2.1  骨髓间充质干细胞的鉴定  间充质干细胞来源于中胚层，是具有多向分化潜能的成体干细胞之一， 骨髓间充质干细胞作为理想的种子细胞来源之一被更多的用于临床研究，因此，间充质干细胞的鉴定便成了目前必须解决的问题。

目前认为，间充质干细胞虽然有许多阳性细胞表面标志，如：表达SH2、SH3、ASMA、MAB1470、CD13、CD29、CD49、CD44、CDl66、CD59，不表达pan- cytokeratin、cytokera-tin19、Factor VIII、CD4、CD31、CD45和CD34等分子。但有关骨髓间充质干细胞的特异性表面标记物尚未得出明确的结论，即目前没有特定的某一种表面标记物能作为鉴定骨髓间充质干细胞的“金标准”。基于此曾有学者提出采用定向分化的方法来鉴定间充质干细胞是相对接近金标准的方法[3]，但也有学者认为骨髓间充质干细胞缺乏特异性的表面或胞质内抗原，可从3方面对其进行检测[4]：细胞形态和培养特性；细胞标记分子；多种分化潜能。

2.1.1  细胞形态和培养特性  骨髓细胞接种于塑料培养瓶后，细胞在培养瓶散在分布，骨髓间充质干细胞形态较为均一，呈大圆形，单核；培养24 h后部分细胞开始贴壁生长；培养48-72 h贴壁细胞明显增多，72 h后首次全量换液去除未贴壁细胞，此时贴壁的细胞为单个，形态大部分以圆形和短梭形为主；早期分离培养时，发现其形状呈成纤维细胞样而称其为CFU-F(纤维样细胞集落形成单位)或骨髓基质成纤维细胞。传至第3代时细胞增殖迅速，几乎全部贴壁生长，以长梭形为主，体积小，核浆比大，呈明显同向性改变，漩涡状盘旋排列，可形成均匀的集落。第1次换液后5-7 d可见由几十个到数百个细胞组成的集落，细胞形态呈梭形、三角形或星形。原代细胞培养10 d左右，细胞快速增殖，每个集落中的细胞不断增殖呈“漩涡状”，培养2周左右，每个小集落形成约数百致上千个细胞的大集落，集落交界处出现重叠、融合，生长曲线呈S形，细胞倍增时间随代次增加而延长[5]。随着研究的深入，人们发现CFU-F对骨髓血系细胞起支持诱导作用，又因其来自于骨髓基质，因而称其为骨髓基质细胞。近年来研究发现其在不同的诱导条件下，具有向中胚层组织细胞分化的能力，如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞等分化的能力，故又称其为间充质干细胞、间充质祖细胞[6]。基于此，在以后的很长一段时间里，人们都是通过2个标准来检测所得到的细胞是否为间充质干细胞的[7]：一是在体外培养条件下能产生CFU-F，表明分离到的贴壁细胞有自我复制和更新的能力，二是形成的CFU-F应该具备在体外适当条件下或者移植到体内后向多种间质细胞分化的能力。

2.1.2  细胞标记分子  根据国际细胞治疗学会对间充质干细胞的定义[8]，间充质干细胞应表达CD44、CD105，不表达CD14、CD34。荧光抗体染色法检测结果显示，所培养细胞的抗原CD44[9]及CD105[10]有阳性表达，CD14及CD34阴性表达。CD44属于细胞黏着分子，参与细胞之间及细胞与基质的作用，这些抗原在造血干细胞并不表达，因此用来证明培养的细胞是非造血干细胞[11]。CD105是转化生长因子β受体复合物之一，对转化生长因子β具有调节作用，主要是抑制转化生长因子β的生物学效应，在骨髓中造血干细胞不表达CD105。CD14是一种单核细胞、巨噬细胞、中性多形核粒细胞表面上的糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白，是脂多糖在细胞膜上的一种受体[12]，属于细胞表面糖蛋白家族成员之一，在机体免疫、防御系统引起的一系列反应中介导细胞识别脂多糖并引起细胞酪氨酸磷酸化、核因子κB转位，触发细胞因子释放和氧自由基产生。研究发现人间充质干细胞的碱性磷酸酶、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原、骨桥蛋白阴性[13-14]；不表达脂多糖受体CD14、CD34、白细胞表面抗原CD45、vW因子和HLA-DR等造血干细胞的表面标记；但表达SH2、SH3，CD29、CD44，CD71，CD90、CDl05、CD106、CD120a、CD166和多种表面蛋白，尤其是CD105、CD166已初步作为人间充质干细胞的特征性标志[15-16]。

一般认为细胞呈类纤维细胞形态、培养可以贴壁分裂增生具有表面CD44、CD29的细胞，而不表达CD34、CD45等阴性标记物，可初步判断为间充质干细胞[17-23]。赵春生等[24]用流式细胞分析显示，此类细胞稳定地表达相关的抗原标记CD29与CD44，而不表达造血细胞系的表面标记CD34。

在干细胞抗原标志鉴定中用于免疫荧光染色实验的抗体为：Oct-3/4多克隆抗体、Vimentin单克隆抗体、Flt-1多克隆抗体及E-cadhefin多克隆抗体(Santa Cruz) [25]；Nestin多克隆抗体(Chemicon)、Musashi 1多克隆抗体(Abcam)，TRA-1-60与TRA-1-81单克隆抗体(Chemicon)；SSEA-1、SSEA-3及SSEA-4单克隆抗体(Chemicon)；CD-9单克隆抗体(Santa Cruz)。细胞消化收集后，加入对小鼠抗人特异性抗原后在4 ℃下培养1 h。用于流式细胞分析的FITC特异性单抗：CD9、CD13、CD19、CD29、CD34、CD44、CD45、CD46、CD49系列、CD51、CD56、CD59、CD90、CD105、CD106、CD117、CD133、CD166(Immunotech)；抗HLA I及HLAII(Ancell)。HBSS+洗涤后加入Alexa Flour 488羊抗兔或抗鼠的二抗(Invitrogen)，在4 ℃下培养30 min，PBS洗涤3次后EPICS ALTRA进行染色细胞分析。

2.1.3  多种分化潜能  近年来大量研究发现间充质干细胞的多分化潜能不仅局限于胚胎中胚层，在适当的条件下还可以分化为神经外胚层[26-27]、内胚层的终末分化细胞[28]，多分化的潜能得到了进一步的认识，因此，关于它们的应用研究人们做了大量的工作。

2.2  骨髓造血干细胞的鉴定

2.2.1  造血干细胞的表面标记  迄今为止，真正的造血干细胞表型尚难以确定，其原因可能在于这些造血干细胞是最为原始的细胞，大多抗原为阴性表达；同时，造血干细胞的数量极为稀少，难以分离到足够的造血干细胞进行研究[29]。在小鼠的造血干细胞上不存在T细胞、B细胞、单核系、粒系及幼红系等的分化抗原，如Mac-1、CD4、CD8、TER119等，这些抗原可作为小鼠造血干细胞的阴性标志，而T细胞相关抗原Thy-1在小鼠造血干细胞有弱表达，现已将Thy-1弱阳性做为小鼠造血干细胞的标志。此外，也常以干细胞因子的受体c-kit等作为小鼠造血干细胞的阳性标志。小鼠的造血干细胞与人不同，常不表达或微弱表达CD34抗原。

而在人类，通过异种移植等大量研究已经证实，CD34阳性细胞群具有长期造血重建能力，推测绝大部分造血干细胞应为CD34阳性。由于CD34抗原在造血祖细胞上也有表达，故常以一些在干细胞为阴性表达的抗原，如HLA-DR、CD38、CD33等，对CD34阳性细胞群进行再分类，以识别出其中的造血干细胞。虽然不是所有的造血细胞的表面都带有CD34抗原，但是在实验研究和临床血液移植中，人们往往把CD34抗原作为为鉴定和分离人干/祖细胞的重要标志[30]。CD34抗原是一种整合的膜糖蛋白，其相对分子质量为90 000-120 000，可能与细胞间黏着及造血相关基因的表达有关。Gao等[31]将人类CD34+细胞和CD34-细胞作了比较，认为前者的结节性黑素瘤/重度联合免疫缺陷病鼠移植潜能比后者高出100倍以上，也在一定程度上说明了以CD34抗原作为判别依据的可行性。有报道认为，CD45RO，c-kit等也可作为造血干细胞的阳性标志。

目前，普遍认为人造血干细胞的表型为CD34+、CD38-Lin-、HLA-、DR-、Thy-1+、c-kit+、LFA-1-、CD45RA-、CD71-、Rhodull，这可能是人类认识到的最为早期的造血干细胞。不过，近年也有报道认为，CD34阴性细胞可能为更为原始的造血干细胞，因此在CD34-细胞群中也发现具有重建长期造血能力的细胞，因此，人类真正造血干细胞的表型在目前阶段尚无定论。

2.2.2  造血干细胞的检测方法 

脾克隆形成法：该方法是人类认识造血干细胞最早的方法，主要用于评估小鼠的造血干细胞。将小鼠的骨髓或脾细胞注射到经放射线照射过的小鼠体内，通过观察CFU-S的数量和种类来推知造血干细胞。这种方法不能用于测量人类造血干细胞，仅适合于有关小鼠造血调控的实验研究。

外克隆形成法：将细胞注入到半固体培养基中，在一定条件下培养一段时间后，根据克隆形成的数量、克隆细胞的构成来分析克隆的起源和克隆形成细胞的性质，即称为体外克隆形成方法。向培养基中加入各种造血生长因子，不论在人还是在小鼠均可培养出含有各类血液细胞的混合集落(CFU-MIX、CFU-GEMM)，常常以其数量代表造血干细胞。但现在认为，形成混合集落的细胞大部分为多潜能造血祖细胞而不是造血干细胞。造血干细胞移植时常用CFU-GM计数作为植入干细胞的一个标准，它代表的是粒-单祖细胞的数量。因此，现将它作为造血祖细胞的一种检测方法。

2.2.3  造血干细胞的流式细胞测量法  流式细胞测量术具有快速、准确、能够大量处理细胞等优点，结合荧光标记的单克隆抗体，可以对造血细胞群中的 干/祖细胞进行较为理想的识别及分选。但如前所述，在造血细胞的特征表型未确定之前，难以通过表面标记识别及分选真正的造血干细胞。临床上常以CD34阳性做为造血干/祖细胞的标记。

[1] Majumdar MK,Tiede MA,Mosca JD,et al.Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchyInal stem cells(MSCs)and stromal cells.J Cell Physiol.1998;176(1):57-66. [2] 高福来,韩明子,金世柱,等.骨髓干细胞分离技术的探讨[J].胃肠病学和肝病学杂志,2010,19(6):569-572. [3] Gang EJ,Hong SH,Jeong JA,et al.In vitro mesengenic potential of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells.Biochem Biophys Res Commun. 2004;321(1):102. [4] 裴雪涛.干细胞生物学[M].北京:科学出版社,2003:220-221. [5] 李正章,程应樟.人骨髓及脐血间充质干细胞的分离培养及鉴定[J].心血管病学进展,2008,29(S1):97-98. [6] Minguell J,Erices A,Conget P.Mesenchymal stem cells.Exp Biol Med(Maywood),2001;226(6):507-520. [7] Phinney DG.Building a consensus regarding the nature and origin of mesenchymal stem cells.J Cell Biochem Suppl. 2002;38:7-12. [8] Dominici M,Le Blanc K,Mueller I,et al.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy.2006;8(4):315-317. [9] Hung SC,Chen NJ,Hsieh SL,et al.Isolation and characterization of size-sieved stem cells from human bone marrow.Stem Cells.2002;20(3):249-258. [10] Delorme B,Charbord P.Culture and characterization of human bone marrow mesenchymal stem cells.Methods Mol Med. 2007;140:67-81. [11] Djalilian AR,Holland EJ,Schwartz GS.Limbal stem cell deficiency. Ophthalmology.2003;110(10):2071. [12] Vitiyakosol S,Kirkland TN.A region of human CD14 required for lipopolysaccharide binding.J Biol Chem.1995;270(1): 361-368. [13] Majumdar MK,Keane-More M,Buyaner D,et al. Characterization and functionality of cell surface molecules on human mesenchymal stem cells.J Biomed Sci.2003;10: 228-241. [14] Wagner W,Wein F,Seckinger A,et al.Comparative characteristics of mesenchymal stem cells from human bone marrow,adipose tissue,and umbilical cord blood.Exp Hematol. 2005;33(11):1402-1416. [15] Rogers I,Yamanaka N,Bielecki R,et al.Identification and analysis of in vitro cultured CD45-positive cells capable of multi-lineage differentiation.Exp Cell Res.2007;313: 1839-1852. [16] Deng ZS,Zhang X,Zou DQ,et al.Senior effect of drynaria rhizome for human bone marrow mesenchymal stem cells.China J Modern Med.2005;15(16):2426-2429. [17] Rebelatto CK,Aguiar AM,Moretao,et al.Dissimilar differentiation of mesenchymaI stem cells from bone marrow,umbillicaI cord blood,and adipose tissue.Exp Biol Med (Maywood).2008;233(7):901-913. [18] Reinisch A,Bartmann C,Rohde E,et aI.Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application.Regen Med.2007;2(4): 371-382. [19] Martin-Rendon E,Sweeney D,Lu F,et al.5-Azacytidine-treated human mesenchymal stem/progenit cells derived from umbilical cord,cord blood and bone marrow do not generate cardiomyocytes in vitro at high frequencies.Vox Sang.2008; 95(2):137-148. [20] Markov V,Kusumi K,Tadesse MG,et al.Identification of cord blood-derived mesenchymal stem/stromal cell populations with distinct growth kinetics,diffrerentiation potentials,and gene expression profiles.Stem Cell Dev.2007;16(1):53-73. [21] Manca MF,Zwart I,Beo J,et al.Characterization of mesenchymal stromal cells derived from full-term umbilical cord blood.Cytotherapy.2008;10(1):54-68. [22] Secco M,Zucconi E,Vieira NM,et al.Multipotent stem cells from umbilical cord:cord is richer than blood.Stem Cells. 2008;26(1):146-150. [23] Barachini S,Trombi L,Danti S,et aI.Morpho-functional characterization of human mesenchymal stem cells from umbilical cord blood for potential uses in regenerative medicine.Stem cells Dev.2009;18(2):293-305. [24] 赵春生,王更银,李俊峡.人脐血间充质干细胞体外分离培养条件的优化及其鉴定[J].中国组织工程研究与临床康复,2009, 13(27): 5326-5330. [25] 朴正福,张海燕,丁淑芹,等.人羊膜间充质干细胞的生物学特性鉴定[J].国际生物医学工程杂志,2010,33(3):157-162. [26] Lei Z,Yongda L,Jun M,et al.Culture and neural differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells in vitro.Cell Biol Int.2007;31(9):916-923. [27] Shiota M.Heike T,Haruyama M,et al.Isolation and characterization of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells with myogenic and neuronal properties.Exp Cell Res.2007;313(5):1008-1023. [28] Popov BV,Serikov VB,Petrov NS,et al.Lung epithelial cells induce endodermal differentiation in mouse mesenchymal bone marrow stem cells by paracrine mechanism.Tissue Eng.2007;13(10):2441-2450. [29] 陈智超.造血干细胞的生物学特征及其鉴定[J].临床内科杂志, 2000,17(6):325-327. [30] Grzaiano A,d’ Aquino R,Laino G,et al.Human CD34+stem cells produce bone nodules in vivoCell Prolif.2008;41(1):1-11. [31] Gao Z,Fackler JM,Leung W,et al.Human CD34+cell preparations contain over 100-fold greater NOD/SCID mouse engrafting capacity than do CD34  cell preparations.Exp Hematol.2001;29(7):910-921.

[1]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴 浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[2]	梁学奇, 郭黎姣, 陈贺捷, 武 杰, 孙雅琪, 邢稚坤, 邹海亮, 陈雪玲, 吴向未. 泡状棘球绦虫原头蚴抑制骨髓间充质干细胞向成纤维细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 996-1001.
[3]	耿 瑶, 尹志良, 李兴平, 肖东琴, 侯伟光. hsa-miRNA-223-3p调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1008-1013.
[4]	伦志刚, 金 晶, 王添艳, 李爱民. 过氧化物还原酶6干预骨髓间充质干细胞增殖及体外向神经谱系诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1014-1018.
[5]	朱雪芬, 黄 成, 丁 健, 戴永平, 刘元兵, 乐礼祥, 王亮亮, 杨建东. 胶质细胞神经营养因子诱导骨髓间充质干细胞向功能性神经元分化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1019-1025.
[6]	裴丽丽, 孙贵才, 王 弟. 丹酚酸B抑制骨髓间充质干细胞氧化损伤及促进分化为心肌样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1032-1036.
[7]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[8]	陈俊毅, 王 宁, 彭称飞, 朱伦井, 段江涛, 王 烨, 贝朝涌. 脱钙骨基质与慢病毒介导沉默P75神经营养因子受体转染骨髓间充质干细胞构建组织工程骨[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 510-515.
[9]	姜 涛, 马 磊, 李志强, 寿 玺, 段明军, 吴 硕, 马 创, 魏 琴. 血小板衍生生长因子BB诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3937-3942.
[10]	莫剑玲, 何少茹, 冯博文, 简敏桥, 张晓晖, 刘财盛, 梁一晶, 刘玉梅, 陈 亮, 周海榆, 刘艳辉. 构建预血管化细胞膜片及血管形成相关因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3479-3486.
[11]	魏 琴, 张 雪, 马 磊, 李志强, 寿 玺, 段明军, 吴 硕, 贾麒钰, 马 创. 血小板衍生生长因子BB诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 2953-2957.
[12]	郭志斌, 吴春芳, 刘子洪, 张钰英, 迟博婧, 王 宝, 马 超, 张国彬, 田发明. 辛伐他汀可刺激骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 2963-2968.
[13]	李聪聪, 姚 楠, 黄丹娥, 宋 敏, 彭 莎, 李安安, 卢 超, 刘文刚. 人髌下脂肪垫干细胞的鉴定及成软骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 2976-2981.
[14]	曹 阳, 张军平, 彭 立, 丁 义, 李光辉. 兔主动脉内皮细胞的分离培养及生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 3000-3003.
[15]	李祥泽, 卜宪敏, 李冬梅, 池玉磊, 苏 强, 靳欣桐, 赵 键, 张高天, 吴 彬, 孟纯阳. 创伤性脑外伤促进骨折愈合中的干细胞、细胞因子、激素、神经肽及基因[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 3057-3063.

干细胞的研究越来越受到人们关注，由于它是一种具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，可分化为多种功能细胞，所以细胞学、组织学及器官学的专家们都将目光转向干细胞的研究。现在干细胞研究已成为生命科学的一个主攻热点。骨髓干细胞主要分为两大类，一类以CD34阳性为代表的骨髓造血干细胞，另一类是以CD34阴性为主的骨髓间充质干细胞[1]。此外还包括基质细胞、血管细胞、脂肪细胞、成骨细胞、破骨细胞等细胞成分，由于骨髓细胞的组成种类多，成分复杂，尽管可以采用特殊的的分离技术如密度梯度离心法、贴壁筛选法、免疫磁珠法、流式细胞仪分离法可达到一定的分离目的[2]，但由于实验中通常需要特定的干细胞，所以就有必要对分离的细胞做进一步的鉴定，本文将对分离后干细胞的鉴定技术做一综述。

1.1  资料来源 

检索人相关内容：第一作者。

检索时间范围：1998年1月至2010年12月。

检索词：英文检索词为“Bone marrow stem cell，bone marrow hematopoietic stem cells ，Identification”；中文检索词为“骨髓干细胞；骨髓造血干细胞；骨髓间充质干细胞；鉴定”。

检索数据库：Pubmed 数据库，网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/；维普数据库，网址：http://www.cqvip.com/。  

检索文献量：共检索到65篇文献。

1.2  检索方法

纳入标准：①与骨髓间充质干细胞鉴定有关的文献。②与骨髓造血干细胞鉴定有关的文献。

排除标准：与研究目的无关及重复的文献。

质量评估：检索的文献主要为基础研究。文献[3-4]主要叙述了骨髓间充质干细胞的鉴定方面的内容；文献[5-7]主要探讨了细胞形态和培养特性；文献[8-28]主要探讨了细胞标记分子和多种分化潜能；文献[29-31]主要探讨了骨髓造血干细胞的鉴定相关内容，包括造血干细胞的表面标记及检测方法。

鉴于目前干细胞研究的广泛性及重要性，有必要对干细胞做进一步的分离和鉴定，分离是基础，鉴定是关键，这样才能保证实验细胞的单一性。综上所述，虽然目前干细胞的鉴定有多种方法，但至今尚未形成统一的认识标准。干细胞的特异标记性抗原还需进一步探究，干细胞的鉴定技术有更广阔的空间有待去开拓，这都需要做更深层次的研究。因此，建议要根据自己的实验目的及条件等因素综合考虑，选择合适的鉴定技术及方法，以便取得更好的效果达到实验目的。

目前没有特定的某一种表面标记物能作为鉴定骨髓间充质干细胞的“金标准”，可从细胞形态和培养特性、细胞标记分子、多种分化潜能3方面进行检测。目前真正的造血干细胞表型尚难以确定。造血干细胞的检测主要方法有脾克隆形成法、外克隆形成法及流式细胞测量法等。

采用密度梯度离心法、贴壁筛选法、免疫磁珠法、流式细胞仪分离法可达到一定的干细胞分离目的。目前没有特定的某一种表面标记物能作为鉴定BMSCs的“金标准”；真正的造血干细胞表型尚难以确定。

	阅读次数
	全文
	摘要