三维培养人多能干细胞的研究与进展

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1700

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (17): 2753-2761.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1700

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三维培养人多能干细胞的研究与进展

秦丽颖¹，张瑞¹，任晓琳¹，韩雨¹，陈浩斐²，周平¹

¹兰州大学口腔医学院，甘肃省兰州市 730000；²兰州大学第一临床医学院，甘肃省兰州市 730000

修回日期:2019-01-11 出版日期:2019-06-18 发布日期:2019-06-18
通讯作者: 张瑞，硕士，讲师，兰州大学口腔医学院，甘肃省兰州市 730000
作者简介:秦丽颖，女，1997年生，甘肃省兰州市人，汉族，兰州大学口腔医学院本科在读，主要从事人诱导多能干细胞干性维持培养研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81801855)，项目负责人：周平；中央高校基本科研业务费专项资金(lzujbky-2015-295)，项目负责人：张瑞；兰州大学国家级大学生创新创业训练计划项目(20180730138)，项目负责人：秦丽颖

Three-dimensional culture of human pluripotent stem cells

Qin Liying¹, Zhang Rui¹, Ren Xiaolin¹, Han Yu¹, Chen Haofei², Zhou Ping¹

¹School of Stomatology, Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China; ²the First Clinical Medical College of Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China

Revised:2019-01-11 Online:2019-06-18 Published:2019-06-18
Contact: Zhang Rui, Master, Lecturer, School of Stomatology, Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China
About author:Qin Liying, School of Stomatology, Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81801855 (to ZP); the Fundamental Research Funds for the Central Universities, No. lzujbky-2015-295 (to ZR); the National Innovation and Entrepreneurship Training Program for College Students in Lanzhou University, No. 20180730138 (to QLY)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
人多能干细胞：是一类具有多向分化潜能的细胞，例如人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞，它们具有体外自我更新和长期分化为人体内所有细胞类型的能力，是多种疾病治疗的首选种子细胞起源，具备良好的细胞治疗前景。
人多能干细胞三维培养：科学家通过研究体内支持人多能干细胞自我更新或分化微环境的组成，分析影响人多能干细胞贴壁、干性维持和分化的关键因素，从而在体外构建支持人多能干细胞自我更新或定向诱导分化的三维培养体系，并进行细胞培养。

摘要
背景：人多能干细胞具有体外长期自我更新和分化为几乎所有体细胞类型的独特潜能，在细胞治疗、再生医学、药物筛选、毒理学测定、疾病建模和立体器官发生等领域有广泛的应用前景。传统体外二维培养方法难以获得大量的细胞，而三维培养技术为人多能干细胞的大规模生产开辟了一条新的途径。
目的：对目前人多能干细胞三维培养的研究进展作一综述。
方法：应用计算机检索PubMed和CNKI数据库2005年1月至今有关人多能干细胞三维培养的文章，英文检索词为“human pluripotent stem cells，three dimension culture，microcarrier，suspension culture，aggregates，hydrogel，microencapsulation，bioreactor system，pluripotency”，中文检索词为“多能干细胞，三维培养”，保留77篇文献进行分析。
结果与结论：细胞聚集体、微载体和水凝胶是目前实验室三维培养多能干细胞的主要形式。与二维培养相比，三维培养可更高效地扩增细胞，提高细胞产量，为人多能干细胞临床应用奠定了良好的基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID:0000-0003-0162-2875(张瑞)

关键词: 人多能干细胞, 三维培养, 细胞聚集体, 微载体, 水凝胶, 生物反应器, 细胞扩增, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Human pluripotent stem cells have the unique potential of long-term self-renewal and differentiation into almost all somatic cell types in vitro, and they are are promising candidates for cell treatment, regenerative medicine, drug screening, toxicology determination, disease modeling and stereo organogenesis. It is difficult using in vitro two-dimensional culture to obtain large quantities of cells, while three-dimensional culture provides a new way for large-scale expansion of human pluripotent stem cells.
OBJECTIVE: To review the current research progress in the three-dimensional culture of human pluripotent stem cells.
METHODS: With the key words of “human pluripotent stem cells, three dimension culture, microcarrier, suspension culture, aggregates, hydrogel, microencapsulation, bioreactor system, pluripotency” in English and “pluripotent stem cells, three dimension culture” in Chinese, we performed a computer-based search in PubMed and CNKI databases respectively for relevant articles published from January 2005 to present. Finally, 77 eligible articles were included in result analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: Currently, three culture modes, aggregates, microcarriers, and hydrogels, are mainly used for the three-dimensional culture of human pluripotent stem cells in the laboratory. Compared with two-dimensional culture, three-dimensional culture can expand cells and increase cell yield more efficiently, which lays a good foundation for the clinical application of human pluripotent stem cells.

Key words: human pluripotent stem cells, three-dimensional culture, cell aggregates, microcarriers, hydrogels, bioreactors, cell expansion, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

秦丽颖，张瑞，任晓琳，韩雨，陈浩斐，周平. 三维培养人多能干细胞的研究与进展[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(17): 2753-2761.

Qin Liying, Zhang Rui, Ren Xiaolin, Han Yu, Chen Haofei, Zhou Ping. Three-dimensional culture of human pluripotent stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(17): 2753-2761.

图/表（结果） 1

2.1 生物反应器系统 三维细胞培养包括静态和动态培养两种方法，Bardy等^[21]发现，当使用Matrigel包被的DE-53微载体静态培养IMR90人诱导多能干细胞7 d，获得了7.7倍扩增和1.3×10⁹ L^-1的细胞产量，而在相同条件下改用旋转瓶培养，则能获得20倍扩增和6.1×10⁹ L^-1的细胞产量。三维培养更倾向于动态培养扩增细胞，除了简单的旋转瓶培养外，还有生物反应器悬浮动态培养。迄今为止，大部分生物反应器系统已被开发用于培养常规哺乳动物细胞系，包括波形生物反应器(也称为“细胞袋”)，袋子主要分为两个区域：一个装满培养基，接种细胞，另一个装满空气，前者不断进行摇动的同时空气通过后者循环以提供必要的氧气交换^[22]。填充/固定/纤维床生物反应器^[23]，通过在底部填充有固定支架/微载体/多孔纤维的空心柱或管将细胞接种在固定床上，同时使用泵连续循环新鲜培养基以获得足够的氧气转移和营养物供应。还有许多其他类型的生物反应器，但在人多能干细胞培养中以旋转壁式生物反应器和搅拌式生物反应器为主^[24-25]。故而在此具体介绍这两种生物反应器。

旋转壁式生物反应器是将细胞及其培养基共同置于2个同轴的内外圆筒之间，沿水平轴连续旋转，在层流条件下产生微重力。通过培养基与细胞和内外圆筒的共同旋转，氧气和营养物质分布更均匀；通过加快旋转速度以减少细胞的沉降。此外，因为没有叶轮的搅拌，很大程度上降低了剪切应力对细胞活性的影响。Gerecht-Nir等^[26]成功使用该系统促进拟胚体的形成。然而，旋转壁反应器的水平旋转限制了反应器体积的扩大，进而限制了其在大规模扩增细胞中的应用，该型生物反应器在人多能干细胞三维培养中应用逐渐减少。

搅拌式生物反应器由外部的玻璃容器和内部的叶轮组成，通过叶轮旋转以提供均匀的生长环境并且抵抗重力沉降，促进所有培养组分的均匀分布，将气体和营养物质转移到细胞聚集体中，并使人多能干细胞受控制的形成聚集，从而促进相对高密度下大规模扩增人多能干细胞^[27-28]。研究发现，随着细胞聚集体直径的扩大，氧气和培养基中的营养物质难以到达细胞聚集体中央，细胞凋亡的数量逐渐增多^[29]。因此，生物反应器系统还配备了用于监控和控制温度、pH值、营养物浓度(如葡萄糖)、代谢物(如乳酸盐、氨)和气体(如O₂和CO₂)等培养环境的技术。Silva等^[30]使用搅拌式生物反应器以细胞聚集体的形式扩增SCED461人胚胎干细胞，100 mL体积内细胞数量达到3.01×10⁸。Serra等^[31]使用300 mL搅拌式生物反应器，在Matrigel包被的Cytodex3^TM微载体上扩增SCED461人胚胎干细胞，可以获得6.78×10⁸细胞。

然而叶轮的搅拌也会对细胞产生不利影响。例如，细胞聚集体培养中常见的细胞死亡，低细胞生长率和低产量^[32]。因此，为了控制人多能干细胞聚集体的形成和促进其进一步生长，搅拌生物反应器中需要优化的参数很多。但是，由生物反应器搅动产生的流体动力学条件(例如流动方向、速度、剪切力和化学环境等)非常复杂，并且不断变化。同时，人多能干细胞对生物反应器叶轮的几何形状、尺寸和位置、容器几何形状和尺寸、搅拌速率等许多因素敏感，目前还没有研究明确这些因素如何影响人多能干细胞活性^[33]。此外，尚不清楚细胞如何对这些复杂的水动力条件作出反应^[34-35]。目前，仅在小鼠多能干细胞中描述了剪切应力对多能性和分化特性的影响^[36-37]。Leung等^[38]发现相同的剪切力对不同细胞系的影响是不同的，在搅拌的旋转瓶中以微载体形式培养人胚胎干细胞，发现与静态培养相比，HES-2细胞系即使在7次传代后也不会影响细胞活力、倍增时间和多能性标记物的表达。然而，HES-3细胞系在1次传代之后，多能标记OCT-4、MAB84和TRA-1-60表达下调。

在使用生物反应器培养人多能干细胞时，最常用的培养方法是重复批次培养，也可称为灌注培养，即每隔一定的时间部分换液(余留部分旧培养基)以提供人多能干细胞扩增所需的生长因子。然而这种培养方式并不能完全去除反应器中的代谢废物，即使缩短至每两小时间隔进行一次培养基更换^[31]。近期开发出了一种新型灌注培养方式，通过将新鲜培养基连续加入生物反应器中，同时以相同的流速连续除去用过的培养基来不断为细胞提供新鲜营养素、生长因子，除去代谢废物，确保反应器中更均匀的条件，被称为循环灌注培养。Wan等^[39]使用该种灌注方法获得了长期的(14-35 d)肿瘤外植体生长。然而这种灌注方式尚未被应用于人多能干细胞的扩增，并且循环灌注同样存在操作复杂、成本较高的缺点和污染的风险。

在大规模灌注过程的情况下培养基消耗较多，而培养基昂贵的生长因子添加将会产生过高的培养成本，Come等^[40]曾将透析膜与灌注式培养相结合，将来有望将循环灌注系统与渗透性薄膜结合，通过膜的分子质量选择性滤出代谢废物，而将人多能干细胞释放的生长因子留在生物反应器中，使人多能干细胞通过其内源因子的分泌自我调节，减少昂贵的生长因子补充。此外，大规模扩增同样需要大体积的生物反应器，相应的叶轮体积也会增大，随之带来的剪切应力也是不能避免的。在未来，这些问题还需要更加深入的分析。

2.2 细胞聚集体 通常在涂布有疏水性和非黏附性材料的多孔板和半固体培养基(例如含有琼脂、琼脂糖或甲基纤维素等的培养基)中使用悬浮法或悬滴法进行细胞聚集体的形成。虽然其不需要附着表面和黏附分子，降低培养成本，但是处理半固体培养基和收获人多能干细胞聚集体并不容易。例如使用悬滴法，一个10 cm的培养皿仅能形成30-40个聚集体^[41]。因此，这种方法下细胞不能够大规模扩增。Carpenedo等^[42]发现使用旋转轨道悬浮培养系统，可以产生较悬滴法尺寸更为均匀的细胞聚集体，并且在7 d后实现了总细胞产量增加4倍。Watanabe等^[43]发现在ROCK抑制剂(Y-27632)存在的情况下，可将单个分散的人多能干细胞直接接种到悬浮生物反应器，从那之后就有报道显示人多能干细胞在搅拌悬浮系统中以聚集体形式扩增。然而，人多能干细胞具有强烈的细胞间相互作用，聚集体常在培养过程中相互融合形成大的细胞团块(即团聚)。团聚导致细胞聚集体大小不均匀，对细胞培养不利甚至影响细胞表型和分化潜能。因此，这种培养方法最大的挑战之一是需要在初始和长期培养过程中控制细胞总量和聚集体直径。

在初始培养阶段调节细胞聚集体大小和形态的方法包括强制聚集和通过使用生物反应器的搅动进行调节。Choi等^[44]发现圆柱形孔或矩形孔有利于产生圆盘形或圆柱形的人胚胎干细胞聚集体，而模拟悬滴液相边缘的凹形培养孔促进均匀球形聚集体的形成。Bauwens等^[45]通过微孔强制聚集的方法限制了细胞聚集体的大小，并通过微孔的大小和数量调节细胞聚集体数目。Abbasalizadeh等^[46]通过使用不同搅拌速率和剪切保护剂浓度的组合，优化生物反应器流体动力学条件，成功获得了特定尺寸的聚集体。Sargen等^[47]发现在25 r/min下，细胞聚集体直径较大且分散，在培养7 d后聚集体大小增加。相比之下，更高的转速(55 r/min)促进形成更小和单分散的聚集体，显示有限的尺寸增加。Lock等^[48]认为45 r/min至60 r/min的转速是最适宜形成尺寸均匀的聚集体。

长期培养过程中控制细胞量的方法主要是进行周期性解离。Xu等^[49]证实使用Accutase添加Rho相关激酶(ROCK)抑制剂Y-27632可以极大地减少与细胞解离方法有关的细胞凋亡。同时发现ROCK抑制剂促进了静电悬浮培养中H9人胚胎干细胞聚集体的形成，使聚集体维持一定直径。Lee等^[50]研究发现使用EDTA或ReLeSR的解离缓冲液将H9人胚胎干细胞聚集体解离成小团块，并在补充有Y-27632的mTESR-1培养基上培养，人胚胎干细胞的存活率比Accutase传代获得的人多能干细胞高六七倍。这些结果表明，简单的团块传代方法在不使用酶或其他补充条件下可显著提高三维悬浮培养过程中人多能干细胞聚集体的扩增效率。然而，由于人多能干细胞对物理应激和单细胞解离的敏感性，将人多能干细胞集落解离成单细胞或小团块进行传代培养会导致相当大的细胞损失。酶解离程序已被报道成为聚集培养物中细胞回收率低的主要原因^[24]，而机械解离技术似乎是一种有效的替代方法。Otsuji等^[51]将细胞聚集体通过50 μm的网状过滤器，可以将较大的聚集体分成较小的团块，显著降低了253G1人多能干细胞的丧失，并在42 d之后达到1.65×10⁷的细胞扩增。最近，Nath等^[52]发现使用肉毒杆菌血凝素(HA)特异性结合E-钙黏蛋白可以破坏Tic人诱导多能干细胞聚集体间的细胞连接，并产生较传统解离方法更高的细胞数量、细胞密度和扩增倍数，最高细胞密度可达到(4.5±0.2)×10⁶。此外，Chen等^[53]通过将重组玻连蛋白修饰的温敏聚合物与Nkx2.5人多能干细胞混合，自发形成胚状体。当胚状体达到细胞因子和营养利用上限时，这些温敏聚合物通过从37 ℃到25 ℃的温度变化促进胚状体分解，使得细胞的循环解离和传代收集成为可能。实验重复该过程3次传代(超过18 d)提供了> 30倍的细胞扩增，为人多能干细胞的聚集体无损循环解离提供了新的研究思路。

但是如同之前所述，将细胞聚集体直接暴露于生物反应器中，其复杂的流体动力学对细胞状态影响的研究尚不清楚，可能是细胞扩增效率不高的主要原因。

2.3 微载体 微载体培养是指将人多能干细胞从培养板表面解离(常使用Accutase或EDTA)之后^[48^，^54]，以单细胞的形式接种在预先处理好的微载体上进行生长的培养方式。微载体技术具有独特的优势，因为它为细胞提供了均一的培养条件，细胞黏附和生长的表面积很大。

目前有两种微载体用于细胞培养：①实心球形或圆盘形颗粒，其中细胞仅附着于微载体表面；②由纤维素或明胶制备的大孔微载体，其允许细胞渗入。市售的大孔微载体(CultiSpher^TM)可使细胞密度提高，并保护细胞免受来自生物反应器的剪切力的影响，虽然成功用于病毒疫苗和重组蛋白生产，但由于难以从大孔微载体内安全收集细胞，目前仅用于鼠胚胎干细胞的扩增^[37]。

市售微载体依据其是否需要细胞外基质涂层分为两大类：一类需要涂覆Matrigel或其他细胞外基质组分，另一类不需要涂覆，通过自身电荷吸引而进行细胞培养。对于未涂覆的微载体可以观察到高的细胞附着效率，然而在连续传代期间细胞逐渐丧失多能性^[18^，^55]。对于涂覆材料的研究多基于二维培养表面^[13]。用Matrigel涂覆微载体，可以至少3次传代并保持多能性^[31]。但是Matrigel成分复杂且不明确，随后有学者研究发现层粘连蛋白、胶原蛋白、重组玻连蛋白等涂覆于微载体表面而进行细胞培养^[18^，^54-56]，与Matrigel相比成分明确，不含异源成分。此外，Fan等^[57]发现使用层粘连蛋白或玻连蛋白衍生的肽涂层可以显著增加H9人胚胎干细胞的附着，与Matrigel涂层相比，成分明确的涂层也引起更快的人胚胎干细胞倍增。同时他们发现，使用重组人血清白蛋白联合紫外照射包被的微载体，显著增强细胞的接种效率和存活率，H9人胚胎干细胞在多次连续传代中每次传代增长(20.5±2.0)倍^[58]。然而，这些蛋白质可能会有批次间变异，除此之外，Lam等^[59]发现常需要预先涂布阳离子聚-1-赖氨酸(PLL)之后涂覆细胞外基质蛋白(特别是层粘连蛋白111)才能确保细胞生长，在多次传代中实现类似Matrigel的细胞倍增。但是后来他们发现，由于人层粘连蛋白52的高亲和力，它可以以单层形式作为聚苯乙烯的涂层，实现高效的细胞黏附、扩增，而无需额外的正电荷^[60]。随着研究进展，已经开发了合成聚合物和多肽修饰人工合成表面，避免了与重组底物生产相关的批次问题和成本过高的缺点，支持二维平面条件下人多能干细胞的扩增^[9-10^，^61]。Badenes等^[30^,^62]开发的合成表面SynthemaxⅡ微载体(Corning)已经成功转化为新型商用微载体，而不需要表面涂层。他们使用合成的肽-丙烯酸酯表面微载体在无血清培养基中长期支持人诱导多能干细胞自我更新，并且在15 d内累计达到241倍扩增，获得3.3×10⁸个细胞，而不需要额外的表面涂层^[63]。现将常用微载体总结在表1中。

对于微载体培养，目前面临的最大问题是细胞在扩增后，人多能干细胞必须保证有效的细胞-微载体分离，并且不会在生存力和功能方面影响细胞质量。虽然这是大规模培养过程的关键步骤，但是这一过程几乎没有进行研究。目前所涉及到的文献，大多使用Accutase酶和细胞过滤器解开细胞与细胞之间及细胞与微载体间的黏附作用。这些都会不同程度降低细胞活力，降低产量^[64]。除此之外，生物反应器搅拌引起的剪切力对细胞是有害的，尤其是对于人多能干细胞的影响机制仍未研究清楚。

2.4 水凝胶 人多能干细胞三维培养的另一种方法是将细胞封装在由天然或合成聚合物制备的微胶囊中。封装的一般程序是形成细胞凝胶液滴之后凝胶交联形成水凝胶微胶囊。海藻酸盐这种不需要化学交联剂、具有生物安全性和渗透性的生物相容性材料，是包封的最常用材料^[65]。水凝胶的包封保护人多能干细胞免受生物反应器系统内部剪切力的影响，并防止过度的细胞聚集，同时通过多孔结构控制细胞和培养环境之间的交换，并允许物理、化学和生物学修饰。

Serra等^[66]评估了以单细胞、细胞聚集体和微载体3种细胞状态进行藻酸盐水凝胶包封后的细胞扩增效果。将微胶囊化的SCED^TM 461人胚胎干细胞在搅拌罐生物反应器中培养，控制藻酸盐水凝胶大小并维持细胞多能性2周，发现以单个人胚胎干细胞的形式包封，7 d后细胞存活力从95%-5%逐渐降低，表明单细胞的微囊化不是人胚胎干细胞扩增的合适方法。以人胚胎干细胞聚集体的形式进行包封，与未包封的人胚胎干细胞聚集体相比，观察到藻酸盐微胶囊中的细胞活力和代谢活性显著改善。将人胚胎干细胞接种在Matrigel包被的微载体(Cytodex 3)上并进行包封，发现这种方法产生高效的细胞扩增，细胞浓度增加19倍。这项研究表明，细胞微胶囊化和微载体技术的结合是最佳的人胚胎干细胞包封形式，且微胶囊化确保了无剪切应力微环境并避免了人胚胎干细胞培养物中微载体和聚集体的过度聚集。

然而Siti-Ismail等^[67]发现人多能干细胞的藻酸盐包封通常导致弱的机械性能和化学不稳定性，另外对渗透性肿胀的抵抗性差，这往往导致细胞逃逸渗出。因此，藻酸盐微胶囊的外部通常会涂覆带相反电荷的聚合物，通过络合作用增加机械稳定性^[68]。由于藻酸盐的聚阴离子特性，涂层材料是聚阳离子。后来，为了改善生物相容性，通过沉积另外的藻酸盐来中和微囊外部的正电荷，从而形成藻酸盐-多聚赖氨酸-藻酸盐微胶囊。Wlison等^[69]发现添加多聚赖氨酸涂层后，可防止D3小鼠胚胎干细胞从藻酸盐水凝胶中逸出，并保持干性达14 d。Jing等^[70]将H9人胚胎干细胞包埋在用多聚赖氨酸包被的藻酸盐水凝胶中并使用旋转瓶培养，发现多聚赖氨酸涂层促进细胞的受控聚集，使细胞扩增能力增强。此外，壳聚糖、聚乙二醇和其他聚阳离子可能被用作多聚赖氨酸的替代物^[69]。Ikeda等^[71]在海藻酸盐水凝胶外层包被了Ⅰ型胶原纤维，以细胞聚集体的形式扩增409B2人诱导多能干细胞，4 d达到14倍。

除了藻酸盐，还有其他类型的包封材料。例如，Dang等^[72]使用琼脂糖以细胞聚集体的形式包封YC5-R1，R1鼠胚胎干细胞，可以在高密度的搅拌悬浮液中培养。Gerecht等^[73]发现透明质酸水凝胶(负电荷)包封的人胚胎干细胞可以维持未分化状态，而葡聚糖水凝胶(不带电荷)包封的人胚胎干细胞则有自发分化的倾向。

与微载体培养一样，完成细胞扩增过程之后，人多能干细胞必须保证有效的细胞-水凝胶分离，目前常用的分离方法是使用螯合剂(EDTA、柠檬酸钠)解开二价交联剂产生的离子相互作用^[74]。然而这种方法可能使凝胶去除不彻底，影响后续检测，且对细胞伤害较大，继续培养效果差。于是，Lei等^[75]发现合成聚合物水凝胶(聚(N-异丙基丙烯酰胺)-co-聚(乙二醇))，通过迅速响应温度变化，使温度从4 ℃改变到37 ℃，收获或传代细胞。使用3种人胚胎干细胞系(iPS-Fib2s，iPS-MSCs和H9s)培养在成分明确的E8培养基中，每5 d传代，均可到达20倍扩增，并且在培养过程中Oct4和Nanog表达维持在95%。

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引言

人多能干细胞包括人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞，具有分化成几乎人体所有细胞类型的功能^[1]。因此，人多能干细胞是再生医学、疾病模型和药物筛选等领域的理想种子细胞来源^[2]，在治疗心力衰竭、糖尿病、脑卒中和脊髓损伤等疾病具有广阔的应用前景^[2]。

人多能干细胞的二维培养是其在修饰过的培养基底表面上培养，近年来二维培养的研究热点大多集中在成分明确的培养基底表面。此过程大体经历了几个阶段，最初发现的是小鼠肿瘤提取物Matrigel，能够在培养基底表面形成一层富含细胞外基质成分的薄膜，支持人多能干细胞贴壁、增殖和干性维持^[3]。但是，由于Matrigel含异源性成分，存在免疫原性和微生物感染风险等问题，限制人多能干细胞在临床治疗中的应用^[3]。研究者利用Matrige中含有的某种单一成分用于人多能干细胞培养，并获得了成功。层粘连蛋白、玻连蛋白和E-钙黏附素修饰的细胞培养板被证实可以支持人多能干细胞体外长期培养^[3-5]；后续研究发现，LN511、LN111、LN521等层粘连蛋白的特定亚型和片段，也能够支持人多能干细胞的贴壁和干性维持^[6-7]；但最近又有研究发现层粘连蛋白的不同种型导致人诱导多能干细胞选择性分化成不同的眼睛样组织，如LN332E8、LN511E8^[8]。然而，这些生物活性材料存在制备费用昂贵、批次间稳定性不佳、不能大规模生产等缺点，不适于人多能干细胞的体外大规模培养^[9]。研究者发现来源于这些蛋白的多肽修饰培养表面和聚合物基底同样可以支持人多能干细胞的体外长期干性维持，并且具有无外源性成分、化学成分明确等优点。例如，接枝玻连蛋白多肽的聚丙烯酸修饰表面^[10]、PMVE-alt-MA聚合物表面^[11]，均被证实能够支持人胚胎干细胞的贴壁和干性维持。虽然已有较多人工合成表面被报道可支持人多能干细胞的贴壁和干性维持，但是多数人工合成表面没有后续应用报道，也尚未发现有被广泛应用的人工合成表面。

二维细胞培养体系需要消耗大量劳动力、空间和试剂，被认为只适用于小规模制备细胞，难以满足临床中对人多能干细胞及其衍生细胞应用的高需求。例如，治疗心肌梗死或糖尿病时，分别需要10⁹个心肌细胞或10⁹个β细胞，而一个单位的血液或血小板输注，则需要10¹²个红细胞或10¹¹个血小板^[12]，二维培养体系显然难以获得。然而，每毫升培养基包含10⁶-10⁷个细胞的搅拌悬浮生物反应器则能高效扩增细胞，从而达到理想细胞数^[13-14]。使用三维培养结合生物反应器系统可能是一个理想的选择。此外，生命器官中的实质细胞存在于细胞外基质和其他类型细胞支持的高度复杂的三维环境中，与体外二维培养微环境存在很大的区别^[15-16]。与二维培养相比，细胞聚集体、微载体和水凝胶等三维培养方式具有更高的表面积与体积比，可以显著增加黏附细胞的数量，在相对较小的容器中培养大量人多能干细胞，从而降低人多能干细胞培养所需的培养基和补充剂的成本30%-60%^[17-20]。当然，三维培养目前仍存在细胞分离回收影响细胞状态以及生物反应器搅拌产生的剪切应力研究不透彻等问题。文章将对构建人多能干细胞三维微环境的研究进展进行详细的综述：①介绍应用于人多能干细胞扩增的生物反应器系统；②介绍细胞聚集体、微载体、水凝胶等三维培养体系；③总结三维培养的意义、存在的问题以及未来的发展方向。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

讨论

二维的人多能干细胞培养是将细胞贴附于修饰的培养板表面，通过更换培养基和常规周期性解离来促进细胞扩增，从而收获细胞。研究热点主要集中在培养基的开发和培养表面的修饰两个方面。如何获得一种化学成分明确，无异源物质的培养基一直是研究人员的目标。经历了StemPro，mTeSR1，mTeSR2后，只有8种成分的E8培养基成为目前主流的人多能干细胞培养基。因此，研究者聚焦于开发二维培养表面的修饰，从异源的Matrigel到成分明确的聚合物和人工合成表面，二维培养已经迈出了一大步。此外，传统的二维人多能干细胞培养，因其操作标准简便，可通过原位显微镜直接观察到人多能干细胞集落的形态，筛选未分化的人多能干细胞，成为经典的培养技术。但是，二维培养仍存在很大的缺陷，如不能模拟细胞在体内复杂的微环境，单纯的平面型细胞培养板模式无法提供临床所需的足量细胞，因此，能够有效还原细胞体内微环境、大规模生产细胞的三维培养系统有望成为获取足量人多能干细胞的有效方法。

人多能干细胞的三维培养方法主要依赖于生物反应器系统的细胞聚集体、微载体和水凝胶培养。在细胞聚集体培养方面，其形成方法简单且不需要依赖其他支架支持培养，故细胞收集较为简单。但是，生物反应器中细胞聚集体的尺寸会随培养时间的延长而增加，使得氧气和营养物质无法到达聚集体中心，从而导致中心区细胞分化、凋亡。虽然有研究发现细胞聚集体直径可受叶轮搅拌速率的控制，但是叶轮带来的剪切应力会直接作用于细胞表面，很大程度影响细胞增殖甚至引起细胞分化，因此，目前大量的研究倾向于将细胞聚集体培养应用于促进细胞分化。

微载体培养中，细胞通过均一地附着于微载体表面，更容易均匀地接触氧气和营养成分，从而高效地扩增细胞。与细胞聚集体相比，微载体培养既可以在相对较小的容器中培养获得大量的细胞，也可以通过减少培养所需的培养基和生长因子降低生产成本。目前，微载体表面修饰层的开发大多借鉴了二维培养表面，但有研究发现并不是所有的二维培养表面均适用于三维培养。Fan等^[57]将H9人胚胎干细胞和IMR90培养在Matrigel包被的聚苯乙烯微载体上，发现细胞会从微载体上脱落而自发形成细胞聚集体。此外，培养过程中搅拌产生的剪切应力、细胞收获时酶和细胞过滤器的应用，均对细胞活性产生影响。

与细胞聚集体和微载体培养相比，水凝胶中包封材料的保护能有效减轻生物反应器带来的剪切应力的影响，消除了细胞不受控的团聚和水动力的影响。但是，水凝胶培养同样具有一些局限性：首先，它不是普遍适用的。一些人多能干细胞系和人类细胞类型，其解离的细胞不能在水凝胶中存活并克隆生长。尽管确切的原因尚不清楚，但Lei等推测水凝胶的包封阻止了细胞间的相互作用，从而影响细胞存活；其次，每个水凝胶内的细胞扩增量都不是很高，这可能是由于封装在水凝胶中的细胞没有自由扩展的空间，而且它们不得不变形，为新细胞创造空间；第三，水凝胶机械性能不如微载体，使其难以加工成适用于大规模细胞培养的形式^[76-77]。

对于生物反应器的应用，在大规模灌注过程中，将会有大量的培养基消耗，而培养基昂贵的生长因子添加将会产生过高的培养成本，将来有望将循环灌注系统与渗透性薄膜结合，通过膜的分子质量选择性滤出代谢废物，而将人多能干细胞释放的生长因子留在生物反应器中，使人多能干细胞通过其内源因子的分泌自我调节，减少昂贵的生长因子补充。此外，大规模扩增同样需要大体积的生物反应器，相应的叶轮体积也会增大，随之带来的剪切应力也是不能避免的。在未来，这些问题还需要更加深入的分析。

综上所述，多能干细胞三维培养与二维培养相比，具有不可忽视的优势。首先，能获得更多数量的细胞；其次，能模拟细胞体内的三维环境；第三，自动化的细胞培养流程能显著减轻实验人员的重复工作。应用三维培养，如何提高细胞存活率、改良收获细胞的方式等问题仍需进一步研究。总而言之，人多能干细胞三维培养方法的研究以及生物反应器的开发应用在生命科学与临床医学领域潜力无穷，大规模扩增的前景十分广阔。在巨大的临床应用前景面前，人多能干细胞的三维培养体系将会迅速发展。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

三维培养人多能干细胞的研究与进展

Three-dimensional culture of human pluripotent stem cells

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