炎症诱导骨髓间充质干细胞条件培养基修复急性辐射引起的小肠上皮干细胞损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1602

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (9): 1324-1329.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1602

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炎症诱导骨髓间充质干细胞条件培养基修复急性辐射引起的小肠上皮干细胞损伤

马发鑫^1，2，沙卫红²，王启仪²，李金亮²，卢铨^1，2，骆昱均^1，2

¹汕头大学医学院，广东省汕头市 515041；²广东省人民医院消化内科，广东省医学科学院，广东省广州市 510080

修回日期:2018-11-02 出版日期:2019-03-28 发布日期:2019-03-28
通讯作者: 王启仪，主任医师，广东省人民医院消化内科，广东省医学科学院，广东省广州市 510080
作者简介:马发鑫，男，1992年生，广东省汕头市人，汉族，2016年汕头大学医学院毕业，硕士，医师，主要从事胃肠病的诊治，以及组织损伤修复、干细胞的基础及临床研究。
基金资助:
广东省自然科学基金(2016A030313815)，项目负责人：沙卫红；广州市科技计划项目(201707010419)，项目负责人：沙卫红

Inflammation activated bone marrow mesenchymal stem cell conditioned medium repairs radiation-induced acute injury to intestinal epithelial stem cells

Ma Faxin^{1, 2}, Sha Weihong², Wang Qiyi², Li Jinliang², Lu Quan^{1, 2}, Luo Yujun^{1, 2}

¹Shantou University Medical College, Shantou 515041, Guangdong Province, China; ²Department of Gastroenterology, Guangdong General Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China

Revised:2018-11-02 Online:2019-03-28 Published:2019-03-28
Contact: Wang Qiyi, Chief physician, Department of Gastroenterology, Guangdong General Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
About author:Ma Faxin, Master, Physician, Shantou University Medical College, Shantou 515041, Guangdong Province, China; Department of Gastroenterology, Guangdong General Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 2016A030313815 (to SWH); Guangzhou Scientific Research Plan, No. 201707010419 (to SWH)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
小肠上皮隐窝内存在的小肠干细胞：有2种类型，隐窝基底部的柱状细胞和+4位(从隐窝底部算起的第4个细胞位置，位于潘氏细胞之上)细胞，通常被认为是小肠上皮静止的储备干细胞群。
间充质干细胞条件培养基在临床应用前亟需解决的问题：首先，常规制备的间充质干细胞条件培养基中细胞因子含量偏低，容易影响治疗效果；其次，间充质干细胞条件培养基中的成分复杂，既含有各种营养、修复因子，也存在其他不利于修复的成分。如能辨别间充质干细胞条件培养基中修复因子和负性因子，则有利于优化间充质干细胞条件培养基的疗效，推进其临床应用。

摘要
背景：课题组前期发现，炎症预激活的骨髓间充质干细胞条件培养基可促进大鼠小肠急性辐射损伤后的结构和功能修复，该修复作用是否通过调控小肠干细胞得以实现，目前相关研究尚未明确。
目的：探究炎症预激活的骨髓间充质干细胞条件培养基对辐射损伤大鼠小肠上皮干细胞的影响，以进一步明确其修复辐射损伤小肠黏膜的机制。
方法：①分离、培养、鉴定SD幼鼠(中山大学北校区实验中心提供)骨髓间充质干细胞，分别与正常对照和辐射损伤的小肠隐窝细胞株IEC-6在Transwell培养板中共培养24 h，预刺激的骨髓间充质干细胞继续单独培养48 h，收集到的上清液分别为正常状态间充质干细胞条件培养基(MSC-CM^NOR)和辐射炎症预激活间充质干细胞条件培养基(MSC-CM^IR)；②将成年SD大鼠(中山大学北校区实验中心提供)随机分为4组：对照组，单纯辐射损伤组，辐射损伤+MSC-CM^NOR组，辐射损伤+MSC-CM^IR组，每组20只。后3组以14 Gy剂量一次性腹部局部照射制备急性小肠辐射损伤大鼠模型，造模成功后4 h内，单纯辐射损伤组尾静脉注射DMEM-F12培养基，200 μL/d，连续注射3 d；辐射损伤+MSC-CM^NOR组、辐射损伤+MSC-CM^IR组采用胶囊渗透压泵腹腔植入的方式注射MSC-CM^NOR和MSC-CM^IR，胶囊内含2 mL浓缩条件培养基，植入腹腔后以10 μL/h的速率匀速释放。于辐射后第1，3，5，7天取小肠组织行免疫组织化学染色、Western blot及qRT-PCR检测。
结果与结论：①辐射后第3天，位于隐窝基底增殖活跃的Lgr5⁺小肠上皮干细胞与对照组相比显著减少，几乎难以观察到阳性细胞；而在输注MSC-CM^IR后，Lgr5⁺小肠上皮干细胞与单纯辐射损伤组相比明显增多，MSC-CM^NOR组Lgr5⁺小肠上皮干细胞未见明显增多；②辐射损伤后第3天，位于小肠隐窝+4位置相对静止的Bmi1⁺小肠上皮干细胞几乎无法观察到；而输注MSC-CM^IR后，Bmi1⁺小肠上皮干细胞与单纯辐射损伤组相比明显增多，不仅分布在+4细胞位置，还分布在Lgr5⁺细胞常见的位置，表明Bmi1⁺细胞在辐射损伤后有可能通过分化为Lgr5⁺细胞发挥修复效应；③Western blot和qRT-PCR进一步验证，MSC-CM^IR组的Lgr5表达在同一时间点均明显高于单纯辐射损伤组和MSC-CM^NOR组，持续高水平表达后于第7天恢复至正常水平。MSC-CM^NOR修复作用较弱，仅在第7天时与单纯辐射损伤组相比差异有显著性意义；④结果表明，炎症预激活状态的骨髓间充质干细胞条件培养基具有保护小肠上皮干细胞的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-2723-2210(马发鑫)

关键词: 放射性肠损伤, 骨髓间充质干细胞, 条件培养基, 炎症, 小肠干细胞, 小肠上皮细胞, 广东省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Our previous findings indicate that inflammation-activated bone marrow mesenchymal stem cell conditioned medium (MSC-CM) contribute to repairing the structure and function of the small intestine after radiation-induced acute intestinal injury. However, it is unclear whether the repair effect can be achieved by regulating small intestinal stem cells.
OBJECTIVE: To investigate the effects of inflammation-activated bone marrow MSC-CM on the small intestinal epithelial stem cells after acute radiation-induced intestinal injury and to further discuss the repairing mechanism.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells of Sprague-Dawley rats were separated, cultured and identified. Then, the bone marrow mesenchymal stem cells were co-cultured with normal or radiation-induced IEC-6 cell lines in the Transwell system for 24 hours. Inflammation-activated bone marrow mesenchymal stem cells were cultured alone for 48 hours. Non-activated MSC-CM (MSC-CM^NOR) and MSC-CM under radiation-induced inflammatory condition (MSC-CM^IR) were collected. Adult Sprague-Dawley rats (provided by the Experimental Center of Sun Yat-Sen University North Campus) were randomly divided into four groups with 20 rats in each group: control group, radiation group, radiation+MSC-CM^NOR group and radiation+MSC-CM^IR group. The rats in the latter three groups were exposed to one-off 14 Gy whole abdominal radiation to make a rat model of acute radiation-induced small intestinal injury. Three-day continuous administration beginning within 4 hours after successful modeling was given via the tail vein and intraperitoneal implantation of Alzet micro-osmotic pumps: EMEM-F12 (200 μL/d) for the radiation group, MSC-CM^NOR for radiation+MSC-CM^NOR group and MSC-CM^IR for radiation+MSC-CM^IR group. There was 2 mL of concentrated conditioned medium in the pump which was released at a constant rate of 10 μL/h into the abdominal cavity after implantation. Intestinal samples were collected at 1, 3, 5, 7 days after radiation for immunochemistry staining, western blot and qRT-PCR detection.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) On the 3^rd day after radiation, Lgr5 positive cells, which were actively proliferating on the base of crypts, became significantly reduced compared with the normal control group, and there was nearly no existing Lgr5 positive cells. However, after infusion of MSC-CM^IR, Lgr5 positive intestinal stem cells were significantly increased compared with the radiation group, while in the radiation+MSC^NOR group, there was no significant increase in Lgr5 positive intestinal stem cells. (2) On the 3^rd day after radiation injury, Bmi1 positive intestinal stem cells were almost invisible. After infusion of MSC-CM^IR, Bmi1 positive intestinal stem cells increased significantly, and it was observed not only in the +4 cell position but also in the common position used to be Lgr5 stem cells, indicating that Bmi1 stem cells could differentiate into Lgr5 positive cells to act its repairing effect. (3) Western blot and qRT-PCR further confirmed that the radiation+MSC-CM^IR group was significantly higher on the Lgr5 expression level than the radiation group and the radiation+MSC-CM^NOR group, and it returned to the normal level on the 7^th day after the continuous high expression level. The repair effect of radiation+MSC-CM^NOR group was weaker, and only on the 7^th day, the expression level of Lgr5 was statistically different from the radiation group. To conclude, inflammation-activated bone marrow MSC-CM exert a protective effect on the small intestinal epithelial stem cells after acute radiation-induced intestinal injury.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Culture Media, Conditioned, Inflammation, Radiation Injuries, Intestine, Small, Tissue Engineering

中图分类号:

马发鑫，沙卫红，王启仪，李金亮，卢铨，骆昱均. 炎症诱导骨髓间充质干细胞条件培养基修复急性辐射引起的小肠上皮干细胞损伤[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(9): 1324-1329.

Ma Faxin, Sha Weihong, Wang Qiyi, Li Jinliang, Lu Quan, Luo Yujun. Inflammation activated bone marrow mesenchymal stem cell conditioned medium repairs radiation-induced acute injury to intestinal epithelial stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(9): 1324-1329.

图/表（结果） 1

2.1 间充质干细胞条件培养基对Lgr5⁺小肠干细胞的影响 Lgr5⁺小肠上皮细胞被认为是活跃增殖的小肠上皮干细胞群，维持着小肠上皮的更新和修复。正常情况下，Lgr5⁺细胞主要位于潘氏细胞之间，也有少部分位于+4(从隐窝底部算起的第4个细胞位置，位于潘氏细胞上)细胞的位置。辐射后第3天，单纯辐射损伤组的Lgr5⁺细胞与对照组相比显著减少，几乎难以观察到阳性细胞；而在输注MSC-CM^IR后，Lgr5⁺细胞与辐射损伤组相比明显增多，MSC-CM^NOR组Lgr5⁺细胞未见明显增多，见图1A，B。

通过Western blot和qRT-PCR进一步验证发现，辐射损伤+MSC-CM^IR组的Lgr5表达在同一时间点均明显高于单纯辐射损伤组和辐射损伤+MSC-CM^NOR组，并在第3天开始逐渐恢复至正常对照组的表达水平，此后保持一个较高水平的持续表达，在第5天达到最高峰，第7天恢复至正常水平。MSC-CM^NOR修复作用较弱，仅在第7天时与辐射损伤组相比差异有显著性意义，见图1C，D。

2.2 间充质干细胞条件培养基对Bmi1⁺小肠干细胞的影响 Bmi1⁺小肠上皮细胞被认为是小肠上皮静止的储备干细胞群，当小肠上皮受外来刺激时被激活，分化为Lgr5上皮干细胞甚至直接分化为成熟小肠上皮细胞，在损伤修复时起着极为重要的作用。Bmi1⁺小肠上皮细胞主要分布于+4细胞的位置，辐射损伤后第3天，单纯辐射损伤组几乎无法观察到Bmi1⁺细胞。输注MSC-CM^IR后，Bmi1⁺细胞与单纯辐射损伤组相比明显增多，并且观察到不仅分布在+4细胞位置，还分布在潘氏细胞之间，见图2，即Lgr5干细胞常见的位置，表明Bmi1⁺干细胞在辐射损伤后有可能通过分化为Lgr5⁺干细胞发挥修复效应。

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引言

材料方法

1.1 设计 动物体内实验。

1.2 时间及地点 于2017年12月至2018年4月在广东省人民医院(广东省医学科学院)中心实验室、中山大学中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 雌性SD幼鼠(三四周龄，体质量60-80 g，SPF级) 1只用于提取骨髓间充质干细胞；成年雌性SD大鼠(6-8周龄，平均体质量250 g，SPF级) 80只用于建立小肠急性辐射损伤动物模型，均由中山大学北校区实验中心提供。所有动物经检疫符合实验动物标准，饲料经灭菌或消毒处理。整个实验过程严格遵守医学伦理学要求。

1.3.2 细胞株 大鼠小肠隐窝上皮细胞IEC-6购于American Type Culture Collection (ATCC)，作为辐射损伤IEC-6模型。

1.3.3 实验试剂与材料 DMEM-F12培养基(美国Hycolne公司)；胎牛血清(美国Hycolne公司)；TrypLE^Express胰酶代替物(美国Invirogen公司)；小鼠抗大鼠CD29-FITC、CD34-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD90-FITC单克隆抗体(美国Biolegend公司)；兔抗大鼠Lgr5多克隆抗体(Santa Cruze公司)；兔抗大鼠Bmi1多克隆抗体(Santa Cruze公司)；兔抗小鼠β-actin单克隆抗体(Cell Signaling Technology公司)；5 kD离心超滤管(Millipore公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定 因雌性动物的间充质干细胞具有更佳的干细胞潜能和修复作用^[6]，故而选取雌性SD幼鼠用于分离培养骨髓间充质干细胞。参照课题组既往方法^[7]，使用频繁换液法分离培养原代骨髓间充质干细胞，原代细胞1∶1传代，第2代以后细胞1∶3传代。待骨髓间充质干细胞生长至第2代时，使用流式细胞仪对细胞表型CD29、CD34、CD45、CD90进行鉴定。

1.4.2 MSC-CM的制备 参照课题组既往文献报道方法^[7]，分别获得辐射诱导MSC-CM(MSC-CM^IR)、正常MSC-CM (MSC-CM^NOR)，于-20 ℃冰箱储存备用。①MSC-CM^IR制备：IEC-6细胞以3×10⁴的密度种植于6孔Transwell板上室，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养；第2代骨髓间充质干细胞以5×10⁴的密度接种于6孔Transwell板下室，加入含体积分数为10%胎牛血清DMEM-F12培养。在辐射之前上室和下室分开培养。待细胞融合度达到70%-80%后，取上室的IEC-6细胞用PRIMUS^@H直线加速器(X射线)辅射，速率为300 cGy/min，总剂量为10 Gy。辐射后上下室细胞共培养，弃去原来含血清的培养液，PBS清洗2次，用此前收集的辐射损伤IEC-6条件培养基(IEC-6-CM^IR)共培养24 h，随后将上室的IEC-6细胞移走，下室的骨髓间充质干细胞再次更换2 mL新鲜的无血清DMEM-F12培养基，培养48 h后收集该培养液，此为MSC-CM^IR。随后用5 kD离心超滤管，3 000 r/min离心20 min，此时培养基浓缩约50倍，0.22 μm滤器过滤灭菌，-20 ℃冷冻保存备用；②MSC-CM^NOR制备：步骤同上，但不与辐射损伤IEC-6交互激活，与正常IEC-6共培养，无血清DMEM-F12培养基孵育48 h后收集培养液，超滤后收集存储。

1.4.3 辐射损伤模型建立及分组 模型建立方法同课题组既往方法^[7]，SD大鼠麻醉后除腹部外均使用铅砖覆盖屏蔽，使用PRIMUS直线加速器一次性照射(速率300 cGy/min，总辐射剂量14.0 Gy)。随机将80只SD大鼠分为4组，分别为对照组，单纯辐射损伤组，辐射损伤+MSC-CM^NOR组，辐射损伤+MSC-CM^IR组，每组20只，后3组建立辐射损伤模型。

1.4.4 给药方式造模成功后4 h内，单纯辐射损伤组尾静脉注射DMEM-F12培养基，200 μL/d，连续注射3 d；辐射损伤+MSC-CM^NOR组、辐射损伤+MSC-CM^IR组采用胶囊渗透压泵腹腔植入的方式注射MSC-CM^NOR和MSC-CM^IR，胶囊内含2 mL浓缩条件培养基，植入腹腔后以10 μL/h的速率匀速释放。对照组尾静脉联合腹腔注射方式给予等量生理盐水。

1.4.5 标本留取 分别于辐射损伤后第1，3，5，7天取材，开腹，距回盲部约16 cm取出小肠约6 cm，等分为3份，用PBS将肠腔内容物冲洗干净，其中2 cm用40 g/L多聚甲醛固定，用于免疫组织化学染色，剩余部分存储于液氮罐，分别用于qRT-PCR及Western blot检测。

1.4.6 免疫组织化学染色观察干细胞标记物的表达 常规二甲苯脱蜡水化，与50 μL过氧化物轻摇孵育10 min，PBS冲洗3×5 min，体积分数为10%正常山羊血清室温湿盒封闭孵育30 min；加一抗大鼠Lgr5、Bmi1抗体(1∶250稀释)，4 ℃孵育过夜；PBS洗涤3次，加50 μL二抗工作液，室温湿盒孵育30 min，PBS冲洗3次，加SABC工作液50 μL，室温孵育1 h，PBS洗涤3次，最后DAB显色10 min，苏木精复染，常规脱水、中性树胶封固，显微镜观察。细胞膜及细胞质中出现染色的棕色颗粒为Lgr5或Bmi1阳性表达，由2位医师独立阅片，每张组织切片观察100个隐窝的阳性细胞数，每一组随机选取3张切片，用平均每5个隐窝的阳性细胞数量用于各组比较。

1.4.7 Western blot检测Lgr5的蛋白表达 使用剪刀剪碎肠道组织，置于匀浆器中球状部位，加入PMSF，用RIPA裂解液提取待测标本的总蛋白。采用BCA法测定总蛋白的浓度，在10%或12%聚丙烯酰胺中电泳，并转膜至聚偏二氟乙烯膜。封闭后，加兔抗Lgr5抗体，以β-actin抗体作为内参，4 ℃孵育过夜，洗膜后加山羊抗兔二抗，显影。使用Bio-Rad QuantityOne软件测定吸光度值。

1.4.8 qRT-PCR检测Lgr5的mRNA表达 将肠道标本组织加入1.5 mL离心管，弃去上清后加入1 mL Trizol试剂，吹打均匀后常温静置5 min。上述溶液加入0.2 mL氯仿，震荡15 s后冰上静置3 min，最后于4 ℃下12 000 r/min离心15 min。离心后将上层无色水相转移到另一个1.5 mL离心管中，加入0.5 mL异丙醇，混匀，冰上静置10 min后 12 000 r/min离心10 min。使用UV-2450分光光度计测得A_{260 nm}/A_{280 nm}比值以评价RNA的质量，此值在1.8-2.0之间为质量良好，可进行后续实验。

采用TaKaRa的PrimeScript^TMRT-PCR kit进行RT反应。采用TaKaRa的SYBR^® Premix Ex Taq^TM Ⅱ进行荧光定量PCR反应。定量PCR引物：Rat Lgr5：5'- ATG GTG GAA TGC AAG AAA GC-3'和5'-TAG GTG TAA CCA GGG GCA AG-3'；β-actin：5'-CGG CTA CCA CAT CCA AGG AA-3'和5'-GCT GGA ATT ACC GCG GCT-3'。以β-actin作为内参，每个标本以3个孔的平均Cp值作为结果，根据所制作的每对引物的标准曲线，用LightCycler480荧光定量PCR仪自带软件中的Advanced Analysis进行分析，根据引物扩增效率，自动采用Second Derivative Maximum method或者Fit Points method进行计算(扩增效率=2时采用Fit Points method)，最终得到样品之间目的基因的表达比率，利用相对比值进行统计分析。

1.5 主要观察指标 ①免疫组织化学染色观察干细胞标记物Lgr5、Bmi1的表达；②qRT-PCR及Western blot检测Lgr5的mRNA和蛋白表达。

1.6 统计学分析 计量资料以x(_)±s表示，均数的比较符合正态分布用t 检验，非正态分布者用秩和检验；计数资料以百分率表示，率的比较采用χ²检验。统计软件为SPSS 16.0，设置P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

肠是体内最具放射敏感性的器官之一。例如，在核事故之后暴露于高剂量辐射可导致严重的肠损伤和高死亡率。急性放射性肠病主要表现为呕吐、腹泻、消化道出血、内毒素血症、继发性感染等，若缺乏有效及时的处理，甚至可以导致患者急性死亡^[8-9]。目前对于小肠辐射损伤却依然缺乏行之有效的医治方案^[9]。手术治疗存在创伤大，术后出现短肠综合征、肠瘘等诸多弊端；小肠移植则缺乏供体，并且术后需面临免疫排斥的问题；长期肠外营养导致患者生存质量低、感染风险增加等缺点。基于间充质干细胞移植的治疗方法简单、侵入性小、组织修复效果优异等特点，来源于不同组织的间充质干细胞移植成为临床试验的重要方向^[5]。已有文献报道间充质干细胞移植在肠道辐射损伤模型中起到修复作用^[10-11]。

MSC-CM与间充质干细胞移植相比，存在明显前景和优势。近年来研究发现，间充质干细胞对心脏、肾脏、胰腺、肝脏等多种组织，包括肠道黏膜疾病有着良好的修复作用^[12-13]。然而，基于细胞移植的治疗方法却面临着以下问题：①干细胞的自我更新和多向分化能力是其治疗组织损伤的重要特征，但是这同时也赋予了干细胞分化为癌细胞的可能，长期以来严重制约着干细胞的临床应用^[14-16]；②移植入体的间充质干细胞定植率低，分化成特定功能细胞则是少之又少，难以完全代替已损伤的组织^[17]；③间充质干细胞移植由于免疫兼容制约，需要大量时间收集、纯化、扩增自体干细胞，无法应用于急症损伤^[18]。相较而言MSC-CM安全有效，无免疫原限制，可以商业化大量制备，可即刻应用于临床。虽然MSC-CM作为干细胞移植的替代方案前景良好，但是MSC-CM疗法在转化为临床应用前仍有多个问题亟需解决。首先，常规制备的MSC-CM的细胞因子含量偏低，容易影响治疗效果。例如，Angoulvant等^[19]用MSC-CM治疗心肌再灌注损伤，MSC-CM中血管内皮生长因子含量只有(217±97) ng/L，既往研究表明血管内皮生长因子在体内发挥血管生成效应的最低剂量至少为 5 000 ng/L ^[20]。其次，MSC-CM中的成分复杂，既含有各种营养、修复因子也存在其他不利于修复的成分。例如，van Poll等^[21]在研究MSC-CM治疗小鼠暴发型肝衰竭模型时发现，MSC-CM中的转化生长因子β和肿瘤坏死因子α是影响MSC-CM治疗肝衰竭的负性因子。因此MSC-CM与间充质干细胞移植治疗各有其缺点，但如能辨别MSC-CM中修复因子和负性因子，则有利于优化MSC-CM的疗效，推进其临床应用。总体来说，MSC-CM更具前景和优势。

炎症激活状态的MSC-CM对辐射损伤大鼠小肠的修复与促进小肠干细胞再生有关。小肠黏膜的损伤修复尤以小肠上皮干细胞的作用最为重要，小肠上皮干细胞增殖、分化维持着肠上皮细胞的稳态，保持着肠黏膜上皮的结构完整和功能稳定。对小肠干细胞的保护，是恢复辐射小肠结构的细胞基础^[3]。Lgr5⁺小肠干细胞和Bmi1⁺小肠干细胞分别代表活跃和静止的两种干细胞群。Lgr5⁺细胞主要位于潘氏细胞之间。在辐射损伤时，增殖活跃的Lgr5⁺小肠干细胞对辐射更为敏感，而Bmi1⁺作为储备干细胞可以分化为Lgr5⁺干细胞和成熟的小肠上皮细胞促进小肠上皮的修复^[22-23]。既往研究表明，局部15 Gy辐射后Lgr5⁺干细胞在 3 d内完全消失^[23-24]，而Bmi1⁺干细胞在7 d内也会逐渐消失。与已发表的文章一致，该实验中，14 Gy辐射后第3天，辐射损伤组的Lgr5⁺细胞与对照组相比显著减少，几乎难以观察到Lgr5⁺细胞，但输注MSC-CM^IR可以使两种小肠上皮干细胞在3 d内逐渐恢复至接近正常水平，表明炎症预激活状态的MSC-CM具有保护小肠干细胞的作用。需要注意的是，输注MSC-CM^IR后，Bmi1⁺细胞不仅分布在+4细胞位置，还分布在潘氏细胞之间，说明MSC-CM^IR可能通过诱导Bmi1⁺细胞分化为Lgr5⁺细胞，从而发挥修复效应。实验从小肠干细胞角度对课题组的前期实验进行了更深一步的研究^[7]，也是首次应用不同状态MSC-CM修复辐射小肠上皮干细胞的报道，并且与既往报道间充质干细胞修复小肠上皮干细胞的时间相比^[25]，炎症预激活的MSC-CM可能更有效。

不同状态的MSC-CM对辐射损伤小肠干细胞修复作用存在差异。非激活状态下的MSC-CM可能由于该状态下的间充质干细胞旁分泌活性不足，无法有效起到修复损伤组织的作用。然而，具有良好可塑性的间充质干细胞，在诸如炎症或者受损细胞的诱导下，能激活其生物潜能，尤其能丰富其旁分泌因子的种类和含量，增强其对组织损伤的保护。虽然间充质干细胞移植前，并未对间充质干细胞进行诱导，但是损伤局部的炎症环境足以诱导间充质干细胞的激活。最近已经有报道表明，在疾病发生前移植间充质干细胞，由于体内缺乏炎症因子，无法激活间充质干细胞，导致间充质干细胞的免疫活性和迁徙能力不足，从而无法提供保护^[26-27]。Duijvestein等^[28]同样发现只有经炎症因子干扰素γ活化的间充质干细胞，而非正常状态下的间充质干细胞，才能获得足够的免疫活性和迁徙能力，从而对溃疡性结肠炎模型提供保护作用。实验将炎症诱导前后的间充质干细胞条件培养基MSC-CM^NOR、MSC-CM^IR进行对比。实验结果表明，与辐射损伤组相比，MSC-CM^IR组能够显著增加辐射损伤后Lgr5⁺细胞、Bmi1⁺细胞的表达；而MSC-CM^NOR组中Lgr5⁺细胞、Bmi1⁺细胞的表达水平无明显差异，仅在第7天才观察差异有显著性意义。从侧面进一步表明，来自间充质干细胞的分泌因子而非间充质干细胞分化替代损伤细胞，才是干细胞治疗急性辐射小肠损伤的关键。在炎症刺激下，间充质干细胞分泌修复因子的能力得到增强。

总之，实验首次观察到炎症激活状态MSC-CM修复急性辐射大鼠小肠损伤与促进小肠干细胞再生有关，为MSC-CM在小肠黏膜损伤的临床治疗及小肠干细胞的研究提供了实验证据，进一步明确炎症激活状态MSC-CM中修复小肠损伤的具体活性成分，以及调控小肠干细胞增殖、分化、凋亡的分子机制是后续实验仍需进一步研究的方向。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

炎症诱导骨髓间充质干细胞条件培养基修复急性辐射引起的小肠上皮干细胞损伤

Inflammation activated bone marrow mesenchymal stem cell conditioned medium repairs radiation-induced acute injury to intestinal epithelial stem cells

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