经尿道自体脂肪干细胞注射治疗前列腺癌根治术后尿失禁

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0441

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (5): 717-722.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0441

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经尿道自体脂肪干细胞注射治疗前列腺癌根治术后尿失禁

莫非¹，沈宏春¹，许亚宏²，李健²，赵启华²，罗顺文²，卢奕²，刘洋²，贾志刚²

¹西南医科大学附属中医医院肾病内科，四川省泸州市 646000；²西部空军第452医院泌尿外科，四川省成都市 610021

修回日期:2017-11-29 出版日期:2018-02-18 发布日期:2018-02-18
通讯作者: 沈宏春，博士，副教授，西南医科大学附属中医医院肾病内科，四川省泸州市 646000
作者简介:莫非，男，1980年生，四川省南充市人，汉族，2006年四川大学毕业，主治医师，主要从事泌尿外科工作。

Transurethral injection of autologous adipose-derived stem cells for urinary incontinence after radical prostatectomy

Mo Fei¹, Shen Hong-chun¹, Xu Ya-hong², Li Jian², Zhao Qi-hua², Luo Shun-wen², Lu Yi², Liu Yang²,Jia Zhi-gang²

¹Department of Nephrology, Affiliated Hospital of Chinese Medicine, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; ²Department of Urology, the 452^nd Hospital of PLA, Chengdu 610021, Sichuan Province, China

Revised:2017-11-29 Online:2018-02-18 Published:2018-02-18
Contact: Shen Hong-chun, M.D., Associate professor, Department of Nephrology, Affiliated Hospital of Chinese Medicine, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
About author:Mo Fei, Attending physician, Department of Nephrology, Affiliated Hospital of Chinese Medicine, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
人类脂肪细胞具有许多间充质干细胞的关键特性：人工获得脂肪干细胞时，先通过消化酶处理自体脂肪组织，从而获得基质血管成分，然后在一定的培养条件下进行增殖，培养条件类似于间充质干细胞。随后的研究表明，自体脂肪细胞扩增形成脂肪间充质干细胞，要比自体骨髓细胞形成骨髓间充质干细胞多两个以上的数量级。
前列腺癌根治术后尿失禁：前列腺癌根治术包括开放、腹腔镜、机器人辅助，是根治局限性前列腺癌最常用的方法之一。尽管手术对肿瘤控制有很好的效果，但其主要并发症尿失禁却严重影响着患者的生活质量，应引起足够的重视。既往前列腺癌根治术后尿失禁的几种治疗策略包括：围手术期的非手术方式(盆底肌功能锻炼、药物治疗)，手术中控尿血管神经束保留和手术后的再次手术干预(尿道悬吊术、人造尿道括约肌植入术)等。

摘要
背景：目前尚无可靠的治疗方法用于前列腺癌根治术后尿失禁并发症。药物治疗、尿道中段悬吊术、填充剂治疗等方法均具有一定局限性。因此，利用自体脂肪干细胞治疗前列腺癌术后尿失禁就成了学界热点，并有望成为一线治疗方案。
目的：总结了经尿道注射自体脂肪干细胞治疗前列腺癌根治术后尿失禁的初步临床经验，并对其安全性及疗效进行评估。
方法：试验前已充分告知患者及家属可能存在的风险及获益可能，在签署相关知情同意书后，共有6例前列腺癌根治术后出现持续性尿失禁症状患者被选入研究。在全身麻醉下，利用抽脂术获得50 mL自体脂肪组织，通过Celution系统进行细胞处理后，获得自体脂肪干细胞。将自体脂肪干细胞悬液及相应混合物，在膀胱镜引导下注入尿道膜部的黏膜下区域。在细胞治疗后的12周内，利用24 h尿垫试验、尿失禁质量问卷、尿流动力学及MRI来评估尿道外括约肌在结构及功能上的改变。
结果与结论：①除2例患者在细胞治疗后第2周出现短暂恶化外，所有患者通过24 h尿垫试验测得的尿漏量在注射治疗12周后有明显改善；②基于问卷评分的患者主观感受及生活质量亦有好转；③细胞注射治疗12周后，患者的平均最大尿道闭合压由4.312 kPa升至6.223 kPa；④MRI则提示功能性尿道长度(耻骨联合下缘至膀胱颈距离)由6.1 mm增至8.3 mm；⑤在随访观察中并未出现骨盆疼痛、尿道炎症等不良反应；⑥结果表明，经尿道自体脂肪干细胞注射治疗前列腺癌根治术后尿失禁是安全有效的。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-7542-7127(莫非)

关键词: 干细胞, 自体脂肪干细胞, 前列腺癌根治术, 尿失禁, 细胞注射治疗

Abstract:

BACKGROUND: Until now, there are no reliable methods for the treatment of urinary incontinence after radical prostatectomy. Some limitations exist in drug therapy, mid-urethral suspension, and filling agent treatment. Therefore, the use of autologous adipose-derived stem cells (ADSCs) is expected to become a first-line treatment strategy for urinary incontinence after radical prostatectomy.
OBJECTIVE: To report our initial experience with transurethral injection of autologous ADSCs for the treatment of urinary incontinence after radical prostatectomy.
METHODS: Patients and their families were informed of possible risks and benefits prior to the participation in the trial. After providing written informed consent, six patients with persistent urinary incontinence after radical prostatectomy were enrolled in the study. Under general anesthesia, about 50 mL of adipose tissue was obtained from each patient by liposuction. ADSCs were obtained by separation with centrifugation using the Celution cell-processing device. A mixture of ADSCs and adipose tissue was transurethrally injected into the submucosal space of the membranous urethra. Functional and anatomical improvement was assessed through a 24-hour pad test, validated patient questionnaire, urethral pressure profile, and magnetic resonance imaging (MRI) through 12-week follow-up.
RESULTS AND CONCLUSION: Urine leakage volume was improved with time in all patients in the 24-hour pad test, with the exemption of temporal deterioration in two patients at the first 2 weeks post-injection. Subjective symptoms and quality of life assessed on the basis of questionnaire results showed similar improvement. The mean maximum urethral closing pressure increased from 4.312 kPa to 6.223 kPa at 12 weeks after cell injection. MRI results showed an increase in functional profile length (from 6.1 to 8.3 mm) between the lower rim of the pubic bone and the bladder neck. Adverse events, such as pelvic pain, inflammation, or de novo urgency, were undetected in any case during the follow-up. To conclude, the transurethral injection of autologous ADSCs can be a safe and effective treatment for urinary incontinence after radical prostatectomy.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Adipose Tissue, Prostatic Neoplasms, Urinary Incontinence, Stem Cell Transplantation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

莫非，沈宏春，许亚宏，李健，赵启华，罗顺文，卢奕，刘洋，贾志刚. 经尿道自体脂肪干细胞注射治疗前列腺癌根治术后尿失禁[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(5): 717-722.

Mo Fei, Shen Hong-chun, Xu Ya-hong, Li Jian, Zhao Qi-hua, Luo Shun-wen, Lu Yi, Liu Yang, Jia Zhi-gang. Transurethral injection of autologous adipose-derived stem cells for urinary incontinence after radical prostatectomy[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(5): 717-722.

图/表（结果） 3

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引言

近年来前列腺癌的发病率逐渐升高，已成为男性最常见的恶性肿瘤。前列腺癌根治术作为其主要的治疗手段，术后常会出现尿失禁等并发症，严重影响患者生活质量。基于术后尿失禁的严重程度及患者的自主选择，现已有多种治疗手段，包括药物治疗、外科干预(各类尿道中段悬吊术、填充剂治疗)、细胞治疗等^[1]。所有这些治疗方法都有着一定的局限性，因此干细胞移植作为可替代的治疗方式，已成为近期研究热点。

干细胞是具有自我更新功能的组织细胞，具有分化成其他类型细胞的潜能。理论上，干细胞能使尿道组织细胞再生，对局部尿道黏膜产生“缝合”作用，能够恢复静息尿道闭合压^[2]。多个动物实验模型已经证实各类干细胞对尿道组织的再生修复作用，并且已有多个临床试验正在进行中^[3-5]。2010年Roche等^[6]研究证实了脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ASCs)可分化成肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞或神经细胞，因而为脂肪干细胞的注射治疗提供了细胞学基础。已有动物实验显示，神经分化的脂肪干细胞能够展现出良好的神经胶质特性，并能够参与神经再生^[7]。向尿道周围注射脂肪干细胞不仅能够增加尿道阻力，而且这些脂肪干细胞能够分化成平滑肌细胞，增加尿道收缩力^[8-9]。此外，人工培养的脂肪干细胞还能分泌促进血管再生的细胞因子，比如血管内皮生长因子、肝细胞生长因子等^[10]。Gotoh等^[11]曾在2014年报道了运用自体脂肪干细胞尿道注射治疗前列腺癌根治术后尿失禁的临床研究。在该研究中，Gotoh首次运用Celution系统(Cytori Therapeutics公司研发)对抽脂术获得的自体脂肪组织进行细胞分离以获得自体脂肪干细胞，从而避免了自体脂肪干细胞的人工培养过程，显著降低了细胞注射治疗尿失禁的难度和周期。而早在2008年，Lin等^[12]学者在Cytotherapy上报道了利用该系统分离出具有生物活性自体脂肪干细胞的研究，并认为这种细胞处理方式是安全、经济且可控的。在随后的2014年，Fraser等^[13]亦详细介绍了利用Celution系统提取自体脂肪干细胞的使用方法，也认为该方法是一种安全、高效的提取自体脂肪干细胞的手段，可作为间叶源性干细胞治疗的常规处理流程。但是既往利用自体脂肪干细胞治疗尿失禁的临床研究，其试验例数往往较少，比如Gotoh的研究为11例、Roche的研究为9例、Giberti的研究为14例，因此这一细胞治疗方法仍需更多临床试验评估其安全性及疗效。本试验利用Celution系统获得自体脂肪干细胞，在膀胱镜引导下注入尿道膜部的黏膜下区域，评估这一治疗手段治疗前列腺癌根治术后尿失禁的疗效。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 前瞻性研究。

1.2 时间及地点 于2014年12月至2016年12月在西南医科大学附属中医医院肾病内科、西部空军第452医院泌尿外科完成。

1.3 对象 筛选了6例前列腺癌根治术后出现尿失禁并发症的患者，平均年龄45岁。入选标准：①前列腺癌根治术后出现尿失禁；②尿失禁持续时间超过6个月，且患者需使用尿垫；③术后随访过程中，无临床及影像学上局部复发及远处转移征象。该研究获得了西部空军第452医院医学伦理委员会的批准，并通过了所有患者及家属的知情同意，已签署相关知情同意书。

1.4 方法

1.4.1 自体脂肪干细胞的制备 ①抽脂术获取自体脂肪组织：在全身麻醉下，于腹壁左侧取脐周单切口，选用3 mm抽脂管在负压500 mm Hg(-66.5 kPa)下抽取200 mL自体脂肪组织；②利用Celution系统获得自体脂肪干细胞：Celution系统与Fraser等^[13]报道的装置类似。处理时，先将自体脂肪组织放入Celution系统的容纳器中进行称质量，并进行第一步的“湿润”处理，以洗涤坏死脂肪细胞、血细胞等无用成分，洗涤液常用乳酸林格氏液、利多卡因及肾上腺素制备。洗涤过后的脂肪组织进行酶处理，酶试剂的剂量会根据脂肪组织的质量进行计算。酶处理过后，脂肪组织被泵入离心机进行分离、浓缩，并最终产生相应的自体脂肪干细胞悬液。每处理250 mL自体脂肪组织大约需1.5 h。图1为Cytori Therapeutics公司研发的Celution系统。

1.4.2 尿道膜部细胞注射 所有研究对象在出现尿失禁后6个月进行细胞注射治疗。细胞治疗前，所有患者均已采用药物治疗(度洛西汀、米多君)及盆底肌训练，平均治疗时间约为3个月。①注射前准备：注射前将5 mL自体脂肪干细胞分成两部分，第1部分为孤立的1 mL自体脂肪干细胞悬液，平均浓度为84.7%(71.3%-95.3%)。第2部分为4 mL自体脂肪干细胞悬液与16 mL自体脂肪组织(仅经过湿润及离心处理，而未经过酶处理)的混合液，共20 mL；②内窥镜下注射操作：在24Fr硬性膀胱镜直视下，于尿道外括约肌5点及7点位利用穿刺针进行细胞注射，注射深度约为5 mm，注射成分为第1部分孤立的1 mL自体脂肪干细胞悬液。随后在外括约肌4点、6点及8点位的尿道黏膜下层注射第2部分自体脂肪干细胞混合液，共20 mL。如图2所示，在注射治疗前，尿道外括约肌是开放状态的，在注射1 mL自体脂肪干细胞悬液及20 mL相应混合液后，尿道黏膜由于产生膨胀效应而逐渐靠拢，在内窥镜下出现类似“尿道闭合”的表现；③术后处理：细胞注射治疗后，放置8Fr尿管。术后第2天拔除尿管，以促进正常排尿。

1.5 主要观察指标 通过4项指标量化及评价治疗效果。①24 h尿垫试验：通过24 h尿垫试验可以测量每日尿漏总量，并评估尿失禁程度。在每个观测点需重复测量3次以取其平均值。分别在细胞治疗前(基线数据)、细胞治疗后2，4，8，12周完成测量，并收集数据；②国际尿失禁问卷简表(International Consultation on Incontinence Questionnaire-Short Form，ICIQ-SF)：利用ICIQ-SF来评价患者主观感受及生活质量。量表从尿失禁频率(0-5分)、尿漏量(0-6分)、影响生活程度(0-10分)3个方面来测量，总计0-21分，得分越高表明患者满意度及生活质量越差。这一参数分别在治疗前、治疗后4周及12周进行测量并记录；③尿流动力学：在治疗前、治疗后4周及12周测量并记录尿流动力学指标。将尿道压力测定导管插入膀胱，用自动牵拉器恒定而缓慢地自尿道内拉出。同时，向导管内注入生理盐水，使之自导管前端小孔排出，由导管上换能器连续测定尿道全长内压，并自动描绘出尿道内压曲线即尿道闭合压力图。另有一种附有电极的尿道压力测定导管，可同步检查尿道闭合压力图及尿道外括约肌肌电图。同时监测细胞治疗后是否发生下尿路梗阻等不良事件；④功能性尿道长度：在治疗前、治疗后4周及12周利用MRI测量耻骨联合下缘至膀胱颈的长度来表示功能性尿道长度(functional profile length，FPL)。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

胚胎干细胞是来自于胚囊内层细胞群的多能干细胞，它们具有从3个胚层中分化成其他细胞的潜能。由于医学伦理及相关政策的限制，胚胎干细胞的研究无法在临床上展开，因此早期细胞治疗压力性尿失禁的研究常选用自体成体干细胞进行。但随着研究深入，学界发现自体成体干细胞并不稳定，且分化潜能也有限制。所以，近期的研究常选用间叶源性干细胞进行试验。这些间叶源性干细胞可从多种组织来源获得，比如骨髓、肌肉、脂肪、羊水、牙髓、肝脏、胎盘、脐带等^[2]。

目前很少有利用自体成体干细胞治疗压力性尿失禁的相关研究，而针对于男性压力性尿失禁的成体干细胞治疗研究就更少了。Strasser等^[14]在2007年首次报道了利用自体成体干细胞治疗压力性尿失禁的临床研究。研究中，Strasser等在B超引导下分别向尿道外括约肌及尿道黏膜下层注射平滑肌及成纤维细胞，在随后的12个月随访时间里，患者尿失禁程度、生活质量评分、尿道外括约肌的厚度及收缩力均有明显提升。Strasser认为这些改变是由于尿道外括约肌周围出现新生肌肉组织所引起的^[14-15]。这种产生新生肌肉组织的现象，相对于女性患者，在男性患者中更难出现。这是因为男性功能性尿道长度更长，且在治疗后更容易产生手术瘢痕。Mitterberger等^[16]在2008年也报道了类似的临床研究。Mitterberger等用自体肌源性干细胞治疗了63例前列腺癌根治术后出现尿失禁的患者，并进行了更长时间的随访，与Strasser等的研究类似，所有患者生活质量、尿道括约肌的功能均有不同程度提升，且在治疗过程中并未出现严重副反应。然而，Gerullis等^[7]在2008年的报道发现，220例由于尿道手术或操作出现尿失禁或尿道括约肌损伤的男性患者中，仅120例对自体肌源性干细胞注射治疗产生响应，治疗失败率达46%。并且在治疗有效的120例患者中，仅26例(12%)患者可完全控尿，94例(42%)患者仅得到不同程度改善。综上所述，利用自体成体干细胞治疗男性压力性尿失禁虽然展现出一定的有效性，但仍未完全得到学界共识。因此，利用间叶源性干细胞或许就是另一种可选择的研究方向。

近期已有不少研究证实了自体脂肪干细胞在治疗压力性尿失禁上的疗效^[17-19]。与离心、酶处理、细胞培养等常规处理方式不同，Lin等^[12]于2008年率先利用Celution系统获得自体脂肪干细胞，并对这一处理方式进行了详细介绍。利用流式细胞计数及纤维母细胞集落形成分析，Lin发现利用Celution系统获得的细胞悬液为混合成分，包括脂肪干细胞、内皮祖细胞、CD45⁺的造血细胞、血管平滑肌细胞、单核/巨噬细胞、前脂肪细胞等，并且脂肪干细胞占混合成分的0.6%-1.6%。此外，为了评估自体脂肪干细胞治疗心肌梗死患者的可行性及安全性，第1阶段的临床随机对照试验已于2003年在荷兰展开^[20]，显示出自体脂肪干细胞在干细胞治疗领域的巨大潜力。

在2013年Gotoh等报道了尿道注射自体脂肪干细胞治疗11例前列腺癌根治术后尿失禁患者的临床试验。在该试验中，Gotoh利用最大尿道闭合压及功能性尿道长度来评估尿道外括约肌的功能改善情况，并运用尿垫试验评估尿失禁的程度。Gotoh还解释了利用自体脂肪组织提取自体脂肪干细胞的优势，即提取的细胞悬液中，不仅含有具有多种分化潜能的间叶源性干细胞，同时还含有具有基质功能的成熟细胞。利用Celution系统可快速从每个患者身上获取充足的自体脂肪干细胞。不同于早期细胞治疗，这一处理方式可达到完全自体化，并且不需要进行细胞培养。在这项试验之前，仅有一些动物实验证实，向尿道注射脂肪干细胞可对尿道阻力及顺应性产生变化^[21]。因此关于自体脂肪干细胞治疗压力性尿失禁的临床研究仍然处于验证及探索阶段。

既往已有多位学者对Celution系统的细胞提取液进行分析，证实了该系统输出的自体脂肪细胞成分具有干细胞分化潜能，故本研究未再对细胞形态进行分析及鉴定。除Lin等^[12]曾于2008年利用多色流式细胞仪对Celution系统输出的自体脂肪干细胞进行分析，表明从Celution系统处理得到的细胞液成分包括脂肪干细胞(CD31^-CD34⁺CD45^-CD90⁺CD105^-CD146^-)、内皮祖细胞(CD31⁺CD34⁺CD45^-CD90⁺CD105^-CD146⁺)和血管平滑肌细胞(CD31^-CD34⁺CD45^-CD90⁺CD105^-CD146⁺)。证明利用Celution系统处理得到的自体脂肪干细胞与手工诱导分离的干细胞等价。Fraser等^[13]也曾详细分析了Celution系统处理后的细胞液成分，并对细胞的浓度、成活比率、活性及分化潜能进行了分析，证实了Celution系统的可靠性。在该研究中，有2例患者在注射治疗后的最初2周出现了尿失禁的恶化，但在随后的第4，8，12周，24 h尿垫试验结果显示这2例患者的尿漏量得到了持续性改善，推测最初2周的症状可能是由于不恰当的注射操作，引起尿道括约肌暂时性损伤所导致。

类似的，Gotoh等^[11]也在试验中发现了这一现象，认为由自体脂肪组织提取的自体脂肪干细胞悬液中，会含有乳酸林格氏溶液成分，这一成分可能会导致注射治疗初期出现尿失禁的恶化^[22-25]。该研究的其他4例患者，24 h尿垫试验均提示尿失禁症状得到持续性改善。此外，所有患者的最大尿道闭合压、功能性尿道长度及ICIQ-SF评分在术后均得到持续性改善，并未出现短暂恶化的现象。自体脂肪干细胞治疗压力性尿失禁的原理，既往动物模型及临床研究已给出一定分析及解释。多数学者认为利用自体脂肪组织分离出的自体脂肪干细胞虽含有多种细胞成分^[26-28]，但其治疗压力性尿失禁的核心成分为脂肪干细胞，因为脂肪干细胞不仅能够分化为成熟的脂肪细胞，也可分化成具有收缩功能的尿道平滑肌细胞。此外，动物实验也证实，脂肪干细胞可分泌多种血管生成因子，以促进尿道重建^[29-30]。

综上所述，经尿道注射自体脂肪干细胞是一种安全、可行的治疗前列腺癌根治术后尿失禁的方法。这一新型治疗方法，具有简便、微创且高效的特点。但仍需更大规模的多中心随机对照试验及长期随访来进一步评估其有效性及安全性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

经尿道自体脂肪干细胞注射治疗前列腺癌根治术后尿失禁

Transurethral injection of autologous adipose-derived stem cells for urinary incontinence after radical prostatectomy

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