动物源细胞外基质中糖胺聚糖物质的检测方法

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1428

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (30): 4861-4867.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1428

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动物源细胞外基质中糖胺聚糖物质的检测方法

张伟^1，2，陈俊霖¹，胡康¹

¹冠昊生物科技股份有限公司，再生型医用植入器械国家工程实验室，广东省广州市 510530；²广州科越生物科技有限公司，广东省广州市 510530

收稿日期:2019-05-31 出版日期:2019-10-28 发布日期:2019-10-28
作者简介:张伟，男，1979年生，山东省济宁市人，汉族，北京大学在读博士，主要从事生物医用材料与医疗器械研究。
基金资助:
国家重点研发计划资助(2016YFC1103200)

Methods for detecting glycosaminoglycan in the extracellular matrix of animal cells

Zhang Wei^1,2, Chen Junlin¹, Hu Kang¹

¹Guanhao Biotech Co., Ltd., National Engineering Laboratory for Regenerative Medical Implantable Devices, Guangzhou 510530, Guangdong Province, China; ²Guangzhou Keyue Biotech Co., Ltd., Guangzhou 510530, Guangdong Province, China

Received:2019-05-31 Online:2019-10-28 Published:2019-10-28
About author:Zhang Wei, Doctoral candidate, Guanhao Biotech Co., Ltd., National Engineering Laboratory for Regenerative Medical Implantable Devices, Guangzhou 510530, Guangdong Province, China; Guangzhou Keyue Biotech Co., Ltd., Guangzhou 510530, Guangdong Province, China)
Supported by:
National Key R & D Program of China, No. 2016YFC1103200

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

细胞外基质：是结构蛋白和功能蛋白共同组成的网络，这2种蛋白以独特的组织特异性在细胞与周围组织器官之间进行结构组装，为每个组织和器官提供机械框架，是细胞信号传导的底物，在细胞活动中起着至关重要的作用。

糖胺聚糖：是指一种存在于高等动物结缔组织中的杂多糖，具有保持疏松结缔组织中的水分、调节多种阳离子在组织中的分布、在一定程度上促进机体创伤愈合等优点，个别糖胺聚糖如透明质酸有很大的黏滞性，附在关节面上具有润滑和保护作用，主要分为透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸乙酰肝素和肝素等5类物质。

背景：作为每个组织和器官中的细胞分泌产物，细胞外基质凭借其独一无二的生物学特性成为了临床应用中一种独特的再生型生物材料。糖胺聚糖作为细胞外基质中的重要活性物质之一，具有诸多优良的生物学特性。

目的：整理总结近年来国内外对细胞外基质中糖胺聚糖检测方法的研究进展，并对各方法进行了对比，为优化细胞外基质糖胺聚糖检测方法提供帮助和方法参考。

方法：通过输入关键词“糖胺聚糖检测、细胞外基质、determination methods of glycosaminoglycan、Animal-derived extracellular matrix”，从PubMed、知网等文献搜索引擎共搜索出2 037篇相关文献，筛选并整理63篇文献，总结出常见的糖胺聚糖检测方法。根据阅读文献时总结的思路，提出基于现有提取检测糖胺聚糖方法的改进方案，并设计对比实验验证。

结果与结论：糖胺聚糖对动物源细胞外基质生物学性能起着至关重要的作用，可赋予细胞外基质材料及产品优异的生物活性与促修复功能。检测材料中糖胺聚糖含量可指导细胞外基质材料的工艺优化，因此糖胺聚糖检测方法至关重要。目前糖胺聚糖的检测方法主要有高效液相色谱法、糖醛酸分析法、乙醣胺定量分析法与二甲基亚甲基蓝检测法，以上方法均存在一定的局限性。基于已有的研究成果，针对二甲基亚甲基蓝检测法中的样本消化、糖胺聚糖提取等步骤做了改进，大幅度提升了检测结果的准确度，为其他糖胺聚糖检测方法提供了思路和参考。

ORCID: 0000-0001-9584-0771(张伟)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 细胞外基质, 糖胺聚糖, 临床应用, 检测方法, 生物学特性, 制作工艺, 二甲基亚甲基蓝检测, 高效液相色谱法

Abstract:

BACKGROUND: As a cell secretory product in every tissue and organ, the extracellular matrix, by virtue of its unique biological properties, has become a unique regenerative biomaterial in clinical applications. As one of the important active substances in the extracellular matrix, glycosaminoglycan has remarkable biological characteristics.

OBJECTIVE: To review the research progress of the detection methods of glycosaminoglycan in extracellular matrix at home and abroad and compare these methods to provide reference information to optimize the methods of detecting glycosaminoglycan in the extracellular matrix.

METHODS: A total of 2 037 publications were retrieved by searching CNKI database using search terms “glycosaminoglycan”, “extracellular matrix” and by searching PubMed using search terms “determination methods of glycosaminoglycan” “Animal-derived extracellular matrix”. Sixty-three literatures were screened and included in the final analysis. The common methods of detecting glycosaminoglycan were summarized. According to the ideas summarized during the literature review, the improved method for glycosaminoglycan extraction and detection was proposed and a comparative study was designed to validate the improved method.

RESULTS AND CONCLUSION: Glycosaminoglycan plays a vital role in the biological properties of animal-derived extracellular matrix and can confer superior biological activity and prosthetic function to extracellular matrix materials and products. Detection of glycosaminoglycan content in the extracellular matrix material can help to optimize extracellular matrix material. Therefore, the method of detecting glycosaminoglycan content in the extracellular matrix is of great importance. The currently available methods of detecting glycosaminoglycan include high performance liquid chromatography, uronic acid analysis, quantitative analysis of acetaminophen, and dimethyl methylene blue detection. All of these methods have certain limitations. Based on the existing research results, we only improved the sample digestion and glycosaminoglycan extraction in dimethylmethylene blue detection method, which greatly increased the accuracy of the detection results. This provides ideas and insights for other glycosaminoglycan detection methods.

Key words: extracellular matrix, glycosaminoglycan, clinical application, detection, biological characteristics, production process, dimethyl methylene blue detection, high performance liquid chromatography

中图分类号:

张伟，陈俊霖，胡康. 动物源细胞外基质中糖胺聚糖物质的检测方法[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(30): 4861-4867.

Zhang Wei, Chen Junlin, Hu Kang. Methods for detecting glycosaminoglycan in the extracellular matrix of animal cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(30): 4861-4867.

图/表（结果） 2

2.1 细胞外基质的特性在组织修复重建过程中，生物材料的主要作用是对细胞附着和细胞行为提供结构支持和微环境梯度调节^[13]，而动物源性细胞外基质最为常见。细胞外基质是由组织和器官中细胞分泌出来具有结构和功能分子的复合物^[14]。研究表明作为细胞外基质重塑过程的一部分，蛋白质降解带来的形态变化影响了细胞存活、增殖、迁移及分化^[15]。细胞外基质一直处于与细胞动态相互作用的状态：产生影响细胞形态和表现的信号及生物物理学的诱因，同时细胞也会因为微环境信号的影响(包括机械刺激、氧气和营养素浓度)修饰其分泌的细胞外基质产物^[16]。细胞外基质具有储存和隔离生长因子及细胞因子的能力，在机体内建立浓度梯度，并暂时的对生物利用率进行空间上的调控^[17-18]。此外在有限的蛋白水解作用下，细胞外基质可作为水解作用释放出来的生物活性片段的储存库，这些生物活性片段自身具有生物学特性和活性，可以参与调节包括血管生成在内的生理和病理过程^[19]。细胞外基质的生化特性允许细胞通过各种信号传导途径感知细胞外环境并与其相互作用，这些化学信号由细胞外基质的组分提供，尤其是黏附蛋白类因子如纤维连接蛋白、整合素和非整合素受体^[2-21]。

细胞外基质优异的物理和生物学特性，使其具有广泛的应用领域。目前，包含单个细胞外基质组分或者整个脱细胞组织的细胞外基质基底已被广泛应用于生物材料研究领域^[22]。

2.2 细胞外基质的临床应用虽然细胞外基质广泛存在于多种缺损组织和器官的修复重建，但能被用来作为支架起到治疗作用的原材料相对较少^[23]，目前应用较多的是动物源的真皮、小肠和膀胱的下层黏膜、心包膜、基底膜、脱细胞肝脏基质及脱细胞跟腱等^[24]。在实际应用中细胞外基质以多种形式进行使用，包括片材、颗粒、粉末或根据特定的位点修饰成对应的结构^[25]。在生物材料产品开发中，牛或猪的心包膜能够提供良好的结构支撑、细胞附着点位及储存信号因子，以确保组织重塑的有序进行^[26]。心包膜组织具有不同组织层次的结构如原纤维、纤维、纤维束等，这些结构特征赋予其非线性和各向异性的力学行为^[27-28]。心包膜作为多嵌段复合柔韧补片材料，在使用时为了避免免疫排斥反应，会使用多种方法去除细胞等免疫原性物质，并尽可能的保持细胞外基质的完整性^[29]。实验表明，脱细胞处理后的细胞外基质补片不仅能够避免植入材料在机体内引起排异反应发生，同时其支架结构和功能蛋白、糖原蛋白、糖胺聚糖的复杂混合物能够起到优良的结构效应和生化效应^[30]，在硬脑膜、烧伤整形、口腔黏膜等软组织缺损修复方面有着良好的应用^[31]。因此，对细胞外基质中重要生物组分的检测成为了研究者和产业界关注的内容之一。

2.3 糖胺聚糖的特性糖胺聚糖是4类哺乳动物生物高聚物之一，也是结构功能最复杂的。通常情况下，糖胺聚糖以糖脂和蛋白聚糖的形式存在。从结构上看，糖胺聚糖是长链分子，无支链，具有活性阴离子和亲水性，由重复二糖组成的聚合物分子^[32]。现在发现至少有5种糖胺聚糖存在，机体内存在量最大的为透明质酸，也是仅有的一种不含硫酸盐基团且不与蛋白质共价结合的糖胺聚糖^[33]。其余糖胺聚糖(软骨素和硫酸皮肤素)通常与小连接蛋白结合，通过这种结合方式与核心蛋白连接形成蛋白聚糖^[34]。由于糖胺聚糖带有高浓度的负电荷且具有固有的亲水性，因此这些分子能够在机体中吸收大量水分。这些特性使得糖胺聚糖成为了细胞外基质重要的生物活性物质^[35]。研究表明糖胺聚糖通常以蛋白聚糖形式进行聚集，这一现象可增加糖胺聚糖与其他生物高聚物之间的亲和力。此外，糖胺聚糖的聚集会产生高阴离子电荷区，导致高渗透压^[36]。高度负电荷的糖胺聚糖链使得蛋白聚糖具有隔离水合二价阳离子的能力，赋予其空间充填、润滑的功能^[37]。同时，蛋白聚糖的分子多样性为许多生物学功能提供了结构基础^[38]，如软骨中聚集的蛋白聚糖可产生高弹性和高生物机械性，从而能够抵抗压力^[39]。此外，蛋白聚糖也能够与生长因子、受体因子相互作用，在细胞信号的传导和血管生成过程中起到了重要作用^[40]。对蛋白聚糖生理活动的模拟实验显示，蛋白聚糖在细胞外基质中起到的诸多功能，包括保护细胞外基质免受蛋白水解酶活性的影响、调节基质的硬度、抑制血小板的黏附、从纳米层面调节胶原纤维的组装等^[41-42]。

2.4 糖胺聚糖检测方法

2.4.1 高效液相色谱法高效液相色谱法是一个比较敏感的糖胺聚糖定量方法，可以用来量化大部分种类的糖胺聚糖，多用于实验室对微量样品的检测^[43]；同时还能检验葡萄糖胺糖胺聚糖，例如硫酸乙酰肝素、透明质酸和硫酸角质素等是否被半乳糖胺糖胺聚糖如硫酸软骨素、硫酸皮肤素污染，反之亦然^[44]。然而，这种检测方法比较耗时，且需要荧光检测器和Pico-tag水解站的高效液相色谱仪，而大多数实验室难以具备上述仪器。

近来，一类由高效液相色谱法延伸出的检测方法已被开发用于一般碳水化合物分析，研究发现糖胺聚糖完全被水解成非硫酸化糖醛酸和糖胺后进行检测，能够有效检测糖胺聚糖的具体含量^[45]。这个过程仍然需要一个Pico-tag水解站，因为糖胺聚糖比N-或O-连接的寡糖更难水解。该方法对糖胺聚糖进行了酸水解、氢氧化钠还原，邻苯二甲醛和3-巯基丙酸对材料的柱前衍生化，然后使用反相高效液相色谱法对异吲哚衍生物进行荧光检测^[46]。方法为：以含360 pmol去甲亮氨酸为糖胺聚糖为内标，然后用HCl蒸气在N₂气体中在100 ℃下水解3 h；将样品在0.56%NaBH₄中再水合，葡萄糖胺和半乳糖胺会分别被酸还原水解为氨基葡萄糖醇和氨基半乳糖；室温下过夜孵育后，向每个小瓶中加乙酸终止反应；样品用真空离心蒸发浓缩器干燥，并溶于水中，柱前衍生化，最后在硼酸盐中用NaOH调节到pH=9.3；接着将反应混合物的一半注入4.6×250 mm C-12柱，再加入等体积的磷酸钠，加热到35 ℃；在流速为0.8 mL/min时，加入缓冲液B(甲醇、水和四氢呋喃，体积比为70∶30∶3)；注射后，缓冲液浓度B根据时间变化，下柱前衍生化注入序列，在337 nm处激发氨基葡萄糖醇、半乳糖胺醇和糖胺聚糖制剂中所含氨基酸的荧光衍生物，在454 nm处检测^[47]。该方法不适合实验室的日常检测，难以运用于细胞外基质材料生产环节的糖胺聚糖检测^[48]。

2.4.2 糖醛酸定量分析法作为在动物细胞表面和细胞外基质上表达的线性多糖，糖胺聚糖的合成一直处在一个复杂机制的控制下，并且有能力与蛋白质受体结合，所以通过检测糖胺聚糖同其他生物活性相关的反应如糖醛酸化，能够间接定量分析糖胺聚糖的含量^[49]。该方法已被证实能够用于猪主动脉瓣膜中糖胺聚糖含量的定量分析^[50]。方法为：将目标材料冷冻于液氮中，并用生物粉碎机粉碎成末，接着将材料粉末进行低压冻干处理并记录干质量作为标准化对比；冻干处理后的粉末置入4 ℃的氢氧化钠溶液中进行24 h的组织消化，随后用三氯乙酸在4 ℃环境下沉淀蛋白质24 h；沉淀完成后，样品被置入离心机离心并将上清液透析24 h；透析完全后将溶液用氯化十六烷基吡啶在37 ℃下于玻璃离心管中沉淀24 h，然后离心收集沉淀下来的糖胺聚糖，并溶于乙酸钠中，在-20 ℃的环境下使用无水乙醇对糖胺聚糖溶液进行再沉淀；再次离心，收集沉淀物，在氮气下干燥后得到糖胺聚糖球团；将球团溶解于苯甲酸饱和水中，加入硼砂-硫酸试剂，同时对样品进行持续降温。之后将样品在沸水中水浴加热10 min，并冷却至室温；加入咔唑显色剂，再将样品沸水水浴15 min，冷却至室温，在530 nm处测量光吸收率^[51-52]。

2.4.3 乙醣胺定量分析法糖胺聚糖的单一分子量较大，但是聚合度较低，直接分析完整糖胺聚糖分子具有一定的难度，可以通过蛋白酶解或化学降解方式简化分析目标的分散度，该方法中减小分子量对于糖胺聚糖的检测十分关键^[53]。各类糖胺聚糖分子都有对应的降解物，如硫酸软骨素裂解酶、肝素裂解酶等^[54]。这类降解方式可以为糖胺聚糖二糖及寡糖等比色分析提供一个良好的预处理手段，能够针对性地检测特定的糖胺聚糖分子。有实验通过运用猪主动脉瓣膜成功验证了酶解后使用乙醣胺定量分析法检测糖胺聚糖含量的可行性^[55]。实验将瓣膜样品放入95 ℃的真空干燥器中使材料充分干燥，接着将材料放入2 mol/L盐酸中水解20 h，然后将溶液放入氮气下，热水浴干燥，随后将组织水解物和D(+)-葡萄糖胺标准品溶解在2 mL M溶液中，加入碳酸钠和乙酰丙酮后并在96 ℃下孵育1 h，然后依次加入无水乙醇及Ehrlich试剂(对二甲氨基苯甲醛加入50%乙醇和盐酸)。22 ℃下等待45 min，使彩色产物显影，记录540 nm的光吸收率，通过与标准曲线的对比成功得出来样品中糖胺聚糖的实际含量^[56-57]。

2.4.4 二甲基亚甲基蓝检测法染料1，9-二甲基亚甲基是噻嗪变体试剂，该试剂与硫酸化糖胺聚糖结合时诱导变态变化而呈现吸收光谱的变化，能够快速检测溶液中的糖胺聚糖，适合检测各种动物组织样品中的糖胺聚糖总量^[58]。关于1，9-二甲基亚甲基与糖胺聚糖特殊结合已有大量的研究报道，包括使用质谱法对糖胺聚糖进行质谱分析。染料在任何贮存条件下都是不稳定的，无机分析表明不同来源染料的纯度存在多样性，所以使用不纯的染料会导致结果呈假阴性，影响最终结果^[59]。在该检测方法中，1，9-二甲基亚甲基与糖胺聚糖结合后形成的络合物最大吸收波长为525 nm，且该络合物的吸光度与糖胺聚糖浓度呈线性关系，最高质量浓度可达 150 mg/L^[60]。通过计算可得出糖胺聚糖分子的比摩尔消光系数与糖胺聚糖-染料络合物的摩尔吸光度，以及与糖胺聚糖中碳氮含量之间的关系^[61]。研究表明染料会与糖胺聚糖分子上的离子化硫酸盐及羧基发生结合，动物组织样品实验证实了1，9-二甲基亚甲基可以用来分析样品中糖胺聚糖的含量^[58]。简单的步骤如下：将样品冷冻干燥至恒质量，然后将样品置入木瓜蛋白酶缓冲液(125 g/L木瓜蛋白酶，5 mmol/L半胱氨酸-盐酸， 5 mmol/L二钠EDTA，PBS)中60 ℃环境下消化24 h，然后将50 mL样品与1，9-二甲基亚甲基蓝250 mL在96孔中混合，在530 nm处测定微量滴定板和吸光度。通过参考使用不同浓度来自鲨鱼软骨的硫酸软骨素钠盐制备的标准曲线，计算糖胺聚糖含量^[62]。

2.5 基于二甲基亚甲基蓝检测法的改进通过对二甲基亚甲基染料检测方法的研究发现，此方法的灵敏度与样品消化及糖胺聚糖提取步骤有着紧密联系。在该原理的基础上^[58]，通过对比实验比较了普通水浴酶解和磁力搅拌器辅助水浴酶解后的糖胺聚糖提取量，进一步优化样品的消化提取步骤。

该方法使用了Blyscan™ Sulfated Glycosaminoglycan Assays试剂盒(B1000 Std. Kit，110 assays)。针对样品中糖胺聚糖的提取过程，设计了水浴加热和磁力搅拌器辅助2个实验条件。具体的提取方法如下：①配置50 mL糖胺聚糖提取缓冲液：50 mL纯化水，0.06 g Tris， 0.29 g NaCl，1 g NaOH，EDTA 0.46 g；②实验组1消化过程：将50 mg猪心包膜样品加入到60 μL蛋白酶K溶液(20 g/L)中消化，取540 μL糖胺聚糖提取缓冲液，56 ℃条件下水浴酶解，同时采用磁力搅拌器持续搅拌消化24 h；③实验组2消化过程：将50 mg猪心包膜样品加入到30 μL蛋白酶K溶液(20 g/L)中消化，取270 μL糖胺聚糖提取缓冲液，56 ℃条件下水浴酶解，同时采用磁力搅拌器持续搅拌消化12 h，然后12 000 r/min离心10 min，提取上层清液，再次加入30 μL蛋白酶K溶液 (20 g/L)消化，再次取270 μL糖胺聚糖提取缓冲液，磁力搅拌器持续搅拌，56 ℃水浴酶解消化12 h，再次 12 000 r/min离心10 min，提取上层清液，混合2次提取的清液，作为实验组2的酶解液进行检测；④实验组3消化过程: 将50 mg猪心包膜样品加入到60 μL蛋白酶K溶液(20 g/L)中消化，取540 μL糖胺聚糖提取缓冲液，56 ℃水浴锅中水浴酶解24 h。3组样品最终消化结果见图2所示，实验组1中样品的消化程度最好。相比于实验组2与实验组3，实验组1离心管中上清液上方没有表面不溶物的存在，说明实验组1的样品消化程度相对较高，上清液中不含杂质，而实验组2与实验组3的离心管中上清液上方均存在有表面不溶物，且实验组3中不溶物更多。该现象说明实验组2与实验组3中样品的消化程度均不够高，且实验组3消化程度最低。

在检测各组吸光度之后，将去除空白对照组之后的吸光度值带入标准曲线方程，计算出30 µL酶解液中糖胺聚糖含量，再计算出每毫克样品中糖胺聚糖的含量，见图3。结果表明，实验组1的消化方式对糖胺聚糖的提取最为彻底，其检测的糖胺聚糖含量达到了1 mg/g样品，与其余2个实验组尤其是实验组3有着明显的差别。现有文献中测得猪心包膜天然样品中糖胺聚糖含量为0.6 mg/g样品，相较之下，改进了样品消化后的Biocolor试剂盒检测方法提取的糖胺聚糖量更大，检测结果更加接近真实值^[63]。

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引言

细胞外基质是结构蛋白和功能蛋白共同组成的网络，这2种蛋白以独特的组织特异性在细胞与周围组织器官之间进行结构组装^[1]。在机体内，细胞外基质为每个组织和器官提供机械框架，是细胞信号传导的底物，在细胞活动中起着至关重要的作用^[2]。基于这一特性，细胞外基质材料已被广泛用于人体缺损组织或器官的修复重建^[3]。大量研究结果已证明基于细胞外基质的生物材料在通过特定生化技术处理后，可用于受损组织结构性重塑的诱导模板^[4]。具体地讲，细胞外基质材料作为诱导模板具有促进植入物周边组织与植入物顺利相融的功能^[5]。细胞外基质的组分主要包括胶原蛋白、弹性蛋白、纤维连接蛋白、糖胺聚糖及多种生长因子(血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子等)等，这些因子相互作用共同赋予了细胞外基质卓越的生物相容性和修复能力^[6]。在现代再生医学研究领域，动物源性细胞外基质材料已成为了一个新的研究热点。比如，目前常用的生物补片是以动物的真皮、内脏膜等膜材为原材料，采取脱细胞、去除抗原等多种技术以消除动物源材料固有的免疫原性物质^[7]。通过处理后的生物补片已被广泛用于临床治疗中，可改善传统材料存在的异物刺激、无组织重建功能等缺陷^[8]。

动物源性细胞外基质材料多是一种多嵌段复合柔韧材料，主要由胶原、弹性纤维等嵌入无定形基质构成，而无定形基质由游离糖胺聚糖、蛋白聚糖和多种生长因子组成^[9]，因此糖胺聚糖在动物源细胞外基质材料结构组成中有着重要的作用。脱细胞之后的细胞外基质具有较好的组织修复能力，能诱导宿主细胞黏附生长，这一能力也是得益于糖胺聚糖的存在^[10]。研究发现糖胺聚糖是一类体内重要的生物大分子，可通过与体内其他因子诸如细胞黏附因子、酶等结合调节体内复杂的生物学过程^[10]。同时，糖胺聚糖在临床上对抗凝血、炎症反应以肿瘤的转移等病理过程具有辅助作用^[11]。因此在细胞外基质的制作过程中，对多种生物活性物质尤其是糖胺聚糖的保留是非常重要的。建立合适的检测方法对细胞外基质材料的原材料、半成品、成品中糖胺聚糖进行检测，通过各材料中糖胺聚糖含量的变化情况可指导该类材料的工艺优化^[12]。文章归纳总结了国内外近5年来对于动物源细胞外基质中糖胺聚糖的主要检测方法，并总结各方法的利弊。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

讨论

作为当前生物材料领域研究的热点，动物源细胞外基质材料在临床应用上获得了广泛的关注。而在动物源细胞外基质材料处理过程中，各重要组分的检测是十分有意义的，尤其是生物活性物质如糖胺聚糖等。现有的糖胺聚糖检测方法种类繁多，在生物材料研究和开发中起到了重要作用。现有的糖胺聚糖检测方法仍然有许多不足，多数处于实验室阶段或对检测设备要求较多等，难以运用到细胞外基质产业化的检测工作中。①高效液相色谱法：该方法检测结果较为精确，但检测周期过长且不能用于大规模检测，因此无法满足高效大量的产业化检测要求。同时该方法所需的仪器较为昂贵，也是限制其应用受限的另一原因；②糖醛酸分析法：该方法检测结果不够全面，无法直接检测出细胞外基质材料中糖胺聚糖总量。并且这一方法对实验条件要求严格，操作不够便捷，在实际运用中不能很好地应用于糖胺聚糖总量的直接检测^[52]；③乙醣胺定量检测法：该方法使用了针对性的降解物，虽然提升了对降解物对应的糖胺聚糖分子的检测效果，但无法测得糖胺聚糖总量，只适用于针对性的检测某一种糖胺聚糖的含量。实际操作中对细胞外基质的降解和糖胺聚糖的提取过程要求严格，降解不完全会直接影响到最终的检测结果^[57]；④二甲基亚甲基染料检测法：检测时所用染料的不稳定会影响最终的检测结果，但最主要的影响因素还是在对样品酶解、提取糖胺聚糖时，样品消化不彻底导致糖胺聚糖提取不完全，从而影响检测值的真实性^[58]。综上所述，常见的糖胺聚糖检测方法都存在一定的局限性，也影响了这些方法的推广应用。

在已有的研究成果基础上，作者发现二甲基亚甲基染料检测法中对细胞外基质中糖胺聚糖的提取方式存在改善空间：①在糖胺聚糖缓冲提取液中加入NaOH溶液，碱性环境可使得糖胺聚糖更容易被提取出来；②在细胞外基质材料消化过程中加入磁力搅拌器，可有效提升材料的消化效果。文中猪心包膜糖胺聚糖含量检测的对比实验结果显示，对细胞外基质材料消化方法改进后，糖胺聚糖检测值较未改进前有明显提高，并且也明显高于与文献中所报道的数值。因此，改进后的二甲基亚甲基染料方法更适用于细胞外基质材料糖胺聚糖的检测，糖胺聚糖物质提取效率和提取量均有明显提高。

文章通过对二甲基亚甲基染料检测法中糖胺聚糖提取过程的简单改进，验证了对现有糖胺聚糖检测方法改进的可行性，为这些检测方法的改进提供了一种思路。提高糖胺聚糖检测方法的准确性和灵敏度，需要从多方面加以改进，如检测设备、细胞外基质材料处理过程、糖胺聚糖提取方式等。糖胺聚糖是动物源细胞外基质中十分重要的活性物质，可以赋予细胞外基质材料及产品优异的生物活性及促组织修复等功能。糖胺聚糖检测方法是优化细胞外基质材料加工工艺的依据之一，该类方法的优化改进可以更好地促进细胞外基质材料的产业化，并进一步提升细胞外基质产品的临床修复效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

动物源细胞外基质中糖胺聚糖物质的检测方法

Methods for detecting glycosaminoglycan in the extracellular matrix of animal cells

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