3D打印骨科内植物结合低强度全身振动载荷修复骨缺损和有利于骨整合

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1111

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (12): 1870-1874.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1111

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3D打印骨科内植物结合低强度全身振动载荷修复骨缺损和有利于骨整合

黎立¹，赵伊婷²，何世凯³

¹新疆医科大学附属中医医院骨科中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830002；²新疆医科大学第六附属医院检验科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830002；³新疆博尔塔拉蒙古自治州州人民医院骨一科，新疆维吾尔自治区博乐市 833400

出版日期:2019-04-28 发布日期:2019-04-28
通讯作者: 黎立，新疆医科大学附属中医医院骨科中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830002
作者简介:黎立，1981年生，硕士，2013年新疆医科大学毕业，汉族，副主任医师。

Three-dimensional printing orthopedic implants combined with low-intensity whole-body vibration load repairs bone defect and contributes to osseointegration

Li Li¹, Zhao Yiting², He Shikai³

¹Orthopedic Center, Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University, Urumqi 830002, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ²Department of Laboratory Medicine, the Sixth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830002, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ³First Department of Orthopedics, People’s Hospital of Bortala Mongol Autonomous Prefecture, Bole 833400, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Online:2019-04-28 Published:2019-04-28
Contact: Li Li, Orthopedic Center, Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University, Urumqi 830002, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Li Li, Master, Associate chief physician, Orthopedic Center , Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University, Urumqi 830002, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

钛及其合金材料：是常用的骨代替材料，组织亲和度好，与骨组织之间不存在免疫排斥反应，有利于血管的生成，其在骨缺损治疗中的应用较为广泛。

低强度全身振动载荷刺激：作为一种经济、安全且无创的物理介入刺激，可有效抑制骨质疏松和骨量流失，以及提高骨密度，不同参数的低强度全身振动刺激对动物和人体骨骼具有显著的调控作用。

摘要

背景：如何提高钛合金种植体与骨组织的整合以及骨缺损修复效果是治疗骨缺损面临的主要问题。

目的：观察3D打印骨科内植物结合低强度全身振动载荷对骨缺损修复和骨整合效果的影响。

方法：选取24只雄性新西兰大白兔，建立股骨外侧髁缺损模型后随机分成观察组和对照组，每组12只。对照组采用3D打印技术制备多孔钛合金种植体处理，而观察组在对照组基础上使用低强度全身振动载荷处理。比较两组骨缺损模型兔采用不同方式处理后骨组织形态学参数、矿化沉积、骨整合情况及最大拔出力等。

结果与结论：①观察组经全身振动刺激6，12周后，骨组织各参数优于对照组，其中骨小梁相对体积、骨小梁厚度及骨小梁数量显著高于对照组，骨小梁分离度和骨小梁相对表面积显著低于对照组(P < 0.05)；②观察组经全身振动刺激6，12周后，矿化面积比、矿化沉积率、骨形成率和最大拔出力均显著高于对照组，其中两组刺激12周的最大拔出力均显著高于6周(P < 0.05)；③结果证实，3D打印骨科内植物结合低强度全身振动载荷可有效促进骨组织的生长，加快骨缺损修复及提高骨整合效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程
ORCID: 0000-0002-8289-7135(黎立)

关键词: 全身振动载荷, 多孔钛合金, 骨缺损, 骨整合, 3D打印, 骨小梁相对体积, 骨小梁厚度, 骨小梁数量, 骨小梁分离度, 骨小梁相对表面积

Abstract:

BACKGROUND: How to improve the integration of titanium alloy implant with bones and repair results is an important issue in the treatment of bone defects.

OBJECTIVE: To study the effects of three-dimensional printed orthopedic implants combined with low-intensity whole-body vibration load on bone defect repair and osseointegration.

METHODS: Twenty-four male New Zealand white rabbits were selected for establishing the model of lateral condyle of femur, and randomly divided into observation and control groups (n=12 per group). The control group was treated with porous titanium alloy implants by three-dimensional printing technique, while the observation group was treated with low-intensity whole-body vibration load on the basis of the control group. The morphological parameters, mineralization, osseointegration, and maximal extraction force of rabbit bone tissue were compared between two groups.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) At 6 and 12 weeks of whole-body vibration stimulation, the parameters of bone tissue in the observation group were better than those in the control group. The relative volume of trabecular bone, trabecular thickness and trabecular bone in the observation group were significantly higher than those in the control group. The resolution and relative trabecular bone surface area in the observation group were significantly lower than those in the control group (P < 0.05). (2) After 6 and 12 weeks of whole-body vibration stimulation in the observation group, the mineralization area ratio, mineralization deposition rate, bone formation rate and maximum extraction force were significantly higher than those in the control group, and the maximum extraction force in the two groups was significantly higher at 12 weeks than that at 6 weeks (P < 0.05). (3) These results indicate that three-dimensional printing of orthopedic implants combined with low-intensity whole-body vibration load can effectively promote the growth of bone tissue, accelerate the repair of bone defects, and improve the effect of osseointegration.

Key words: Tissue Engineering, Titanium, Femur

中图分类号:

R459.9|R615

黎立，赵伊婷，何世凯. 3D打印骨科内植物结合低强度全身振动载荷修复骨缺损和有利于骨整合[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(12): 1870-1874.

Li Li, Zhao Yiting, He Shikai. Three-dimensional printing orthopedic implants combined with low-intensity whole-body vibration load repairs bone defect and contributes to osseointegration[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(12): 1870-1874.

图/表（结果） 3

参考文献

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引言

骨缺损是矫形外科的常见病，主要由骨肿瘤、创伤及外科手术等引起，具有较高致残率^[1]。如果骨折固定足够稳固，周围软组织及骨床的血供未受到破坏，骨缺损也很有限，只是存在骨折延迟愈合问题，治疗上就需要设法促进骨的诱导成骨，常见治疗方法有骨代替材料移植、异体骨移植及自体骨移植等^[2-3]。

目前临床上可供选择的骨移植替代材料种类繁多，特性不一，实施骨移植必须具备几个基本条件：①植骨部位骨床活性良好；②植骨部位周围软组织床活性良好；③在没有感染的内置入物的一侧植骨；④内固定稳固；⑤治疗骨折的接骨方法得当；⑥植骨部位生物力学载荷适当^[4-5]。钛及其合金材料是常用的骨代替材料，其组织亲和度好，与骨组织之间不存在免疫排斥反应，其中通过3D打印技术制备的多孔结构种植体pTi由于具有有效的孔隙通道，有利于血管的生成，使得在骨缺损的治疗中应用较为广泛^[6-8]。但是在实际研究或应用当中发现，pTi种植体多孔结构内部的骨组织长入和矿化相对缓慢，难以有效完成，同时钛作为惰性金属，不能诱导羟磷灰石沉积成骨，与骨组织形成的机械锁合力相对较弱，从而易引起种植体松动甚至脱落，降低疗效^[9-11]。因此，如何提高pTi种植体与骨组织的整合以及骨缺损修复效果是治疗骨缺损面临的主要问题。

低强度全身振动载荷刺激作为一种经济、安全且无创的物理介入刺激，可有效抑制骨质疏松和骨量流失，以及提高骨密度，不同参数的低强度全身振动刺激对动物和人体骨骼具有显著的调控作用，国内外的大量实验研究证明，低强度全身振动能够有效抑制由失用和绝经导致的骨质疏松，减缓骨量流失，提高骨强度，预防骨折的发生；低强度全身振动能够显著提高正常人群和骨质疏松患者的全身骨量，调控机体的骨转换，低强度全身振动能够显著促进骨折愈合^[12-13]。但对于其是否可提高pTi种植体与骨组织整合以及增加骨长入，从而促进患者骨缺损修复效率和质量的研究并不多见^[14]。

因此，实验以新西兰大白兔为受试对象，通过建立骨缺损模型，以考察pTi种植体结合低强度全身振动载荷对骨缺损修复和骨整合效果的影响，旨在为骨缺损的修复提供新思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 于2016年1月至2018年1月在新疆医科大学附属中医医院骨科中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物健康的24只雄性新西兰大白兔，兔龄七八个月，体质量2.5-3.0 kg，购自浙江省农业科学院，生产许可证：SCXK(浙)2016-0039。实验经新疆医科大学附属中医医院动物伦理委员会批准。

1.3.2 试剂及仪器骨科手术器械购自于上海医疗器械有限公司；X-5000型显微CT(Micro CT)购自于美国 NSI 公司；微米X射线三维成像系统购自于德国YXLON公司等。戊巴比妥钠、EDTA、钙黄绿素购自于美国Sigma公司，Masson染色试剂盒购自于南京森贝伽生物科技有限公司。

1.3.3 植入物信息 M2型3D金属打印机购自于德国Concept Laser公司；Ti-6Al-4 V粉末购自成都惠腾新材料有限公司，粒径分布15-45 µm，松装密度2.5 g/cm³，适应证为骨植入和牙修复等。

1.4 实验方法

1.4.1 pTi的制备参考以往的实验结果^[15]，采用计算机辅助设计技术构建柱状三维结构模型，其中模型高8 mm，底面直径为6 mm，孔隙直径为1 mm，孔隙率约70%，并将设计的模型图纸输入M2型3D金属打印系统中，以Ti-6Al-4 V粉末为原材料进行打印，随后逐层熔融凝固以形成pTi种植体(长12 mm，直径4 mm)，对材料进行超声清洗和辐照灭菌，最终形成均匀的微孔涂层钛合金种植体，用于动物实验。

1.4.2 兔股骨缺损模型的制备及植入干预造模前所有大白兔24只于动物房环境中适应性饲养1周，观察动物无外伤、疾病以及状态正常后，禁食、禁水8 h，称体质量后便可进行造模操作^[16]。

按照体质量大小实验兔肌肉注射盐酸赛拉嗪注射液(0.1 mL/kg)和戊巴比妥钠溶液(1 mL/kg)进行麻醉。待麻醉后用电推剪除左侧后肢毛发，以便暴露左侧股骨及胫骨大部分皮肤，并将动物侧身固定于手术台上。碘伏消毒后常规铺巾，于左侧股骨远端取纵行切口，依次剥离皮肤、筋膜、肌肉及骨膜，并于股骨外侧髁钻缺损区域(直径6 mm，孔深8 mm)，用无菌生理盐水冲洗该区域处的碎骨后，将准备好的pTi种植体植入该缺损区域，缝合好肌肉、筋膜及皮肤即可，一般认为缺损值达到骨直径的1.5-2.0倍即可认为是缺损临界值。

观察组12只通过电磁吸合式振动实验台每天给予动物1 h的低强度全身振动刺激，频率为30 Hz，加速度0.5 g，而对照组12只不做任何操作^[14]。并于6，12周每组分别随机取出6只，麻醉后处死取材检测两组动物的骨组织生长情况。

1.4.3 Micro-CT检查样本取出经处理后用微米X射线三维成像系统扫描，获取样本的三维重建模型，并借助软件计算骨组织各生长参数。主要包括以下5个参数：①骨小梁相对表面积(BS/BV)：骨小梁表面积与骨小梁体积的比值，该值越小则说明骨量越多，修复越好；②骨小梁相对体积(BV/TV)：骨小梁体积占感兴趣区体积的百分比；③骨小梁数量(Tb.N)：其值越大说明骨量越多；④骨小梁厚度(Tb.Th)：骨小梁平均厚度，值越大说明骨量越多；⑤骨小梁分离度(Tb.Sp)：骨小梁之间的平均距离，其值越大说明骨结构越差。

1.4.4 免疫荧光双标染色在荧光显微镜下观察硬组织切片的荧光双标结果。

具体操作如下：修剪所有带有pTi的样本，接着连续进行梯度乙醇脱水，二甲苯透明，包埋。随后将组织放入加满甲基丙烯酸甲酯的包埋烧杯中，抽真空，37 ℃水浴过夜，60 ℃水浴 2 h。于-20 ℃条件下冷冻30 min后取出组织。将包埋块固定于硬组织切片机上，调整高度，切掉样本表面约600 μm后，切出约50 μm厚薄片，置入避光样本袋中待观察。观察前于载玻片上加少量甘油，将薄片放在甘油液滴上，轻按切片，置于荧光共聚焦显微镜下，设置相应波长，分别观察茜素红、钙黄绿素的荧光图像，合并两种图像后通过Image-pro plus 6.0软件测量采集图片的双线间离，前后2次给药间隔10 d的变化。每孔随机选取3个视野，采用网格计数法，计算每100格中矿化结节染色占的格数，记为矿化面积比(MS/BS)。每个视野中的3条标记物条带上各选取10个点，测量条带间距，除以时间即得到骨矿化沉积率(MAR)。以骨缺损区100倍镜下组织为单位，计算骨形成率(BFR/BS)=新形成骨的总面积/观察区域组织总面积。

1.4.5 Masson染色分析待荧光双标检查结束之后，对切片进行Masson染色分析，根据Masson染色试剂盒中操作指示，将骨组织被染成红色，于2倍显微镜下观察红色切片，每孔随机选取3个视野，采用网格计数法，计算pTi内部骨组织占的格数以及pTi区域总格数，计算两者的比值(BAF)。

1.4.6 最大拔出力检测借助微机控制电子万能试验机对两组动物标本进行拔出试验，观察拔出标本的骨整合情况，记录应力-时间曲线，其峰值则为最大拔出力(N)。

具体操作如下：清除股骨髁部骨质，以便充分暴露假体远端的光滑处，将自凝牙托粉混于牙托水，待混合均匀并进入面团期后可缓慢合金管，随即插入股骨，并确保垂直于地面水平线，待进入牙托粉坚硬期后，通过预留孔穿入钢丝绳(直径1 mm)，将钢丝绳、合金管分别固定于微机控制电子万能试验机的两端专门夹具，启动仪器，设置 0.1 m/s的运行速度即可。

1.5 主要观察指标 各组最大拔出力及骨组织形态。

1.6 统计学分析 所有数据均采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，其中计量资料以x(_)±s表示，采用两样本t 检验比较组间差异，P < 0.05说明差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

讨论

骨缺损修复过程中使用骨代替材料移植方法时，主要是通过为损伤骨组织提供稳定的支撑，促进骨的新生，降低松动风险，并给予种植体适宜的生理负荷^[17]。目前，Ti-6Al-4 V已成为骨缺损临床治疗的常见替代材料，其与骨组织进行机械铆合，同时多孔结构可为骨组织生长提供氧气、营养通道，从而促进骨组织血管的生成以及成骨细胞的黏附^[10-11^，^18]。但pTi种植体与骨组织形成的机械锁合力相对较弱，从而易引起种植体松动甚至脱落，延缓预后，将pTi种植体与低强度全身振动载荷结合可作为一种新的思路，为骨损伤的修复和整合提供治疗可能性。因此实验结果显示，观察组经低强度全身振动刺激6周和12周后，骨组织各参数优于对照组，其中骨小梁数量、骨小梁相对体积以及骨小梁厚度显著高于对照组，骨小梁分离度、骨小梁相对表面积显著低于对照组，表明pTi种植体结合低强度全身振动可有效提高骨小梁数量、厚度，以及降低骨小梁分离度，从而促进骨组织长入pTi孔隙内和加快骨损伤修复，延缓骨量流失，增强骨结构完成性，与以往研究者报道相符^[19-20]。研究报道，低强度全身振动作为一种高频、低强度的全身振动刺激，通过改变其加速度、振动频率和作用时间可调控人体的运动系统，例如抑制骨质疏松、延缓骨量流失、提高骨骼强度以及加快骨折愈合等^[21-22]。分析认为，pTi种植体作为稳定的机械支撑材料，其理想的孔隙率和空隙直径为骨组织的生长提供了适宜的环境(氧气、营养物质)，空隙之间的绝对连通更是有利于氧气及营养物质的流通，促进骨组织自身的修复，在此基础上给予低强度的全身振动刺激，由于低强度全身振动可调控一系列与成骨、破骨相关的基因的表达(如Wnt3a，Lrp6及RANKL等)，刺激骨细胞的生长及增殖，从而提高pTi对骨缺损修复效果^[23-25]。

实验结果显示，观察组动物经低强度全身振动刺激6，12周后，矿化面积比、骨矿化沉积率、骨形成率均显著高于对照组，表明pTi种植体结合低强度全身振动可有效提高骨缺损动物pTi种植体邻近骨组织矿化沉积速率和骨生成速率，从而促进pTi种植体周围的骨重建和整合，加快骨缺损修复。分析认为，低强度全身振动刺激可有效上调成骨相关基因碱性磷酸酶、OPG/RANKL、骨形态发生蛋白2及Wnt信号通路相关基因的表达，其中Wnt信号通路促进骨的合成代谢活动，OPG/RANKL则促进破骨细胞的分化和激活，同时还能抑制破骨细胞的凋亡等^[26-27]，通过以上综合作用从而促进pTi中的骨整合和增加骨长入，提高pTi种植体邻近骨组织的形成速率，进而提高骨缺损修复效率和修复质量。实验结果显示，观察组经低强度全身振动刺激6周和12周后，BAF显著高于对照组，同时染色显微图像显示pTi周围附着较多并且均匀骨组织，内部有大量骨组织长入，进一步表明低强度全身振动刺激显著提高了pTi 种植体内部骨组织的整合能力，促进骨损伤修复。Micro-CT检查结果和Masson染色检查相互佐证，证实低强度全身振动能够促进骨组织长入pTi孔隙内，提高pTi种植体的骨整合效率和整合质量，从而利于pTi种植体的长期稳定性^[28]。而最大拔出力检测发现，观察组经低强度全身振动刺激6，12周后的最大拔出力均显著高于对照组，说明pTi种植体结合低强度全身振动可有效提高pTi稳定性，降低其松动、脱落的风险，也从侧面反映其在骨缺损修复和加快结构完整性中的优越性，与实验中的Micro-CT、Masson染色检查及荧光双标检查结果相对应。

综上所述，3D打印骨科内植物结合低强度全身振动载荷可有效促进骨组织的生长，加快骨缺损修复，以及提高骨整合效果，为临床应用提供依据。

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