胚胎干细胞与遗传病模型的构建

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0497

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (17): 2769-2774.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0497

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胚胎干细胞与遗传病模型的构建

邱佳慧，谭季春

中国医科大学附属盛京医院生殖中心生殖二科，辽宁省沈阳市 110022

修回日期:2018-01-15 出版日期:2018-06-18 发布日期:2018-06-18
通讯作者: 谭季春，博士，博士生导师，中国医科大学附属盛京医院生殖中心生殖二科，辽宁省沈阳市 110022
作者简介:邱佳慧，女，1995年生，黑龙江省哈尔滨市人，汉族，中国医科大学附属盛京医院辅助生殖中心在读研究生。
基金资助:
2015年国家高技术研究发展计划(863计划)(2015AA020407)

Embryonic stem cells and construction of a genetic disease model

Qiu Jia-hui, Tan Ji-chun

Second Department of Reproduction, Reproductive Center of Shengjing Hospital, China Medical University, Shenyang 110022, Liaoning Province, China

Revised:2018-01-15 Online:2018-06-18 Published:2018-06-18
Contact: Tan Ji-chun, M.D., Doctoral supervisor, Second Department of Reproduction, Reproductive Center of Shengjing Hospital, China Medical University, Shenyang 110022, Liaoning Province, China
About author:Qiu Jia-hui, Master candidate, Second Department of Reproduction, Reproductive Center of Shengjing Hospital, China Medical University, Shenyang 110022, Liaoning Province, China
Supported by:
the National High-Technology Research and Development Plan of China (863 Program) in 2015, No. 2015AA020407

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
胚胎干细胞：是由哺乳类动物着床前囊胚内细胞团在体外特定条件下培养和扩增所获得的一种多能性干细胞。在体外培养过程中，胚胎干细胞可以长期地进行自我复制，并保留其多向分化的潜能。目前，胚胎干细胞主要应用于早期胚胎发育的研究、再生医学、疾病模型的构建等。
诱导多能干细胞：是利用体细胞体外重编程技术而获得的一类具有自我复制更新能力的多潜能细胞。通过向成体细胞转入4种特定的转录因子OSMK(Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc)，使成体细胞恢复其多能性。与胚胎干细胞相似，在一定条件下，诱导多能干细胞可分化成多种组织细胞，因此诱导多能干细胞也可用于遗传疾病模型的构建，广泛应用于疾病发生机制的探究、药物筛选等。建立患者来源的遗传物质改变的人诱导多能干细胞系是遗传病研究的一个非常重要的手段。由于外源基因的引入以及重编程效率等问题的存在，也严重限制了诱导多能干细胞的应用，近年来随着技术的发展，重编程技术也有较高的提升。但与胚胎干细胞相比，二者仍然是各有利弊，相互补充更有利于遗传病的研究。

摘要
背景：胚胎干细胞是一种多能性干细胞，具有发育的多能性和无限的自我更新能力，广泛应用于生物学领域的各项研究中。
目的：对胚胎干细胞的体外培养及人胚胎干细胞构建遗传疾病模型的意义、方法、应用、发展前景进行概述。
方法：在标题和摘要中，以“embryonic stem cell, genetic diseases”为主题检索词，检索PubMed数据库中的所有胚胎干细胞相关文献。优先选择近期发表在权威杂志上的文章。最终筛选得到43篇文献进行综述.
结果与结论：在遗传学领域中，利用人胚胎干细胞构建的遗传病模型已广泛应用于单基因遗传病以及染色体异常疾病的研究，其能克服传统的动物模型和细胞模型的局限性，更有利于对遗传疾病的病理过程、分子机制等进行研究。但由于人胚胎干细胞的来源为植入前的早期胚胎，其应用也存在一定的伦理争议，目前人们仍处于不断探索中。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-2986-0093(邱佳慧)

关键词: 胚胎干细胞, 遗传疾病, 疾病模型, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Embryonic stem cells are pluripotent stem cells that can differentiate into all cell types and propagate themselves indefinitely in vitro, which have been used widely in biological research.
OBJECTIVE: To summarize the culture methods of embryonic stem cells in vitro, as well as the significance, methods, clinical applications of embryonic stem cells as genetic disease models.
METHODS: Relevant articles were searched in PubMed using the key words of “embryonic stem cell, genetic diseases” which appeared in the titles and abstracts. The latest articles were preferred. Totally 43 eligible articles were obtained for result analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: In the genetics study, embryonic stem cells have been widely used to construct monogenic and chromosome disease models, which can make up the limitations of animal and cell models. Models constructed by embryonic stem cells are conducive to the investigations on pathological processes and molecular mechanisms of genetic diseases. But there are also some ethic disputes on the use of embryonic stem cells, which need further studies.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Embryonic Stem Cells, Models, Genetic, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

邱佳慧，谭季春. 胚胎干细胞与遗传病模型的构建[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(17): 2769-2774.

Qiu Jia-hui, Tan Ji-chun. Embryonic stem cells and construction of a genetic disease model[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(17): 2769-2774.

图/表（结果） 2

2.1 胚胎干细胞

2.1.1 胚胎干细胞的特征 胚胎干细胞是由哺乳类动物着床前囊胚内细胞团在体外特定条件下培养和扩增所获得的一种多能性干细胞。早在20世纪80年代初Evans等^[1]就成功地从小鼠囊胚内分离出了小鼠胚胎干细胞。Martin等^[2]也几乎同时建立了小鼠胚胎干细胞系。随后研究者又分离出其他哺乳动物的胚胎干细胞。而人胚胎干细胞的分离却没预想中顺利，1994年Bongso等^[3]从人囊胚的内细胞团分离出了人胚胎干细胞，但是很遗憾并没有建系成功。直到1998年，研究者才从体外受精5 d的人囊胚中成功分离出世界首株人胚胎干细胞^[4]。胚胎干细胞具有两大基本特征：无限的自我更新能力和分化的多能性。在体外培养过程中，胚胎干细胞可以长期进行自我复制，并保留其多向分化潜能。目前，胚胎干细胞主要应用于早期胚胎发育的研究、再生医学、疾病模型的构建等。

2.1.2 胚胎干细胞的获取与培养 随着技术的发展，目前已有成百上千的人胚胎干细胞系被建立。人胚胎干细胞来源于囊胚期的内细胞团，其获取主要有两种方式：免疫手术法、机械分离法。免疫手术法中使用了动物源性的产物，容易引起动物源性的污染，导致获取的人胚胎干细胞在后续应用中受限。机械手术法有效地避免了该问题，更适合有临床用途的人胚胎干细胞的培养^[5]。此外，激光打孔法也被应用到内细胞团的分离上^[6]。

人胚胎干细胞的体外培养过程既要保持胚胎干细胞自我更新能力又要维持其多能性，因而人胚胎干细胞的培养需要特殊的培养液及饲养层支持。常常需要在培养液中加入一些可以抑制胚胎干细胞分化的因子，如白细胞抑制因子。研究表明饲养层也可分泌特殊的生长因子以维持胚胎干细胞特征^[7-11]。去除这些可以抑制胚胎干细胞分化的因子，通过体外悬浮培养，胚胎干细胞可分化为包含三胚层组织结构的拟胚体^[12]。1998年第1例人胚胎干细胞的建系选择了小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层^[4]。该种饲养层一直被沿用至今，但是为了排除动物源性的干扰，在人胚胎干细胞的培养中(图1)，人们也开始尝试利用人源性的细胞作为饲养层，如输卵管上皮细胞、胎儿肌肉细胞、骨髓、羊膜上皮、人皮肤成纤维细胞、胎盘成纤维细胞等^[13-17]。近年来，研究者也开始尝试无饲养层培养方法，通过在培养瓶中加入适量的matrigel，并在培养基加入一定的生长因子，经实验证实该无饲养层培养条件能使胚胎干细胞在多次传代后维持其形态及多能性，并具有稳定的核型，能够形成胚体分化成内胚层、外胚层、中胚层^[18]。胚胎干细胞的体外培养是一个十分复杂且精细的过程，早期的一些研究中体外培养的胚胎干细胞只具有胚内发育潜能。2017年1月美国加州大学伯克利分校何琳教授研究团队发表在《Science》的一篇研究论文报道中通过移除一种名叫miR-34a的微RNA，成功使老鼠胚胎干细胞表现出类似受精卵的发育特性，能够分化成胚胎组织和胚胎外组织^[19]。而2017年4月《Cell》上发表的一篇文章的研究结果突破了人胚胎干细胞体外培养的局限性，在该研究中邓宏魁等通过筛选建立了一种被称为LCDM的培养体系，这个培养体系可诱导产生具有胚内和胚外发育潜能的小鼠和人干细胞系，该团队将其称为扩展多能干细胞^[20]。最新的一项研究表明胚胎干细胞的潜能性可能与pramel7蛋白的表达相关，该蛋白通过介导DNA的甲基化而决定胚胎干细胞的分化状态，因而体外培养过程种可通过影响pramel7的表达而使体外培养的胚胎干细胞具有“全能性”^[21-22]。

2.1.3 胚胎干细胞的细胞学鉴定 通过对胚胎干细胞的基本形态、生长特点、核型、多能性以及表面标记等特点进行鉴定。通常包括以下几个方面：①细胞的来源；②细胞在体外培养过程中能维持稳定增殖而不分化的状态；③体外长期培养后细胞核型分析；④体内或体外多向分化潜能；⑤OCT-4、NANOG、SOX2等基因表达情况^[23-24]。目前鉴定胚胎干细胞的常用生物学方法包括碱性磷酸酶染色实验、细胞免疫荧光、流式细胞技术、拟胚体实验、体外畸胎瘤形成实验、核型分析等。

2.2 利用人胚胎干细胞构建遗传病的意义 遗传病是以遗传物质变化为基本特征的疾病，具有先天性、终身性和家族性的特点。中国是遗传病的高发国家，有1/4-1/5的人患有各种类型的遗传病，每年出生的先天残疾儿总数高达80万-120万，占每年出生总人口的4%-6%。遗传病严重降低了患儿的生活质量，给家庭及社会造成严重的经济、精神负担。目前已发现的7 000种罕见病中，有80%是由遗传变异引起的，严重威胁人类的健康。根据遗传物质在细胞不同层次的改变，可将其分为染色体病、单基因病、多基因病、体细胞遗传病。目前，遗传病的研究手段主要有细胞模型、动物模型的构建以及分子水平研究等。由于小鼠基因编辑的易操作性，与体外细胞模型相比，小鼠模型可获得更全面的信息，小鼠模型的应用较为广泛。但是由于物种特异性，人和小鼠在发育、遗传、生理上存在很大差异^[25]。这导致通过基因编辑构建的人类遗传病小鼠模型有时无法产生与人类相同的表型。如具有囊性纤维化变异的小鼠在出现呼吸症状前常死于肠梗阻，基因编辑所获得的小鼠Lesch-Nyham综合征模型常不出现和人类相似的症状^[26]。非整倍体常导致人类流产，而有单个X染色体的小鼠却有可能存活^[27]。同时，Perel等^[28]也对动物实验的有效性提出质疑，其对比了同种治疗方法在临床试验和动物实验中的治疗效果，发现在一些疾病上两者的疗效并不一致。另一方面，研究中所用的细胞模型通常是取材于患者的体细胞，部分疾病因发病特点和伦理学限制，导致携带某一疾病表型的原代细胞来源受限，且常存在不易分离和无法长期进行体外培养等问题，因而很难构建理想的细胞模型。1998年Thomson等人成功分离出人胚胎干细胞，为克服上述疾病模型存在的问题提供了新策略。

2.3 利用人胚胎干细胞构建遗传病模型的方法 2003年Zwaka等^[29]首次发表了对人胚胎干细胞进行同源基因重组操作的文章。随后，Urbach等^[30]利用人胚胎干细胞构建了Lesch-Nyham综合征的疾病模型。自此人们开始通过对人胚胎干细胞进行核基因组编辑构建各种类型的携带遗传病致病基因的胚胎干细胞系。但由于受到基因打靶技术的限制，人胚胎干细胞的基因编辑效率不高。目前，常用的基因编辑手段有锌指核酸酶技术、转录激活样效应因子核酸酶技术及成簇规律间隔短回文重复技术。3种方法的普及应用，显著提高了胚胎干细胞的基因编辑效率，为利用胚胎干细胞构建遗传疾病细胞模型提供更坚实的基础。另一方面，近年来随着人类辅助生殖技术的应用，利用产前基因诊断(PGD)和产前基因筛查(PGS)可获得含有特定基因变异的人胚胎干细胞，该类人胚胎干细胞取自废弃的胚胎，成功地回避了伦理学争议，因此也被广泛应用于人类遗传病模型的构建。目前已经利用PGD/PGS技术建立了多种遗传病的细胞系，如马凡氏综合征、脆性X染色体综合征、良性假肥大型肌营养不良、乙型血友病、囊性纤维化、肌强直性营养不良等^[31-35]。除上述两种方法外，2014年Tachibana等^[36]通过将体细胞核移植入去核的卵母细胞成功地建立了一种多能干细胞，该类干细胞与胚胎干细胞具有相似的性质，理论上也可被应用于遗传病模型的建立。携带遗传疾病致病基因的胚胎干细胞在体外可分化成各种类型的成体细胞，进而模拟遗传病的发生发展，以期探究遗传病的发生机制特点等，寻找疾病治愈的新方法。

2.3.1 常用基因编辑技术

锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease，ZFN)技术：锌指核酸酶是第1代人工合成的限制性内切酶，由锌指DNA结合域与限制性内切酶的DNA切割域组成。研究者可根据不同的目的基因设计特异性的锌指核酸酶，该技术既可用于导入目的基因，也可用于敲出目的基因。锌指核酸酶技术简单易行，具有较高的特异性和基因编辑效率。但同时，锌指核酸酶技术也存在许多不足之处，最显著的问题就是其在基因剪切过程有较高的脱靶效应，导致核酸内切酶并没有对目的基因进行识别和切割，最终可能引起DNA的错配和序列的改变^[37]。

转录激活样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)技术：转录激活样效应因子核酸酶被认为是第2代人工合成的限制性内切酶，与锌指核酸酶相似，该类嵌合核酸酶由两部分组成，即1个可编码的序列特异性DNA结合模块与1个非特异性的DNA切割结构域。通过诱导DNA双链断裂来刺激容易出错的非同源末端连接或在特定基因所在的位置进行同源定向修复。一项研究中运用锌指核酸酶技术和转录激活样效应因子核酸酶技术分别作用在相同的基因位点CCR5上，相比于锌指核酸酶技术，转录激活样效应因子核酸酶技术在CCR5相似的作用位点CCR2上有较低脱靶效应^[38]。转录激活样效应因子核酸酶技术的缺点在于其分子质量较大，使其在运送到细胞体内产生一定麻烦，因而限制了它的应用。

成簇规律间隔短回文重复(clustered regulatoryinterspaced short palindromic repeat，CRISPR)技术：该系统起初是在细菌的天然免疫系统内发现的，其主要功能是抵抗入侵的病毒及外源DNA，能使其特异性降解，从而起到抗病毒的作用^{[39- 40]}。CRISPR/Cas系统由CRISPR序列原件与cas基因家族组成。目前，共有3种类型的CRISPR/Cas系统，2型系统是目前研究应用最多的，也就是常用的CRISPR/Cas9系统。与锌指核酸酶、转录激活样效应因子核酸酶不同的是，它能够完成RNA导向的DNA识别及编辑。该技术靶向精确、脱靶率低、细胞毒性低、价格更有优势。但是也存在特异性不高，容易产生随机毒性等缺点。

3种基因编辑方法比较，见表1。

2.3.2 胚胎植入前遗传学诊断与植入前非整倍体筛查(PGD/PGS) 胚胎植入前遗传学诊断(pre-implantation genetic diagnosis，PGD)是指通过体外受精技术获得具有染色体病或基因病的夫妇的卵或早期胚胎进行遗传学分析，以挑选不携带疾病致病基因的胚胎植入子宫，从而避免了患有遗传疾病的患儿出生。胚胎植入前遗传学筛查(pre-implantation genetic screening for aneuploidy，PGS)是指在胚胎植入着床前，通过对早期胚胎进行染色体数目分析，检测胚胎是否具有正常的染色体数目，以挑选整倍体的胚胎植入子宫，可提高辅助生殖治疗中预后不良妇女的助孕成功率，有效降低流产率。

2.4 利用人胚胎干细胞构建不同类型的遗传病及其应用 人胚胎干细胞是一种很好的遗传病载体。目前，人胚胎干细胞更适宜单基因遗传病和染色体异常遗传病的模型建立。主要通过对人胚胎干细胞的疾病相关致病基因进行编辑^[30]，或利用PGD/PGS技术诊断存在问题的胚胎获取胚胎干细胞^[41-42]。现阶段由于多基因遗传病十分复杂，尚无有效的手段进行诊断，因而利用胚胎干细胞建立多基因遗传病的疾病模型仍是一个挑战。人胚胎干细胞遗传病模型的建立可弥补传统遗传疾病模型的不足之处，通过体外再分化模拟疾病的发生发展过程，不仅可以用于了解疾病的相关机制，还可以用于药物筛选，促进新药的研发，是遗传疾病领域研究的一种有效方法。

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引言

材料方法

讨论

人胚胎干细胞作为一种多能干细胞一直备受关注。它可以应用于生物学领域的各项研究中，如胚胎发育、干细胞治疗、遗传病研究等诸多方面。然而人胚胎干细胞虽然具有很多优势，但却一直受到伦理学的限制，一些国家甚至禁止胚胎干细胞的相关研究。诱导多能干细胞的出现更使胚胎干细胞的研究失去吸引力，诱导多能干细胞取自成体体细胞，通过慢病毒、反转录病毒、仙台病毒、游离载体等方法对细胞进行重编程，使细胞表达4种特定的转录因子OKSM(Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc)，从而使其“返老还童”恢复其多能性^[43]。诱导多能干细胞和胚胎干细胞性能相似，研究者常利用遗传病患者的体细胞诱导成多能干细胞，从而用于遗传病模型的建立，避免了人胚胎干细胞所带来的伦理学问题。但是人胚胎干细胞从此将消失在历史的舞台上吗？结果是否定的，原因主要是以下几方面：①诱导多能干细胞的操作过程十分复杂，重编程效率较低，并且目前诱导多能干细胞仍延续了胚胎干细胞的技术路线，距其应用仍有很长的路要走；②PGD确诊后的废弃胚胎来源的人胚胎干细胞回避了伦理问题，且过程较为简便，随着技术的发展和对遗传病的认知，更多种类的遗传病可利用PGD辅助生殖，也就意味着将有更多的遗传病可利用人胚胎干细胞构建疾病模型；③目前研究表明来源于不同成体细胞的诱导多能干细胞均存在来源组织的后天记忆效应，诱导多能干细胞并不完全等同于胚胎干细胞；④人胚胎干细胞和诱导多能干细胞为同一种疾病建立疾病模型的对比结果可提示表观遗传学对疾病的影响，两种干细胞在遗传病的研究中各有利弊，可相互补充，更有利于对遗传病的研究。因此，诱导多能干细胞还不可能完全替代人胚胎干细胞，相反人胚胎干细胞可作为诱导多能干细胞的金标准指导诱导多能干细胞的发展。目前，随着科学工作者们的深入探索，生物学技术的发展，过去几十年里胚胎干细胞的培养效率显著增加，为胚胎干细胞的蓬勃发展提供了有利且必要的基础条件。近几年来基因编辑技术的不断革新，更为胚胎干细胞的研究提供了新的方向和平台。因此，胚胎干细胞在遗传学领域仍有着巨大的研究前景。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

胚胎干细胞与遗传病模型的构建

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