细胞制动两组明显增多，染色深于深层软骨染色，见图4a，b；
制动6周：深层软骨细胞阳性染色略浅于制动4周，切线层及中间层软骨细胞阳性染色，浅于制动4周及制动2周，见图4c，d。
统计学结果：与对照组相比，制动2周及4周组软骨RhoA及ROCK染色表达明显增加，其中制动4周组软骨RhoA及ROCK的表达高于制动2周，而制动6周的软骨RhoA及ROCK的表达低于制动4周及制动2周。RhoA、ROCK免疫组织化学阳性染色的吸光度值详见表1。

图4 制动4周和制动6周组兔软骨组织RhOA及ROCK表达(免疫组织化学染色，×100)
Figure 4 Expression of RhoA and ROCK in the 4- and 6-wk immobilization groups (Immunohistochemistry staining, ×100)

参考文献

[1] Durrant LA, Archer CW, Benjamin M,et al. Organisation of the chondrocyte cytoskeleton and its response to changing mechanical conditions in organ culture. J Anat.1999;194 (Pt 3):343-353.

[2] Langelier E, Suetterlin R, Hoemann CD, et al. The Chondrocyte Cytoskeleton in Mature Articular Cartilage: Structure and Distribution of Actin, Tubulin, and Vimentin Filaments. J Histochem Cytochem.2000;48(10):1307-1320.

[3] Pritzker KP, Gay S, Jimenez SA, et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Osteoarthritis Cartilage. 2006 ,14(1):13-29.

[4] Woods A, Wang G, Beier F. Regulation of chondrocyte differentiation by the actin cytoskeleton and adhesive interactions. J Cell Physiol.2007;213(1): 1-8.

[5] Liang J, Feng J, Wu WK，et al. Leptin-Mediated Cytoskeletal Remodeling in Chondrocytes Occurs Via the RhoA/ROCK Pathway. J Orthop Res. 2011;29(3):369-374.

[6] Xu K,Ma XL,Zhang Y,et al.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(46):8559-8562.许可,马信龙,张园,等.异常应力条件下关节软骨的变化[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(46):8559-8562.

[7] Mankin HJ,Dorfman H,Lippiello L,et al. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. J Bone Joint Surg Am. 1971;53(3):523-537.

[8] Qiu GX,Wang GS.Zhonghua Guke Zazhi. 1987;25(3): 175-177. 邱贵兴,王桂生.兔膝关节制动引起关节软骨退变的实验研究[J].中华骨科杂志,1987, 25(3):175-177.

[9] Chen CW,Wei XC,Yang ZQ,et al.Zhonghua Fengshibingxue Zazhi. 2003;7(6): 332-335. 陈崇伟,卫小春,杨自权,等.伸膝制动骨关节炎动物模型软骨内胶原变化的观察[J].中华风湿病学杂志,2003,7(6): 332-335.

[10] Appleton CT, Usmani SE, Mort JS, et al. Rho/ROCK and MEK/ERK activation by transforming growth factor-alpha induces articular cartilagedegradation. Lab Invest. 2010;90(1): 20-30.

[11] Haudenschild DR, Chen J,Pang N, et al. Rho Kinase-Dependent Activation of SOX9 in Chondrocytes. Arthritis Rheum.2010;62(1):191-200.

[12] Kumar D , Lassar AB. The Transcriptional Activity of Sox9 in Chondrocytes Is Regulated by RhoA Signaling and Actin Polymerization. Mol Cell Biol.2009;29(15):4262-4273.

[13] Novakofski K, Boehm A, Fortier L.The Small GTPase Rho Mediates Articular Chondrocyte Phenotype and Morphology in Response to Interleukin-1a and Insulin-Like Growth Factor-I. J Orthop Res. 2009;27(1):58-64.

[14] Koyano Y, Kawamoto T, Kikuchi A, et al. Chondrocyte-derived ezrin-like domain containing protein (CDEP), a rho guanine nucleotide exchange factor, is inducible in chondrocytes by parathyroid hormone and cyclic AMP and has transforming activity in NIH3T3 cells. Osteoarthritis Cartilage. 2001;9 Suppl A:S64-8

[15] Church V, Nohno T, Linker C,et al. Wnt regulation of chondrocyte differentiation. J Cell Sci. 2002;115(Pt 24): 4809-4818.

[16] Haudenschild DR, Chen J,Pang N, et al. Rho Kinase-Dependent Activation of SOX9 in Chondrocytes. Arthritis Rheum.2010;62(1):191-200.

[17] Haudenschild DR, Nguyen B, Chen J,et al. Rho-Dependent CCL20 Induced by Dynamic Compression of Human Chondrocytes. Arthritis Rheum.2008;58(9):2735-2742.

[18] Sanz-Ramos P, Mora G, Ripalda-Cemboráin P,et al. Identification of signalling pathways triggered by changes in the mechanical environment in rat chondrocytes. Osteoarthritis Cartilage. 2012;20(8):931-939.

[19] Gill KS, Beier F, Goldberg HA. Rho-ROCK signaling differentially regulates chondrocyte spreading on fibronectin and bone sialoprotein. Am J Physiol Cell Physiol. 2008;295(1): C38-49.

[20] Clark EA, King WG, Brugge JS,et al.Integrin-mediated Signals Regulated by Members of the Rho Family of GTPases. J Cell Biol. 1998;142(2):573-86.

[21] Tominaga T, Barber DL.Na–H Exchange Acts Downstream of RhoA to Regulate Integrin-induced Cell Adhesion and Spreading. Mol Biol Cell. 1998;9(8):2287-2303.

[22] Uehata M, Ishizaki T, Satoh H,et al. Calciumsensitization of smooth musclemediated by a Rho-associated protein kinase in hypertension. Nature. 1997;389(6654):990-994.

[23] Wang G, Woods A, Sabari S, et al. RhoA/ROCK Signaling Suppresses Hypertrophic Chondrocyte Differentiation. J Biol Chem. 2004;279(13):13205-13214.

[24] Matsumoto E, Furumatsu T, Kanazawa T, et al.ROCK inhibitor prevents the dedifferentiation of human articular chondrocytes. Biochem Biophys Res Commun.2012;420(1):124-129

[25] Takeshita N, Yoshimi E, Hatori C, et al. Alleviating Effects of AS1892802, a Rho Kinase Inhibitor,on Osteoarthritic Disorders in Rodents. J Pharmacol Sci. 2011;115(4):481-489.

引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2011年9月在东南大学临床医学院外科实验室完成。

材料：清洁级健康雄性新西兰大白兔36只，江苏省农业科学院提供，兔龄12个月，体质量(2.5±0.2) kg。

实验方法：

动物模型及分组：将36只白兔随机分为4组：对照组12只，制动2，4，6周组，每组8只。动物模型的制备采用右后肢伸直位石膏固定法^[6]，全部动物右后肢为实验侧。制动过程中，发现石膏被家兔啃噬破损，立即予更换石膏。

标本制备：对照组动物随实验进度每次处死4只，取右侧胫骨平台全层软骨作为对照，制动2，4，6周组分别在相应时间点取右侧胫骨平台外侧负重面全层软骨(4 mm×4 mm，带有少量软骨下骨)，去除周围软组织后，体积分数4%中性甲醛溶液固定48 h，15%乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙8周，石蜡包埋，连续切片，分别作：苏木精-伊红、番红O染色，置于光镜下对其组织结构进行详细的观察。每张切片选取10个不同高倍视野，按Mankin等^[7]评分法评分。

RhoA及ROCKII免疫组织化学：采用SP免疫组织化学检测方法。切片脱蜡后，梯度乙醇水化，PBS洗涤3次，柠檬酸盐抗原修复缓冲液抗原修复，体积分数3%H₂O₂-甲醇溶液处理切片，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗。加入一抗100 μL，37 ℃，湿盒孵育2 h。PBS清洗3次。加入增强剂50 μL，室温湿盒孵育20 min。PBS清洗3次。加入辣根过氧化物酶标记二抗50 μL，室温37 ℃，孵育30 min。PBS清洗5次。DAB显色，自来水充分冲洗，复染，封固。应用Image-Pro Plus 6.0专业图片分析软件分析，每张切片随机采集10个高倍镜视野进行测定，对阳性染色的吸光度值进行定量分析。

主要观察指标：兔制动前后软骨组织学、病理积分及RhoA、ROCK表达变化。

统计学分析：实验结果以x(_)±s表示，采用SPSS 17.0统计学软件进行分析，各组间比较采用q 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

动物的关节机械制动一段时间后，局部无论是否施以外加压力，关节软骨均可出现与临床骨性关节炎相似的退行性改变。邱贵兴等[8]利用兔伸膝石膏制动模型，观察制动1-12周后关节软骨的变化，发现短于4 d的制动，即具有一定的病理累计效应，无论短期的反复制动或是持续制动，若制动时间超过30 d，则可至关节软骨进行性破坏，制动五六周，关节软骨大面积丧失，大量骨赘形成，骨性关节炎病变发展到中到重度。其原因可能主要是制动后关节囊和肌肉挛缩使关节负重面承载加大[9]，内部磨损加剧，使软骨造成破坏。

许可等[4]通过兔伸膝制动模型，发现制动2周关节软骨出现Ⅱ型胶原分泌旺盛，表示关节软骨出现异常分泌功能亢进等早期主动修复现象，制动4周时，软骨细胞破坏已开始向深层进展，软骨细胞代偿性分泌Ⅱ型胶原增加。制动6周，Ⅱ型胶原分泌却较前明显减弱，提示随着损伤突破切线层，软骨破坏速度加快，出现失代偿情况。陈崇伟等[9]也得到类似结论。

本次实验同样采取伸膝位石膏固定制动制造骨性关节炎动物模型，发现RhoA及ROCK染色变化趋势一致，提示在关节软骨退变中，RhoA/ROCK信号通路发挥着重要作用。随着制动过程的开始，RhoA/ROCK信号通路表达逐渐增强，关节软骨病理积分逐渐增加，但至制动6周时，发现RhoA/ROCK信号通路表达却逐渐受到抑制。结合许可等[6]及陈崇伟等[9]有关关节制动时Ⅱ型胶原分泌的实验结果，作者发现RhoA/ROCK信号通路表达活性与关节软骨Ⅱ型胶原变化趋势一致，都是先增加后减少，提示RhoA/ROCK信号通路参与了关节软骨早期的修复、代偿及失代偿过程。其可能机制为：

第一、多种细胞因子可能作为RhoA/ROCK信号通路的上游效应分子在关节软骨细胞退变过程中起着重要作用。转化生长因子α是一种常见的可使关节软骨退变的细胞因子，在骨性关节炎或类风湿性关节炎患者关节滑膜或滑液中可见大量表达。Appleton等[10]将转化生长因子α与软骨细胞一同培养，发现软骨细胞形态成纤维细胞样改变，RhoA、ROCK表达上调，RhoA/ROCK信号通路被激活，软骨细胞骨架重组，大量应力纤维生成，基质分解加速，Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖、Sox9等软骨特征性表达明显降低，应用RhoA抑制剂C3毒素转移酶(toxin C3 transferase)或ROCK抑制剂Y27632均明显抑制软骨肥大及基质的降解，增加Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖及Sox9的表达。RhoA/ROCK信号通路调控软骨细胞Sox9的具体机制尚不清楚，可能是通过直接磷酸化Sox9或增加Sox9蛋白核内聚集来改变Sox9的活性，并且转化生长因子β可以促进上述过程[11-12]。Novakofski等[13]将细胞因子白细胞介素1α与软骨细胞培养，亦得出相似结论，而胰岛素样生长因子Ⅰ则抑制软骨细胞的退变，RhoA/ROCK信号通路表达下调。值得注意的是，在应用ROCK抑制剂Y27632时，软骨细胞内基质金属蛋白酶却显著增加，而基质金属蛋白酶是导致软骨细胞退变的重要因子，可能RhoA/ROCK信号通路同时激活了基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)或其他可以激活基质金属蛋白酶的小分子。其他细胞因子也可能通过Rho/ROCK信号通路产生相应的生物学效应,如甲状旁腺相关蛋白(PTHrp)可以诱导鸟苷酸交换因子家族成员CDEP的生成[14]，后者可以激活RhoA，且PTHrp自身也可以直接激活RhoA，调控软骨生成过程。Wnt家族参与控制软骨细胞的增殖与分化[15]，如Wnt5b可以促进软骨细胞的增殖，也可能通过RhoA/Rock信号通路实现其生物学效应。Liang等[5]发现瘦素可以激活软骨细胞的RhoA/ROCK通路，改变细胞骨架，增加应力纤维表达，致关节软骨细胞退变，导致骨性关节炎的发生。

第二、异常的应力负荷也可能通过RhoA/ROCK信号通路启动关节软骨早期的退变过程[16]。Haudenschild等[17]对关节软骨细胞施加一定频率的机械符合，发现软骨细胞形态的改变及相应基因表达的变化(CCL20 和 iNOS)是通过RhoA/ROCK通路实现的。Sanz-Ramos等[18]发现，关节软骨对外界应力产生应答时，RhoA基因表达增加，提示RhoA参与了软骨细胞对力学信号的转导。

第三、RhoA/ROCK信号通路可通过改变其下游效应分子致关节软骨的退变。Gill等[19]发现Rho/ROCK信号通路抑制软骨细胞与骨涎蛋白的黏附，进而抑制软骨细胞与细胞外基质的接触，影响细胞的生理功能。也有研究发现，RhoA/ROCK信号通路可以调节胞膜整合素的表达，调节外界信号向细胞内的传导[20]，这也可能为关节软骨退变的机制之一。此外RhoA/ROCK信号通路还可以调节软骨细胞钠-氢的交换或调节细胞对钙离子的敏感性来改变软骨细胞的活性[21-22]。

第四、RhoA/ROCK信号通路在软骨增殖及分化中也起着重要作用[23]，可能是通过调节软骨细胞重要转录因子SOX9发生的。软骨细胞体外培养常发生去分化(dedifferentiation)现象，软骨细胞形态由圆形逐渐变为梭形，逐渐丢失软骨细胞特征性表型，软骨细胞特征性表达基因如SOX9 和COL2A表达下降，研究发现，在软骨去分化过程中，RhoA/ROCK信号通路表达上调，应用 ROCK抑制剂可以阻止软骨细胞的去分化过程[24]。

值得注意的是，Takeshita等[25]通过向大鼠关节内注射单碘酸醋盐制造大鼠骨性关节炎模型，退变关节软骨ROCK表达明显增加。实验中向造模膝关节注射不同剂量的ROCK抑制剂AS1892802，关节软骨退变程度明显降低，ROCK表达亦明显下降，且降低程度与AS1892802的药物呈剂量依赖性。有趣的是，AS1892802不仅延缓关节软骨细胞退变，还能抑制关节滑膜分泌缓激肽，降低缓激肽引起的炎性反应，后者正是临床上骨性关节炎疼痛的原因之一。
总之，实验显示，RhoA/ROCK信号通路在家兔膝关节制动所致关节软骨退变的过程中，软骨退变早期及中期时表达增加，而软骨退变后期表达逐渐下降，提示RhoA/ROCK信号通路可能参与了活体早期关节软骨退变过程，将外界异常信号(如异常应力、各种细胞因子等)传递给胞内，从而改变细胞的生理功能，但其中具体的效应分子尚未被确定。RhoA或ROCK抑制剂可阻断软骨细胞内该信号通路的转导，从而延缓软骨细胞的退变过程，但其是否能延缓关节软骨退变尚需进一步证实。