低氧诱导因子1α与骨形态发生蛋白6协同过表达骨髓间充质干细胞在低氧环境下的成骨和成血管效应

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1701

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (17): 2644-2650.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1701

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

低氧诱导因子1α与骨形态发生蛋白6协同过表达骨髓间充质干细胞在低氧环境下的成骨和成血管效应

廖红兴¹，张志辉¹，刘展亮¹，黄健¹，谌业光¹，黄映梅¹，钟志雄²

梅州市人民医院，¹骨科中心，²胸痛中心，广东省梅州市 514000

修回日期:2019-01-17 出版日期:2019-06-18 发布日期:2019-06-18
通讯作者: 张志辉，硕士，医师，梅州市人民医院骨科中心，广东省梅州市 514000
作者简介:廖红兴，男，1985年生，广东省梅州市人，汉族，2012年中山大学医学院毕业，博士，副主任医师，主要从事骨科生物材料研究。
基金资助:
广东省自然科学基金(2014A030307006)，项目负责人：廖红兴；广东省医学科学技术研究基金项目(A2017306)，项目负责人：廖红兴；广东省梅州市社会发展科技计划项目(2017B023)，项目负责人：廖红兴

Osteogenic and angiogenic ability of bone marrow mesenchymal stem cells synergistically over-expressing hypoxia-inducible factor-1α and bone morphogenetic protein-6 genes under hypoxia

Liao Hongxing¹, Zhang Zhihui¹, Liu Zhanliang¹, Huang Jian¹, Shen Yeguang¹, Huang Yingmei¹, Zhong Zhixiong²

¹Department of Orthopedics, ²Chest Pain Center, Meizhou People’s Hospital, Meizhou 514000, Guangdong Province, China

Revised:2019-01-17 Online:2019-06-18 Published:2019-06-18
Contact: Zhang Zhihui, Master, Physician, Department of Orthopedics, Meizhou People’s Hospital, Meizhou 514000, Guangdong Province, China
About author:Liao Hongxing, MD, Associate chief physician, Department of Orthopedics, Meizhou People’s Hospital, Meizhou 514000, Guangdong Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Guangdong Province, China, No. 2014A030307006 (to LHX); the Medical Scientific Research Foundation of Guangdong Province, No. A2017306 (to LHX); the Social Development Science and Technology Plan Project of Meizhou, Guangdong Province, No. 2017B023 (to LHX)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
低氧诱导因子1α：广泛存在于哺乳动物细胞中，只有在低氧条件下才能稳定表达，是组织细胞低氧状态转录的调节因子，在心血管、骨骼和神经胚等都有表达，在细胞生长、增殖、迁移和凋亡等生理病理过程中起着关键作用。
骨形态发生蛋白：属于转化生长因子β超家族，在胚胎发育和出生后动物的细胞功能中起重要作用，能够诱导间充质细胞分化为骨、软骨、韧带、肌腱和神经组织，在出生后骨形成中也起着关键作用。

摘要
背景：目前认为低氧诱导因子1α是维持机体细胞内氧稳态的最重要调控因子之一，骨形态发生蛋白6是成骨活性最强的骨形态发生蛋白之一，实验拟构建二者共表达的骨髓间充质干细胞系，以研究细胞在低氧状态下的耐受及功能受益问题。
目的：探讨体外模拟低氧环境下低氧诱导因子1α和骨形态发生蛋白6协同过表达骨髓间充质干细胞的成骨和成血管生物学特性。
方法：分离培养鉴定SD大鼠骨髓间充质干细胞，将已构建好的携带有骨形态发生蛋白6和低氧诱导因子1α双基因的腺病毒真核表达载体共同感染骨髓间充质干细胞，在体积分数为21% O₂，2%O₂条件下分别进行培养，并以常氧状态下未转染的骨髓间充质干细胞作为对照组，RT-qPCR检测各组细胞HIF-1α、VEGF、BMP-6、GLUT-1、SIRT-1、OCN、RUNX2、AKP的mRNA水平。各组骨髓间充质干细胞与人脐静脉内皮细胞共培养后，观察体外小管形成能力；各组骨髓间充质干细胞经成骨诱导培养基干预后，碱性磷酸酶染色及茜素红染色鉴定成骨效果。
结果与结论：①流式细胞仪检测结果显示第4代骨髓间充质干细胞高表达CD29、CD90、CD44，低表达CD45、CD11、CD34；②低氧组骨髓间充质干细胞VEGF、GLUT-1、SIRT-1、OCN、RUNX2、AKP mRNA表达水平高于常氧组(P < 0.01)；③低氧组小管形成数量要明显高于对照组，差异有非常显著性意义(P < 0.01)；④低氧组细胞出现更多的钙结节及圆形矿化结节；⑤上述结果表明，低氧诱导因子1α与骨形态发生蛋白6协同过表达骨髓间充质干细胞在体外低氧环境下具有更强的血管生成及成骨分化能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-2952-6447(张志辉)

关键词: 骨髓间充质干细胞, 低氧诱导因子1α, 骨形态发生蛋白6, 低氧, 成骨能力, 成血管能力, 广东省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) is currently considered to be one of the most important regulators of oxygen homeostasis in the body. Bone morphogenetic protein-6 (BMP-6) is one of the most osteogenic bone morphogenetic proteins. In this study we attempted to construct bone marrow mesenchymal stem cell (BMSC) lines co-expressing HIF-1α and BMP-6 to explore the tolerance and functional benefit of the cells under hypoxic conditions.
OBJECTIVE: To investigate the proangiogenic and osteogenic ability of BMSCs synergistically over-expressing HIF-1α and BMP-6 under hypoxic environment in vitro.
METHODS: BMSCs were isolated, cultured and identified from Sprague-Dawley rats. BMSCs co-overexpressing HIF-1α and BMP-6 were constructed by adeno-associated viral vector. aav-HIF-1α-BMP-6-BMSCs were cultured under normoxia (21% O₂) and hypoxia (2% O₂), and non-transfected BMSCs under normoxia were used as a control group. mRNA levels of HIF-1α, VEGF, BMP-6, GLUT-1, SIRT-1, OCN, RUNX2, AKP were detected by RT-qPCR. After co-culture of BMSCs and human umbilical vein endothelial cells, the in vitro tube formation ability was observed. After osteogenic induction, alkaline phosphatase staining and alizarin red staining were used to identify the osteogenic effect of the cells.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Flow cytometry results showed that BMSCs at passage 4 highly expressed CD29, CD90 and CD44, but lowly expressed CD45, CD11 and CD34. (2) The expression levels of VEGF, GLUT-1, SIRT-1, OCN, RUNX2, and AKP mRNA in the hypoxia group were significantly higher than those in the normoxia group (P < 0.01). (3) In vitro tube formation assay results showed that the number of tubules formed in the hypoxia group was significantly higher than that in the normoxia group (P < 0.01). (4) More calcium nodules and round mineralized nodules appeared in the hypoxia group than in the normoxia group. These findings suggest that BMSCs co-expressing HIF-1α and BMP-6 can promote the osteogenic and angiogenic ability under hypoxia in vitro.

Key words: bone marrow mesenchymal stem cells, hypoxia-inducible factor-1α, bone morphogenetic protein-6, hypoxia, osteogenic ability, angiogenic ability, Natural Science Foundation of Guangdong Province

中图分类号:

廖红兴，张志辉，刘展亮，黄健，谌业光，黄映梅，钟志雄. 低氧诱导因子1α与骨形态发生蛋白6协同过表达骨髓间充质干细胞在低氧环境下的成骨和成血管效应[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(17): 2644-2650.

Liao Hongxing, Zhang Zhihui, Liu Zhanliang, Huang Jian, Shen Yeguang, Huang Yingmei, Zhong Zhixiong. Osteogenic and angiogenic ability of bone marrow mesenchymal stem cells synergistically over-expressing hypoxia-inducible factor-1α and bone morphogenetic protein-6 genes under hypoxia[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(17): 2644-2650.

图/表（结果） 1

2.1 骨髓间充质干细胞鉴定结果 流式细胞仪检测结果显示第4代骨髓间充质干细胞CD29、CD90、CD44、CD45、CD11、CD34阳性率分别为98.2%，99.1%，98.9%，1.26%，1.57%，1.91%，见图1。细胞高表达CD29、CD90、CD44，低表达CD45、CD11、CD34，表明实验所分离培养的细胞为间充质干细胞而非造血干细胞。

2.2 RT-qPCR检测转染后骨髓间充质干细胞中低氧诱导因子1α和骨形态发生蛋白6的表达 AAV-HIF-1α组低氧诱导因子1α mRNA表达水平均高于AAV-GFP组，差异有显著性意义(P < 0.05)，AAV-HIF-1α-BMP-6组HIF-1α mRNA表达水平更高，明显高于AAV-GFP组(P < 0.01)；AAV-BMP-6组骨形态发生蛋白6 mRNA表达水平均高于AAV-GFP组，差异有显著性意义(P < 0.05)，AAV-HIF-1α-BMP-6组骨形态发生蛋白6 mRNA表达水平更高，明显高于AAV-GFP组(P < 0.01)，见图2。结果表明重组AAV-HIF-1α-BMP-6转染骨髓间充质干细胞对于外源基因的表达具有协同作用。

2.3 RT-qPCR检测不同氧张力下骨髓间充质干细胞中成骨和成血管相关基因的表达 常氧组细胞中VEGF、GLUT-1、SIRT-1、OCN、RUNX2、AKP mRNA的表达水平高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；低氧组细胞中VEGF、GLUT-1、SIRT-1、OCN、RUNX2、AKP mRNA表达水平更高，差异有非常显著性意义(P < 0.01)，见图3。体外低氧培养后重组AAV-HIF-1α-BMP-6-BMSCs可以促进VEGF、GLUT-1、SIRT-1、OCN、RUNX2、AKP等成骨和成血管相关基因的表达。

2.4 体外小管形成实验结果 重组骨髓间充质干细胞在常氧及低氧状态下与人脐静脉上皮细胞共培养12 h后，检测小管形成能力。结果发现，常氧组的小管形成数量为(14.0±3.6)/视野，显著高于对照组(7.67±2.08)/视野，差异有显著性意义(P < 0.05)；低氧组小管形成数量为(23.0±3.0)/视野，非常显著高于对照组，差异有非常显著性意义(P < 0.01)，见图4。结果表明低氧状态下培养的重组AAV-HIF-1α-BMP-6转染骨髓间充质干细胞具有更强的体外血管生成能力。

2.5 体外成骨实验结果 茜素红染色结果显示，与对照组比较，常氧组和低氧组有较多的钙结节，其中低氧组钙结节最多，细胞呈集落生长，细胞间产生致密的不透光区域，大块片状红染区形成，细胞表现明显的成骨活性。碱性磷酸酶染色结果显示，低氧组比常氧组出现更多的圆形矿化结节，表现为强阳性，见图5。

茜素红染色及碱性磷酸酶染色提示低氧环境下培养的重组AAV-HIF-1α-BMP-6转染骨髓间充质干细胞表现出更强的体外成骨矿化能力。

参考文献

[1] Bougioukli S, Sugiyama O, Pannell W, et al. Gene Therapy for Bone Repair Using Human Cells: Superior Osteogenic Potential of Bone Morphogenetic Protein 2-Transduced Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue Compared to Bone Marrow. Hum Gene Ther. 2018;29(4): 507-519.

[2] Bornes TD, Adesida AB, Jomha NM. Articular Cartilage Repair with Mesenchymal Stem Cells After Chondrogenic Priming: A Pilot Study. Tissue Eng Part A. 2018;24(9-10): 761-774.

[3] Wang W, Wang Y, Deng G, et al. Transplantation of Hypoxic-Preconditioned Bone Mesenchymal Stem Cells Retards Intervertebral Disc Degeneration via Enhancing Implanted Cell Survival and Migration in Rats. Stem Cells Int. 2018;2018:7564159.

[4] Böhrnsen F, Schliephake H. Supportive angiogenic and osteogenic differentiation of mesenchymal stromal cells and endothelial cells in monolayer and co-cultures. Int J Oral Sci. 2016;8(4):223-230.

[5] Liao H, Zhong Z, Liu Z, et al. Bone mesenchymal stem cells co-expressing VEGF and BMP-6 genes to combat avascular necrosis of the femoral head. Exp Ther Med. 2018;15(1): 954-962.

[6] Muinos-López E, Ripalda-Cemboráin P, López-Martínez T, et al. Hypoxia and Reactive Oxygen Species Homeostasis in Mesenchymal Progenitor Cells Define a Molecular Mechanism for Fracture Nonunion. Stem Cells. 2016;34(9): 2342-2353.

[7] Cox TR, Erler JT, Rumney RMH. Established Models and New Paradigms for Hypoxia-Driven Cancer-Associated Bone Disease. Calcif Tissue Int. 2018;102(2):163-173.

[8] Stegen S, Deprez S, Eelen G, et al. Adequate hypoxia inducible factor 1α signaling is indispensable for bone regeneration. Bone. 2016;87:176-186.

[9] Semenza GL. Hydroxylation of HIF-1: oxygen sensing at the molecular level. Physiology (Bethesda). 2004;19:176-182.

[10] Büning H, Perabo L, Coutelle O, et al. Recent developments in adeno-associated virus vector technology. J Gene Med. 2008;10(7):717-733.

[11] Luo G, Huang Y, Gu F. rhBMP2-loaded calcium phosphate cements combined with allogenic bone marrow mesenchymal stem cells for bone formation. Biomed Pharmacother. 2017; 92:536-543.

[12] Westhauser F, Höllig M, Reible B, et al. Bone formation of human mesenchymal stem cells harvested from reaming debris is stimulated by low-dose bone morphogenetic protein-7 application in vivo. J Orthop. 2016;13(4):404-408.

[13] Roth S, Dreixler JC, Mathew B, et al. Hypoxic-Preconditioned Bone Marrow Stem Cell Medium Significantly Improves Outcome After Retinal Ischemia in Rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2016;57(7):3522-3532.

[14] Sharma S, Sapkota D, Xue Y, et al. Delivery of VEGFA in bone marrow stromal cells seeded in copolymer scaffold enhances angiogenesis, but is inadequate for osteogenesis as compared with the dual delivery of VEGFA and BMP2 in a subcutaneous mouse model. Stem Cell Res Ther. 2018;9(1): 23.

[15] Ramasamy SK, Kusumbe AP, Wang L, et al. Endothelial Notch activity promotes angiogenesis and osteogenesis in bone. Nature. 2014;507(7492):376-380.

[16] Gómez-Puerto MC, Verhagen LP, Braat AK, et al. Activation of autophagy by FOXO3 regulates redox homeostasis during osteogenic differentiation. Autophagy. 2016;12(10): 1804-1816.

[17] Liu Y, Yang X, Maureira P, et al. Permanently Hypoxic Cell Culture Yields Rat Bone Marrow Mesenchymal Cells with Higher Therapeutic Potential in the Treatment of Chronic Myocardial Infarction. Cell Physiol Biochem. 2017;44(3): 1064-1077.

[18] Ciapetti G, Granchi D, Fotia C, et al. Effects of hypoxia on osteogenic differentiation of mesenchymal stromal cells used as a cell therapy for avascular necrosis of the femoral head. Cytotherapy. 2016;18(9):1087-1099.

[19] Maes C, Carmeliet G, Schipani E. Hypoxia-driven pathways in bone development, regeneration and disease. Nat Rev Rheumatol. 2012;8(6):358-366.

[20] Wu WJ, Zhang XK, Zheng XF, et al. SHH-dependent knockout of HIF-1 alpha accelerates the degenerative process in mouse intervertebral disc. Int J Immunopathol Pharmacol. 2013;26(3):601-609.

[21] Maxwell P, Salnikow K. HIF-1: an oxygen and metal responsive transcription factor. Cancer Biol Ther. 2004;3(1): 29-35.

[22] 李广周,吴伟.低氧环境对骨代谢影响的研究与进展[J].中国组织工程研究,2016,20(33):4963-4969.

[23] Fan L, Li J, Yu Z, et al. The hypoxia-inducible factor pathway, prolyl hydroxylase domain protein inhibitors, and their roles in bone repair and regeneration. Biomed Res Int. 2014;2014: 239356.

[24] Ma C, Wei Q, Cao B, et al. A multifunctional bioactive material that stimulates osteogenesis and promotes the vascularization bone marrow stem cells and their resistance to bacterial infection. PLoS One. 2017;12(3):e0172499.

[25] Park HS, Kim JH, Sun BK, et al. Hypoxia induces glucose uptake and metabolism of adipose?derived stem cells. Mol Med Rep. 2016;14(5):4706-4714.

[26] Yuan HF, Zhai C, Yan XL, et al. SIRT1 is required for long-term growth of human mesenchymal stem cells. J Mol Med (Berl). 2012;90(4):389-400.

[27] Joo HY, Yun M, Jeong J, et al. SIRT1 deacetylates and stabilizes hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) via direct interactions during hypoxia. Biochem Biophys Res Commun. 2015;462(4):294-300.

[28] Xu Y, Wang S, Tang C, et al. Upregulation of long non-coding RNA HIF 1α-anti-sense 1 induced by transforming growth factor-β-mediated targeting of sirtuin 1 promotes osteoblastic differentiation of human bone marrow stromal cells. Mol Med Rep. 2015;12(5):7233-7238.

[29] Chen MC, Hsu WL, Hwang PA, et al. Low Molecular Weight Fucoidan Inhibits Tumor Angiogenesis through Downregulation of HIF-1/VEGF Signaling under Hypoxia. Mar Drugs. 2015;13(7):4436-4451.

[30] Uccella S, La Rosa S, Scaldaferri D, et al. New insights into hypoxia-related mechanisms involved in different microvascular patterns of bronchopulmonary carcinoids and poorly differentiated neuroendocrine carcinomas. Role of ribonuclease T2 (RNASET2) and HIF-1α. Hum Pathol. 2018; 79:66-76.

[31] Jain T, Nikolopoulou EA, Xu Q, et al. Hypoxia inducible factor as a therapeutic target for atherosclerosis. Pharmacol Ther. 2018;183:22-33.

引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年9月至2018年8月在中山大学第一附属医院骨科研究所完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SPF级SD大鼠10只，4月龄，雌雄各半，体质量100-130 g，由中山大学动物实验中心提供，证书号：SYXK(粤)-2012-0081。

1.3.2 实验试剂 腺相关病毒Helper-Free系统(上海汉恒生物科技有限公司)；AAV-293细胞、人脐静脉上皮细胞(广州永诺生物科技有限公司)；L-DMEM培养基(美国犹他通用电气医疗集团生命科学部)；体积分数为10%胎牛血清(Gibco；美国麻省赛默飞世尔科技有限公司)；Percoll分离溶液(德国默克西格玛公司)；CD90(批号ab225；1∶200；英国剑桥艾博抗公司)、CD29(批号bs-0631R；1∶200；北京博奥森生物技术有限公司)、CD44(批号bs-0521R；1∶200；北京博奥森生物技术有限公司)、CD11(批号bs-2508R；1∶200；北京博奥森生物技术有限公司)、CD45(批号bs-0522R；1∶200；北京博奥森生物技术有限公司)和CD34(批号ab81289；1∶200；英国剑桥艾博抗公司)；TRIzol试剂(Invitrogen；美国麻省赛默飞世尔科技有限公司)；SuperScript^TM Ⅲ反转录酶(Invitrogen；美国麻省赛默飞世尔科技有限公司)；大鼠血管内皮生长因子ELISA试剂盒(批号RRV00；美国明尼苏达州R&D Systems)、大鼠骨形态发生蛋白6ELISA试剂盒(批号MBS704699；美国加利福尼亚MyBiosource公司)；Takara SYBR Green I qPCR试剂盒(日本大津塔卡拉生物公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定 处死SD大鼠后，收集胫骨和股骨的骨髓，用注射器冲打骨髓液，制成单细胞悬液，使用密度梯度离心和贴壁筛选分离骨髓间充质干细胞，即将获得的细胞加入密度为1.073 g/mL的Percoll分离溶液中，在20 ℃条件下以4 000×g离心25 min，去上清液，将细胞沉淀重悬于含体积分数为10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的L-DMEM完全培养基中，并于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱进行培养，利用贴壁筛选纯化骨髓间充质干细胞，孵育7 d并传代，将第4代细胞用于以下实验。

流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面抗原，收集第4代细胞用PBS洗涤2次，然后在含0.5%BSA的1×PBS封闭缓冲液中于4 ℃条件下温育30 min，PBS洗涤，用特异性的抗体进行流式细胞分析，所用抗体为CD90、CD29、CD44、CD11、CD45和CD34，4 ℃孵育30 min，在FACSCanto Ⅱ流式细胞仪上进行检测，数据通过FlowJo软件进行处理，每个表面抗原检测3份。

1.4.2 腺相关病毒载体构建和体外转染 腺相关病毒Helper-Free系统对重组载体进行包装。将内部核糖体进入位点(IRES)片段整合到质粒AAV MCS中，并亚克隆到2个多克隆位点。用Primer Premier 5软件设计低氧诱导因子1α和骨形态发生蛋白6引物，并由生工生物工程股份有限公司(上海)合成，将低氧诱导因子1α和骨形态发生蛋白6分别插入上游和下游MCS位点。双顺反子框架长度为2.5 kb，其在载体容量范围内。获得重组病毒rAAV-HIF-1α-IRES-BMP-6(AAV-HIF-1α-BMP-6)，将载体联合质粒pAAV-helper和pAAV-RC(携带AAV-2复制和衣壳基因)共转染到AAV-293细胞中，添加CaCl₂。转染后72 h收集原始病毒原液，并如文献[10]所述用氯仿/PEG8000方案浓缩并纯化原始病毒原液。测定感染细胞最佳感染复数值，以该最佳感染复数感染骨髓间充质干细胞，获得稳定表达目的蛋白的细胞克隆。将骨髓间充质干细胞(细胞浓度2×10⁸ L^-1)接种到96孔板上，在37 ℃，含体积分数为5%CO₂培养箱中培养30 min，使用lipofectamine 2000将AAV-HIF-1α-BMP-6载体以最佳感染复数转染骨髓间充质干细胞，48 h后收集样品用于后续实验。

1.4.3 RT-qPCR检测转染后骨髓间充质干细胞中低氧诱导因子1α和骨形态发生蛋白6的表达通过细胞转染构建了4组细胞：AAV-GFP-BMSCs、AAV-HIF-1α-BMSCs、AAV-BMP-6-BMSCs、AAV-HIF-1α-BMP-6-BMSCs，RT-qPCR检测重组细胞外源基因的表达。使用TRIzol试剂提取转染48 h的骨髓间充质干细胞总RNA，用SuperScript^TM Ⅲ反转录酶反转录为cDNA。按以下热循环条件，在ABI 7500系统上使用Takara SYBR Green I qPCR试剂盒分析目标基因：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s和72℃ 45 s 35个循环。引物序列见表1。使用2^-ΔΔCt方法计算mRNA表达的相对值。

1.4.4 氧张力设置及实验分组 将转染AAV-HIF-1α-BMP-6病毒的骨髓间充质干细胞分为低氧组及常氧组在培养箱中培养14 d，其中低氧组培养条件为体积分数2%O₂+体积分数5%CO₂+体积分数93%N₂，常氧组培养条件为体积分数21%O₂+体积分数5%CO₂+体积分数74%N₂。另外取未转染的骨髓间充质干细胞在常氧状态下培养作为对照组。按照上述方法采用RT-qPCR检测不同氧张力下骨髓间充质干细胞中VEGF、GLUT-1、SIRT-1、OCN、RUNX2、AKP mRNA的表达，引物序列见表1。

1.4.5 体外血管生成实验 实验分组同1.4.4。将基质胶置于4 ℃过夜融化加入24孔板中，然后放于37 ℃培养箱30 min至基质铺胶均匀，然后用含体积分数为10%胎牛血清的新鲜L-DMEM培养基接种人脐静脉上皮细胞(5×10⁴/孔)，分别取100 μL 3组细胞悬液(已经在相应培养条件下培养14 d)加入到24孔板中，37 ℃培养12 h，在光学显微镜下(×200)从3个随机视野获得小管形成图像，并用Image Pro Plus 6.0进行分析。

1.4.6 体外成骨实验 转染AAV-HIF-1α-BMP-6的骨髓间充质干细胞，接种于含体积分数为10%胎牛血清、20 g/L青霉素-链霉素、100 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、0.05 mmol/L维生素C的L-DMEM培养基中进行成骨诱导，于37 ℃、不同氧张力培养环境下培养14 d(常氧组和低氧组)，隔天更换成骨诱导培养基。通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色检测矿化效果。另外取未转染的骨髓间充质干细胞在常氧状态下成骨诱导作为对照组。

碱性磷酸酶染色：将细胞用PBS洗涤，加入40 g/L多聚甲醛在4 ℃固定过夜，在室温下用碱性磷酸酶溶液染色10 min，光学显微镜下观察矿化结节形成情况。

茜素红染色：在双蒸水中制备茜素红染液并使用10%氢氧化铵将pH值调节至4.1，将细胞在室温下用体积分数为70%乙醇固定10 min，然后用40 mmol/L茜素红染液染色5 min，用含10%乙酸和20%甲醇的蒸馏水洗脱茜素红染液评估钙沉积情况。

1.5 主要观察指标 ①转染后骨髓间充质干细胞中低氧诱导因子1α和骨形态发生蛋白6的相对表达量；②对照组、常氧组、低氧组骨髓间充质干细胞成骨和成血管相关基因的表达；③对照组、常氧组、低氧组骨髓间充质干细胞在体外成骨和成血管情况。

1.6 统计学分析 使用SPSS 19.0软件，用Student’s t 检验和单向方差分析对数据进行分析，随后进行Tukey检验。每个实验重复至少3次，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

干细胞移植在骨折大块骨缺损、早期股骨头坏死、椎间盘变性等骨科领域疾病治疗中的应用是近年来研究的热点问题^[11-12]。基于干细胞移植治疗技术所遇到的一些基本问题尚未完全解决，限制了干细胞移植治疗的发展^[13-15]，这些问题包括：①如何通过改进骨髓间充质干细胞的生物学特性，改善细胞缺血缺氧适应能力，获得干细胞移植治疗所需的细胞数量；②如何维持骨髓间充质干细胞在移植缺血缺氧微环境下的成骨、成血管能力，提高干细胞移植治疗的功能受益。

研究团队在前期的研究工作中，成功构建了血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白6双基因共表达骨髓间充质干细胞系。体内外实验表明：血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白6共表达可促进骨髓间充质干细胞成骨和成血管基因的表达，促进血管生成和骨形成^[5]。双基因共表达系统可以在病灶部位维持较高的细胞因子表达水平，提高干细胞移植的功能受益。干细胞移植后长期处于低氧环境，是否能在病变局部维持有效的细胞数量以及获得所需的功能受益，是干细胞移植治疗成功与否的关键。

在人正常发育过程中存在低氧这一重要的生理因素，同时低氧也参与了疾病的发生发展^[6^，^16]。在骨发育过程中，体内生长板软骨增殖区、肥大区都存在不同程度的缺氧^[17]。机体损伤后，如在股骨头缺血性坏死或骨折血流中断处，由于损伤部位血流中断或血肿形成，造成局部低氧，中央部位低氧程度更明显^[18-19]。椎间盘是人体最大的无血管组织，亦处于一个极端低氧环境^[20]。为进一步研究干细胞在低氧状态下的耐受及功能受益问题，该研究构建了低氧诱导因子1α和骨形态发生蛋白6稳定过表达的骨髓间充质干细胞系，RT-qPCR结果证实，在体外模拟体积分数为2%低氧状态下，AAV-HIF-1α-BMP-6转染骨髓间充质干细胞可以促进VEGF、GLUT-1、SIRT-1、OCN、RUNX2、AKP等成骨和成血管相关基因的表达。

低氧诱导因子1α作为维持机体氧稳态的最重要转录因子之一，广泛参与细胞生理方面的调控，如细胞增殖、分化及生长发育等^[21-22]。血管内皮生长因子是低氧诱导因子1α的重要靶基因，低氧诱导因子1α可上调血管内皮生长因子表达，参与血管生成的各个环节，与细胞低氧状态下的存活密切相关，并且可促进间质干细胞增殖^[23-24]。GLUT1是机体最重要的葡萄糖转运蛋白，几乎存在于人体每一个细胞中，对于维持人的正常生理功能极为重要。在低氧状态下，低氧诱导因子1α通过上调GLUT-1及GLUT-3的表达，增加糖摄取，调节脂肪来源干细胞的增殖^[25]。沉默SIRT在间质干细胞增殖及分化中起重要作用，选择性SIRT1基因敲除的骨髓间质干细胞增殖减缓^[26]。SIRT1能够稳定低氧诱导因子1α的表达，当SIRT1表达缺失或者失活时会使低氧诱导因子1α集聚减少，而SIRT1过表达时可以促进低氧诱导因子1α集聚^[27]。过表达SIRT1可以通过低氧诱导因子1α通路下调HOXD10的表达，进而促进骨髓间充质干细胞分化^[28]。在该研究中，低氧组HIF-1α、VEGF、GLUT-1及SIRT-1的表达高于常氧组，说明低氧可能通过低氧诱导因子1α介导的信号通路，上调VEGF、GLUT-1及SIRT-1的表达，从而实现对干细胞增殖、分化的调节，但仍需进一步的研究来证实其机制。

低氧及低氧诱导因子1α的作用贯穿了血管再生的整个过程，稳定表达低氧诱导因子1α并保持其活性对于血管生成至关重要。低氧诱导因子1α可以通过转录激活一些血管生成相关的基因及其受体(VEGF、PDGFB、ANGPT1和ANGPT2等)，刺激血管生成的级联反应^[29]。低氧诱导因子1α可以调节促血管生成趋化因子SDF-1α、S1P和受体CXCR4、S1PRs，将内皮祖细胞招募至缺氧部位，进一步通过招募血管支持细胞和基底膜的形成，完成血管生成的过程^[30-31]。该研究中AAV-HIF-1α-BMP-6转染骨髓间充质干细胞过表达低氧诱导因子1α，通过上调血管内皮生长因子的表达，促进新生血管形成，同时体外小管形成实验也证实了AAV-HIF-1α-BMP-6转染骨髓间充质干细胞在低氧状态下具有更强的血管生成能力。此外，低氧状态下，低氧诱导因子1α及骨形态发生蛋白6过表达促进了OCN、RUNX2、AKP等成骨相关基因的表达，进一步的体外成骨分化实验结果证实了AAV-HIF-1α-BMP-6转染骨髓间充质干细胞在模拟体积分数为2%低氧环境下具有更强的成骨分化能力。

该研究通过构建低氧诱导因子1α和骨形态发生蛋白6基因共表达的骨髓间充质干细胞，体外实验证明其具有更强的血管生成及成骨分化能力，在低氧状态下具有较强的细胞活力以及增殖分化功能，有效地维持细胞数量和获得相应的成骨和成血管功能受益，为进一步的体内实验提供了实验依据，为临床干细胞移植治疗骨缺损、早期股骨头坏死、椎间盘退变性疾病等提供了新思路，但其具体的作用机制仍需进一步的实验进行验证。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

低氧诱导因子1α与骨形态发生蛋白6协同过表达骨髓间充质干细胞在低氧环境下的成骨和成血管效应

Osteogenic and angiogenic ability of bone marrow mesenchymal stem cells synergistically over-expressing hypoxia-inducible factor-1α and bone morphogenetic protein-6 genes under hypoxia

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 1

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	顾霞, 赵敏, 王平义, 李一梅, 李文华. 低氧诱导因子1α与低氧相关疾病信号通路的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1284-1289.
[2]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[3]	梁学奇, 郭黎姣, 陈贺捷, 武杰, 孙雅琪, 邢稚坤, 邹海亮, 陈雪玲, 吴向未. 泡状棘球绦虫原头蚴抑制骨髓间充质干细胞向成纤维细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 996-1001.
[4]	樊全宝, 罗惠娜, 王丙云, 陈胜锋, 崔连旭, 江文康, 赵明明, 王静静, 罗冬章, 陈志胜, 白银山, 刘璨颖, 张晖. 低氧培养犬脂肪间充质干细胞的生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1002-1007.
[5]	耿瑶, 尹志良, 李兴平, 肖东琴, 侯伟光. hsa-miRNA-223-3p调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1008-1013.
[6]	伦志刚, 金晶, 王添艳, 李爱民. 过氧化物还原酶6干预骨髓间充质干细胞增殖及体外向神经谱系诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1014-1018.
[7]	朱雪芬, 黄成, 丁健, 戴永平, 刘元兵, 乐礼祥, 王亮亮, 杨建东. 胶质细胞神经营养因子诱导骨髓间充质干细胞向功能性神经元分化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1019-1025.
[8]	裴丽丽, 孙贵才, 王弟. 丹酚酸B抑制骨髓间充质干细胞氧化损伤及促进分化为心肌样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1032-1036.
[9]	刘聪, 刘肃. miR-17-5p调控低氧诱导因子1α介导脂肪细胞分化及血管生成的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1069-1074.
[10]	赵敏, 冯柳祥, 陈垚, 顾霞, 王平义, 李一梅, 李文华. 低氧环境下外泌体可作为疾病的标志物[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1104-1108.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	陈俊毅, 王宁, 彭称飞, 朱伦井, 段江涛, 王烨, 贝朝涌. 脱钙骨基质与慢病毒介导沉默P75神经营养因子受体转染骨髓间充质干细胞构建组织工程骨[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 510-515.
[13]	姜涛, 马磊, 李志强, 寿玺, 段明军, 吴硕, 马创, 魏琴. 血小板衍生生长因子BB诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3937-3942.
[14]	孙建威, 杨新明, 张瑛. 孟鲁司特联合骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤模型大鼠[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3962-3969.
[15]	张立书, 刘安琪, 何小宁, 金岩, 李蓓, 金钫. Alpl基因影响骨髓间充质干细胞治疗溃疡性结肠炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3970-3975.