1，25(OH)2D3对脂肪干细胞分泌Ⅰ型胶原的影响及作用机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0466

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (9): 1370-1375.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0466

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1，25(OH)₂D₃对脂肪干细胞分泌Ⅰ型胶原的影响及作用机制

翟敏¹，胡晓根²，刘虹麟¹，许世清¹，王在¹，张文健¹

中日友好医院，¹临床医学研究所，²整形外科，北京市 100029

修回日期:2018-01-29 出版日期:2018-03-28 发布日期:2018-04-03
通讯作者: 张文健，博士，硕士生导师，教授，研究员，中日友好医院临床医学研究所，北京市 100029；并列通讯作者：王在，博士，副研究员，中日友好医院临床医学研究所，北京市 100029
作者简介:翟敏，女，1989年生，山东省济南市人，汉族，中日友好医院临床医学研究所在读硕士，主要从事干细胞诱导分化等方面的研究工作。
基金资助:
国家自然科学基金(81370873，81402451)；中日友好医院青年科技英才计划(2015-QNYC-B-06)

Effect of 1,25(OH)₂D₃ on type I collagen secretion in adipose-derived mesenchymal stem cells and its mechanism

Zhai Min¹, Hu Xiao-gen², Liu Hong-lin¹, Xu Shi-qing¹, Wang Zai¹, Zhang Wen-jian¹

¹Institute of Clinical Medical Sciences, ²Department of Plastic Surgery, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029, China

Revised:2018-01-29 Online:2018-03-28 Published:2018-04-03
Contact: Zhang Wen-jian, Ph.D., Master’s supervisor, Professor, Investigator, Institute of Clinical Medical Sciences, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029, China； Wang Zai, M.D., Associate investigator, Institute of Clinical Medical Sciences, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029, China
About author:Zhai Min, Master candidate, Institute of Clinical Medical Sciences, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81370873, 81402451; the Talent Youth Plan of the China-Japan Friendship Hospital, No. 2015-QNYC-B-06

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
创面愈合：指体内外因素使皮肤等组织出现离断或缺损后的修复过程，大致可分为止血期、炎症期、增生期、重塑期4个阶段。对于正常愈合过程，上述4个阶段必须以正确的顺序在特定的时间内完成，超过6-8周即可认为慢性创面愈合不良。
Ⅰ型胶原：胶原蛋白是动物体中普遍存在的一种大分子蛋白，在哺乳动物中的含量是整个生物体自身总蛋白含量的1/4。Ⅰ型胶原蛋白在骨骼与结缔组织中发挥作用的主要方式是形成和保持骨架的完整性；除此之外，胶原在形成特定的细胞外微环境中也起到主要作用，而这些微环境对于维持细胞的完整性及传递细胞外信号非常关键。

摘要
背景：脂肪间充质干细胞具有促进创伤修复的作用，但其分泌的Ⅰ型胶原会促进瘢痕形成，因此，寻找抑制脂肪间充质干细胞分泌胶原的方法将进一步增强其应用价值。
目的：观察1，25(OH)₂D₃对脂肪间充质干细胞分泌Ⅰ型胶原的影响及其作用机制。
方法：①利用胶原酶消化法分离培养人脂肪间充质干细胞，将第4代脂肪间充质干细胞分别培养在含不同浓度(10^-⁷，10^-⁸，10^-⁹，10^-¹⁰，0 mol/L)1，25(OH)₂D₃的DMEM/F12培养基中干预4 d，收集细胞培养上清，采用ELISA方法检测Ⅰ型胶原水平；②选取1，25(OH)₂D₃抑制Ⅰ型胶原分泌作用最明显的浓度对脂肪间充质干细胞进行干预，通过Real-time PCR检测1，25 (OH)₂D₃干预前后细胞内Smad3的mRNA表达，Western blot检测1，25(OH)₂D₃干预前后细胞内Smad3总蛋白和磷酸化蛋白表达；③在1，25(OH)₂D₃干预基础上加入SMAD3抑制剂SIS3对脂肪间充质干细胞进行干预，4 d后收集细胞培养上清，采用ELISA方法检测Ⅰ型胶原水平，以分析Smad3信号通路在其中的作用。
结果与结论：①1，25(OH)₂D₃对人脂肪间充质干细胞分泌Ⅰ型胶原的影响表现为剂量依赖性抑制作用；②Real-time PCR和Western blot结果显示1，25(OH)₂D₃干预后Smad3表达水平有一定升高；Western blot结果显示磷酸化Smad3蛋白含量显著升高；③Smad3抑制剂可阻断1，25(OH)₂D₃对Ⅰ型胶原分泌的抑制作用；④这些结果表明，1，25(OH)₂D₃可能通过上调Smad3的表达及活性来抑制人脂肪间充质干细胞分泌Ⅰ型胶原。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-5112-1115(翟敏)

关键词: 人脂肪间充质干细胞, 1, 25(OH)₂D₃, Ⅰ型胶原, SMAD3, 瘢痕, 干细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Adipose-derived mesenchymal stem cells (ADMSCs) have been reported to improve wound healing. However, type I collagen secreted by ADMSCs will contribute to scar formation. Therefore, inhibiting type I collagen secretion from ADMSCs will strengthen its clinical application.
OBJECTIVE: To investigate the effect of 1,25(OH)₂D₃ on secretion of type I collagen by ADMSCs and its mechanism.
METHODS: Human ADMSCs were isolated by collagenase digestion, and identified by flow cytometry. ADMSCs at passage 4 were cultured in DMEM/F12 medium containing different concentrations of 1,25(OH)₂D₃ (10^-⁷, 10^-⁸, 10^-⁹, 10^-¹⁰ and 0 mol/L) respectively for 4 days. Then, the concentration of type I collagen in cell supernatant was measured by ELISA. Real-time PCR and western blot were used to detect the expression of Smad3 at mRNA and protein levels and phosphorylated protein Smad3 level in ADMSCs cultured with and without 1,25(OH)₂D₃. To analyze the contribution of Smad3 to the effect of 1,25(OH)₂D₃, Smad3 inhibitor was added to culture medium 30 minutes before adding 1,25(OH)₂D₃, and type I collagen in cell supernatant was detected by ELISA at 4 days after addition of SMAD3 inhibitor.
RESULTS AND CONCLUSION: 1,25(OH)₂D₃ inhibited the secretion of type I collagen by ADMSCs in a dose-dependent manner. The results of real-time PCR and western blot showed that the expression of Smad3 was upregulated by 1,25(OH)₂D₃, and the results of western blot showed that the phosphorylated Smad3 protein level in ADMSCs was significantly increased by 1,25(OH)₂D₃. Moreover, the inhibition of type I collagen secretion by 1,25(OH)₂D₃could be blocked by Smad3 inhibitor. These results indicate that 1,25(OH)₂D₃ can inhibit the secretion of type I collagen from ADMSCs by up-regulating the expression of Smad3.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Adipose Tissue, Mesenchymal Stem Cells, Calcitriol, Collagen Type I, Smad3 Protein, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

翟敏，胡晓根，刘虹麟，许世清，王在，张文健. 1，25(OH)₂D₃对脂肪干细胞分泌Ⅰ型胶原的影响及作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(9): 1370-1375.

Zhai Min, Hu Xiao-gen, Liu Hong-lin, Xu Shi-qing, Wang Zai, Zhang Wen-jian. Effect of 1,25(OH)₂D₃ on type I collagen secretion in adipose-derived mesenchymal stem cells and its mechanism[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(9): 1370-1375.

图/表（结果） 1

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引言

大面积深度烧伤、慢性难愈性创面及瘢痕修复一直以来都是临床治疗的难点。皮肤创面愈合涉及炎症反应、细胞增殖、细胞迁移、再上皮化、血管生成、细胞外基质沉积以及重塑等多方面^[1]，是一个较复杂的多因素过程。除了胚胎期皮肤损伤以及口腔黏膜损伤可以得到无瘢痕修复外，几乎所有损伤的修复都伴随瘢痕形成。而在面部生成的瘢痕组织，会对患者，特别是儿童，产生生理上和心理上的不良影响。瘢痕的形成主要源于Ⅰ型胶原的分泌，因此，如何在创伤愈合的过程中减少Ⅰ型胶原的分泌具有重要的研究意义^[2]。

脂肪来源间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs)是近年来发现的一种成体干细胞，可来源于人体各处的脂肪组织，并且具有取材容易、量大、损伤小、可反复取材、增殖快速等优点，有望成为优良的自体组织工程种子细胞。近年来随着干细胞研究的不断深入，体内外实验证明脂肪干细胞可以有效促进皮肤创面愈合^[3-4]。但是，脂肪干细胞本身具有较强的分泌Ⅰ型胶原的能力^[5]，对瘢痕形成可能起到促进作用，因此，寻找抑制脂肪干细胞分泌Ⅰ型胶原的因子将有助于改善脂肪干细胞的临床应用效果。实验证明，外源性的细胞因子对脂肪间充质干细胞的分泌功能具有一定的调节作用。如Thielitz等^[6]的体内实验结果显示：DPP4抑制剂可通过减少胶原蛋白的产生和转化生长因子β1的表达来抑制瘢痕性纤维母细胞和正常成纤维细胞的纤维化表型，进而减少皮肤瘢痕形成。

维生素D既是一种脂溶性维生素，也是一种类固醇激素，其生理作用非常广泛，活性形式为1，25(OH)₂D₃，其除了广为人知的参与体内钙磷代谢外，还具有调节细胞增殖和分化、影响淋巴细胞激活、刺激胰岛素分泌等多种作用。实验探讨1，25(OH)₂D₃对脂肪间充质干细胞分泌Ⅰ型胶原的影响及机制，为进一步改善脂肪间充质干细胞的临床应用效果提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察。

1.2 时间及地点 于2017年11月4日在中日友好医院临床研究所病理生理实验室完成。

1.3 材料 中日友好医院整形科吸脂手术吸弃的脂肪组织，标本的采集获得患者知情同意。1，25(OH)₂D₃(Sigma公司)；胎牛血清(Biological Industries公司)；DMEM/F12、胰酶(Invitrogen公司)；ELISA试剂盒(Cusabio公司)；间充质干细胞鉴定流式试剂盒(BD公司)；成脂、成骨诱导分化培养基(百恩维公司)；油红O、茜素红(杰美公司)；SMAD3抑制剂SIS3(Selleckchem公司)；SMAD3抗体(CST公司)；RNA提取试剂盒(QIAGEN公司)；反转录试剂盒(Promega公司)；Real-time PCR Mix(TOYOBO公司)；7500型实时荧光定量PCR仪(ABI公司)；SMAD3引物序列由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

1.4 实验方法

1.4.1 人脂肪间充质干细胞的分离培养与鉴定 将去除血管、筋膜的脂肪组织置于平皿中，PBS洗3次后剪碎，加入1倍体积的0.2%胶原酶Ⅰ，37 ℃消化30 min，终止消化后于细胞筛上过滤，1 500 r/min离心5 min，收集细胞，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬接种于培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5%的CO₂培养箱中常规培养，2 d后首次换液，细胞长至90%汇合后进行传代。通过流式细胞术检测表面抗原表达以及进行成脂、成骨诱导分化对其进行鉴定。取第4代生长良好的脂肪间充质干细胞进行实验。

1.4.2 ELISA检测Ⅰ型胶原的分泌 将脂肪间充质干细胞以4×10⁷ L^-¹的细胞浓度接种于24孔板中，待细胞贴壁后分别加入含10^-⁷，10^-⁸，10^-⁹，10^-¹⁰ mol/L 4种不同浓度的1，25(OH)₂D₃及不含1，25(OH)₂D₃的基础培养基(含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基)，培养4 d后，收集细胞培养上清，离心，按照试剂盒说明，采用ELISA方法检测Ⅰ型胶原水平。依据实验结果，选取1，25(OH)₂D₃抑制Ⅰ型胶原分泌作用最明显的浓度对脂肪间充质干细胞进行干预，另外，在1，25(OH)₂D₃干预基础上加入SMAD3抑制剂SIS3对脂肪间充质干细胞进行干预，以不含1，25(OH)₂D₃的基础培养基培养脂肪干细胞为对照，4 d后收集细胞培养上清，离心后按照试剂盒说明，采用ELISA方法检测Ⅰ型胶原水平。

1.4.3 Real-time PCR检测SMAD3 mRNA的表达 将4×10⁵脂肪间充质干细胞接种于T25培养瓶中，待细胞贴壁后分成2组，对照组继续用基础培养基培养，1，25(OH)₂D₃组用添加了10^-⁸ mol/L 1，25(OH)₂D₃的基础培养基干预4 d。使用总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，使用反转录试剂盒将2 μg总RNA进行反转录。以上操作均按照试剂盒说明进行。采用荧光染料法进行real-time PCR检测。所用引物序列为：SMAD3上游引物：5’-CCA TCT CCT ACT ACG AGC TGA A-3’，下游引物：5’-CAC TGC TGC ATT CCT GTT GAC-3’。内参β-actin上游引物：5’-CTC CAT CCT GGC CTC GCT GT-3’，下游引物：5’-GCT GTC ACC TTC ACC GTT CC-3’。结果采用2^-^??Ct方法计算和分析。

1.4.4 Western blot检测SMAD3和P-SMAD3蛋白的表达 将脂肪间充质干细胞按上述分组干预4 d，提取细胞总蛋白并采用BCA法进行蛋白定量，加入上样缓冲液后于100 ℃孵育3 min使其变性，取100 μg总蛋白进行SDS-PAGE，然后将蛋白转印至PVDF膜上。经5%脱脂奶粉封闭后，加入一抗(兔抗人SMAD3、P-SMAD3抗体，1︰1 000稀释)于4 ℃冰箱过夜，加入二抗(1︰10 000稀释)室温孵育1 h，使用ECL化学发光试剂盒显色，BIO-RAD凝胶成像系统采集图像并进行结果分析。

1.5 主要观察指标 ①通过形态学、表面标志、成脂成骨诱导分化能力对脂肪间充质干细胞进行鉴定；②通过分析细胞培养上清中Ⅰ型胶原水平，分析1，25 (OH)₂D₃的作用；③通过检测SMAD3的mRNA和蛋白表达，分析1，25(OH)₂D₃的作用机制。

1.6 统计学分析 采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，数据用x(_)±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

细胞治疗的关键问题是寻找合适的种子细胞，理想的种子细胞应具备可靠的细胞来源、容易获得、能在体外可快速扩增培养等条件^[7-8]。20世纪60年代Rodbell和他的团队^[9]就开始从脂肪组织中分离细胞，但由于技术等原因他们并未发现干细胞。随着分离技术的不断发展，Zuk等^[10]于2001年通过免疫荧光和流式细胞术发现脂肪组织中具有多向分化潜能的干细胞亚群，将其命名为脂肪组织提取细胞，并于次年证实了干细胞的存在，正式命名为脂肪来源干细胞^[11]。脂肪间充质干细胞来源于中胚层，存在于人体各处脂肪组织中，在一定条件下具有向脂肪、肌腱、肌肉、骨、软骨和神经元分化的潜能^[12-14]，且含量丰富，1 g脂肪组织可提取约5×10³个脂肪间充质干细胞，大约是1 g骨髓中获取干细胞数量的500倍^[15]，其可由临床手术废弃脂肪中获得，取材安全简单，对机体的损伤小，能规避一系列的伦理问题，被认为是应用前景最好的种子细胞之一^[16-17]。脂肪间充质干细胞促进创伤修复的作用已经得到大量数据证实，但瘢痕形成是创伤修复后的一个主要问题，因此，如果能够最大化减少瘢痕形成将成为脂肪间充质干细胞治疗的明显优势。

创面愈合大致可分为4个渐次发生而又相互重叠的过程^[18]，即止血、炎症反应、增殖、重塑。炎症反应阶段主要由中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞参与，重塑期主要是胶原纤维收缩及瘢痕形成^[19-20]。脂肪间充质干细胞可通过诱导多向分化、旁分泌细胞因子、调节免疫炎症、抗菌作用、改善瘢痕等机制参与创面修复的炎症反应、细胞增殖、基质沉积等过程。如Jo等^[21]发现脂肪间充质干细胞可作为生物活性生长因子的有力来源，有助于缺血性损伤的恢复，促进创面愈合和软组织再生，以此来治疗面部皮肤缺损。Marino等^[22]用脂肪间充质干细胞治疗下肢动脉病变均取得很好的治疗效果。由于炎症期的持续存在，刺激成纤维细胞过度增生，产生大量胶原纤维，形成瘢痕。Yun等^[23]通过建立早期瘢痕模型并设置对照发现，局部注射脂肪间充质干细胞不仅可缩小瘢痕面积，还能够改善瘢痕颜色和柔韧性，其效应的产生是通过降低肥大细胞活性、抑制转化生长因子β对成纤维细胞的作用、增加基质金属蛋白酶的表达。Corcione等^[24]研究发现，干细胞可通过减少炎症来调节伤口环境改善愈合，已有报道脂肪间充质干细胞可以一定程度减轻瘢痕形成^[25]，但脂肪间充质干细胞也具有较强的分泌Ⅰ型胶原的能力^[4]，因此，如果抑制脂肪间充质干细胞分泌Ⅰ型胶原，有望进一步改善脂肪间充质干细胞的临床应用效果。实验发现1，25(OH)₂D₃可以通过Smad3信号明显抑制脂肪间充质干细胞分泌Ⅰ型胶原的能力。

近年来研究证明1，25(OH)₂D₃除了具有调节钙磷吸收和骨骼钙化的作用外，其在调节免疫力、控制细胞生长与存活、细胞分化、保护DNA损伤等方面也具有重要作用，特别是对干细胞分化和功能方面的影响备受关注^[26]，例如，1，25(OH)₂D₃对人脂肪组织来源基质干细胞、人骨髓间充质干细胞的分化和功能具有明显影响^[27-29]。1，25(OH)₂D₃的作用复杂，在不同细胞上甚至不同条件下的作用不同。当1，25(OH)₂D₃表现促进成骨作用时，显示出促进Ⅰ型胶原合成的作用，如沈小辉等^[30]发现1，25(OH)₂D₃促进成骨细胞Ⅰ型胶原的表达呈剂量依赖性和时间依赖性增高。此外，1，25(OH)₂D₃作为诱导人脐带间充质干细胞和大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的诱导剂^[31-32]，能明显升高Ⅰ型胶原的表达。但当1，25(OH)₂D₃表现抑制纤维化作用时，显示出抑制胶原合成的作用，如在肝脏星形细胞、胰腺星形细胞、肺成纤维细胞中均发现维生素D可以抑制Ⅰ型胶原的合成^[33-35]。此外，在子宫肌瘤的研究中也发现10 nmol/L维生素D可以抑制体外培养的子宫肌瘤细胞系产生细胞外基质成分^[36]。Ⅰ型胶原的细胞外沉积是瘢痕形成的直接因素，即胶原蛋白被表达后，需要经过翻译、向细胞外运输和分泌的过程，才能最终参与瘢痕形成。因此，通过ELISA法检测培养上清中胶原的含量能够最直接地反映胶原的分泌情况，进而说明对瘢痕形成的影响。实验发现，不同浓度的1，25(OH)₂D₃对脂肪间充质干细胞分泌Ⅰ型胶原均有一定抑制作用，且在10^-⁸mol/L浓度时抑制作用非常显著，提示如果使用脂肪间充质干细胞促进创面愈合时，可以联合使用一定剂量的维生素D3，以减少创面愈合时瘢痕的产生。至于1，25(OH)₂D₃是通过影响Ⅰ型胶原的转录、翻译、运输，还是影响Ⅰ型胶原的分泌过程，来最终影响其分泌到胞外的含量，还有待进一步研究和分析。

瘢痕形成与胶原蛋白过度沉积密不可分，转化生长因子β是其关键调控因子。许多研究已经阐明转化生长因子β和经典的Wnt/β-catenin通路在这一过程中的作用^[37]。本实验发现，1，25(OH)₂D₃干预下脂肪间充质干细胞内SMAD3总蛋白和磷酸化蛋白均升高，提示1，25 (OH)₂D₃可能通过调节SMAD3水平来间接影响Ⅰ型胶原的分泌。实验结果与最近的一项研究相一致^[38]，该研究发现T-2毒素在降低软骨细胞产生胶原的同时，通过增加Smad3总蛋白和磷酸化蛋白的表达，活化TGF-β1/Smad3信号通路，而抑制TGF-β1和Smad3信号可逆转T-2的作用，恢复胶原的产生。Smad3是TGF-β信号通路中的下游分子，处于复杂的调控网络中，其调控胶原分泌的具体机制还需进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1，25(OH)₂D₃对脂肪干细胞分泌Ⅰ型胶原的影响及作用机制

Effect of 1,25(OH)₂D₃ on type I collagen secretion in adipose-derived mesenchymal stem cells and its mechanism

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