酸蚀阳极氧化处理钛表面对骨髓间充质干细胞内Wnt信号通路的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0404

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
阳极氧化：是利用电化学原理通过调节阳极氧化的电解条件，在金属表面形成不同程度粗糙、多孔的氧化膜，附加在原有的极薄自然氧化物上，促进生物细胞的黏附，抑制金属离子的释放，增强金属离子的抗腐蚀性能。
酸蚀：指物体表面与酸性介质发生化学或电化学作用而受到损坏的现象，主要发生在金属表面，但也有非金属酸蚀，含酯键、酰胺键和氨基等的聚合物易酸蚀。酸蚀程度是由材料于酸中浸渍后所发生的体积和质量变化率、机械性能变化和外观变化来判别。
Wnt家族蛋白：是体内一类重要的调节糖蛋白，它们作为Wnt信号通路的起始因子，其种类和数量影响着信号通路的活性。经典Wnt信号蛋白，主要包括Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a等，通过引起细胞质内β-catenin的累积，导致β-catenin进入细胞核，启动下游靶基因的转录。

摘要
背景：课题组前期研究发现采用阳极氧化方法在纯钛表面制备出的二氧化钛纳米管阵列，能显著影响成骨细胞的分化功能。
目的：观察酸蚀阳极氧化处理钛表面对骨髓间充质干细胞Wnt信号通路的影响。
方法：采用酸蚀和阳极氧化方法在钛表面制备微米级粗糙度表面复合纳米管形貌，设置氧化电压分别为5 V和20 V，分别记为5 V阳极氧化组和20 V阳极氧化组，以抛光的纯钛作为对照组。将原代培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞分别接种到对照组、5 V阳极氧化组和20 V阳极氧化组钛表面，接种3 d后，采用实时定量PCR方法检测细胞内经典和非经典Wnt信号通路蛋白的基因表达水平；接种7 d后，采用Western blot方法检测β-catenin蛋白细胞核内表达量。
结果与结论：①经典Wnt信号蛋白表达：与对照组比较，5 V阳极氧化组、20 V阳极氧化组细胞内Wnt1和Wnt3a表达水平升高(P < 0.05)；②非经典Wnt信号通路蛋白表达：与对照组比较，5 V阳极氧化组、20 V阳极氧化组细胞内Wnt4表达下降(P < 0.05)；3组细胞内Wnt5a表达无差异；与对照组比较，5 V阳极氧化组细胞内Wnt7a表达下降(P < 0.05)，20 V阳极氧化组细胞内Wnt7a表达升高(P < 0.05)；与对照组比较，5 V阳极氧化组、20 V阳极氧化组细胞内Wnt11表达升高(P < 0.05)；③细胞核内β-catenin表达：与对照组比较，5 V阳极氧化组、20 V阳极氧化组细胞核内β-catenin表达明显升高(P < 0.05)；④结果表明：钛表面微米级粗糙度复合纳米管形貌可激活骨髓间充质干细胞内经典Wnt信号通路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-8884-8548(王薇)

关键词: 阳极氧化, 钛, 纳米管, 骨髓间充质干细胞, Wnt信号, β-catenin

Abstract:

BACKGROUND: Preliminary findings have shown that titanium dioxide nanotube array prepared on the titanium surface by an anodizing method can significantly affect the osteoblast differentiation.
OBJECTIVE: To observe the effect of titanium surface modification by acidic oxidation treatment on the Wnt signaling pathway in bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: The micro/nano-structure composed of nanotubes was prepared by acidic oxidation method. The oxidizing voltage was set to 5 V and 20 V. The polished pure titanium was used as control. Primary cultured Sprague-Dawley rat bone marrow mesenchymal stem cells were seeded onto the titanium surface of the three groups. After 3 and 7 days of incubation, real-time quantitative PCR was used to detect the genes levels of canonical Wnt and non-canonical Wnt signaling pathway and western blot method was used to detect β-catenin expression level in the nuclei, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Canonical Wnt signaling expression: Wnt1 and Wnt3a expression on the micro/nano-structure surfaces significantly increased compared to the control surface (P < 0.05). (2) Non-canonical Wnt signaling expression: compared with the control surface, Wnt4 expression decreased on the two kinds of micro/nano structure surfaces (P < 0.05); Wnt7a decreased on the small-diameter nanotube (R5) surface (P < 0.05), increased on the big-diameter nanotube surface (R20) (P < 0.05); Wnt11 elevated on both two micro/nano structure surfaces (P < 0.05). Wnt5a expression level had no obvious change in the three groups. (3) β-catenin expression level in the nuclei significantly increased after titanium surface modification by different acidic oxidation treatments compared to the control surface. These results show that the micro/nano-structure titanium surface activates the canonical Wnt signaling pathway in the bone marrow mesenchymal stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Dental Implants, Titanium, Nanotubes, Stem Cells, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

王薇，杜原宏. 酸蚀阳极氧化处理钛表面对骨髓间充质干细胞内Wnt信号通路的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(1): 13-19.

Wang Wei, Du Yuan-hong. Titanium surface modification by acidic oxidation treatment activates the Wnt signaling pathway in bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(1): 13-19.

图/表（结果） 2

2.1 钛表面形貌观察 在低倍镜下，对照组表面为平行的抛光划痕，5 V阳极氧化组和20 V阳极氧化组表面为凹凸不平的微米坑形貌。在高倍数显微镜下，5 V阳极氧化组和20 V阳极氧化组表面均匀分布着纳米管阵列，5 V阳极氧化组表面纳米管直径约为30 nm，20 V阳极氧化组表面纳米管直径约为100 nm，对照组表面没有明显的纳米级形貌(图1)。

2.2 骨髓间充质干细胞的形态及生长情况观察 在骨髓间充质干细胞培养过程中，采用倒置显微镜观察细胞生长情况及形态，并拍照记录。细胞培养14 d后，骨髓间充质干细胞紧贴培养瓶生长，呈较为均匀的成纤维细胞样，旋涡状或辐射状整齐有序排列(图2A)。使用成脂诱导液诱导成脂分化10 d后，油红O染色可见细胞内及细胞间分布着大小不等的红色脂滴(图2B)。使用成骨诱导液成骨诱导 21 d后，经茜素红染色后可见细胞内形成大小不规则的红色矿化结节(图2C)。

2.3 微米纳米形貌表面骨髓间充质干细胞内经典Wnt信号通路蛋白表达水平 骨髓间充质干细胞在3组材料表面培养3 d后，5 V阳极氧化组和20 V阳极氧化组细胞内Wnt1和Wnt3a表达量较对照组明显增高(P < 0.05)，且20 V阳极氧化组表面表达量最高(图3)。5 V阳极氧化组和20 V阳极氧化组Wnt1表达量分别为对照组的2.1和2.5倍，Wnt3a表达量分别为对照组的4.2和5.1倍。

2.4 微米纳米形貌表面骨髓间充质干细胞内非经典Wnt信号通路蛋白表达水平 3组材料表面骨髓间充质干细胞的非经典Wnt信号蛋白表达没有明显规律。与对照组相比，5 V阳极氧化组和20 V阳极氧化组细胞内Wnt4表达量下降(P < 0.05)，分别为对照组的77%和69%；3组细胞内Wnt5a表达无明显差别。与对照组比较，5 V阳极氧化组细胞内Wnt7a表达量下降44%(P < 0.05)；20 V阳极氧化组细胞内Wnt7a表达量升高，为对照组的1.56倍(P < 0.05)。5 V阳极氧化组和20 V阳极氧化组细胞内Wnt11表达水平升高(P < 0.05)，分别是对照组的1.25倍和1.625倍(图4)。

2.5 微米纳米形貌表面骨髓间充质干细胞细胞核内β-catenin蛋白表达水平 骨髓间充质干细胞在3组材料表面培养7 d后，5 V阳极氧化组和20 V阳极氧化组细胞核内β-catenin的表达量高于对照组(P < 0.05)。条带灰度半定量分析显示与对照组相比，5 V阳极氧化组表达量升高2.3倍，20 V阳极氧化组升高3.6倍(图5)。

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引言

纯钛种植体表面改性能够促进骨细胞的多种生物学功能，从而可获得更好更快的骨整合，因此一直是该领域研发的热点。种植体表面形貌通过改变细胞外基质蛋白的组成和构象，从而调控细胞内部信号分子的表达，进而影响细胞功能^[1-3]。天然骨组织主要是由微米级别的哈弗氏系统和纳米级别的胶原原纤维组成。材料表面微米纳米仿生设计成为研究热点。近年来有研究表明，当材料尺寸达到纳米级别时，纳米形貌不但可通过细胞外基质蛋白间接调控细胞行为，还可因单纯形貌的不同对细胞产生直接的影响^[4-6]。课题组前期也采用阳极氧化方法在纯钛表面制备出管径大小精确可控的二氧化钛纳米管阵列，并发现该形貌能显著影响成骨细胞分化功能^[7]。鉴于微米级和纳米级形貌各自对细胞的优点，作者将两者结合，制备出微米级粗糙表面与纳米管的微纳米复合形貌，并发现此形貌明显促进骨再生的关键细胞——骨髓间充质干细胞的成骨分化^[8]，但是材料表面形貌调控骨髓间充质干细胞的机制尚不明了。因此，从分子水平深入探明材料表面形貌对细胞的影响机制，将有助于深入理解微纳米形貌对骨细胞功能的影响，最终为种植体材料的表面优化设计提供分子生物学依据。

Wnt信号通路参与调控骨发生、生长及骨折愈合过程^[9-12]，并且Wnt信号通路也被认为是对干细胞的增殖和分化起关键作用的信号通路之一，在骨骼发育和维持骨内生理性稳态方面起着重要作用。Wnt信号通路分为经典Wnt信号通路(β-catenin依赖性)和非经典Wnt信号通路(非β-catenin依赖性)，其中包括Wnt/Ca²⁺途径和Wnt/PCP途径。Wnt信号通路由多种因子组成，包括Wnt蛋白、β-catenin、GSK-3及APC蛋白等多种^[10^，^13-14]。鉴于Wnt在促成骨中的重要作用，已有体外实验证实将羟基磷灰石同Wnt配体蛋白混合植入种植窝内后，种植体周围成骨效果明显^[15]。

实验将大鼠骨髓间充质干细胞接种到微米级粗糙表面复合纳米管形貌表面，采用分子生物学手段研究经典Wnt信号和非经典Wnt信号通路中关键蛋白的表达，进一步探索种植体表面形貌对干细胞调控的分子机制。

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材料方法

1.1 设计 体外对比观察性实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年1月至2016年12月在解放军第四军医大学口腔组织工程中心实验室完成。

1.3 材料

实验动物：4-6周龄雄性SD大鼠，由解放军第四军医大学动物实验中心提供。

主要材料和设备：商业纯钛(西北有色金属研究所)；DMEM培养液、胎牛血清(Gibico，美国)；TrizolReagent总RNA提取试剂盒、RNA反转录试剂盒、SYBR Green I检测试剂盒(Invitrogen公司，美国)；β-catenin抗体、辣根过氧化物酶标记抗兔二抗(Cell Signal Technology, 美国)；BCA蛋白检测试剂盒(BioRad，美国)；细胞核蛋白提取试剂盒(Milipore，美国)；场发射扫描电子显微镜(S-4800，Hitachi，日本)；实时定量PCR仪(Applied Biosystems，美国)；免疫光化学检测成像仪(上海培清科技有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 钛表面形貌制备 将纯钛(1 cm×1 cm×1 mm)用碳化硅砂纸(400目、600目、800目、1 000目、1 200目、1 500目)依次抛光并超声清洗。将光滑钛试样浸泡在含0.5%氢氟酸溶液30 min，制备微米坑形貌。继而将具有微米坑形貌的钛试样放置于含有0.5%氢氟酸溶液中进行阳极氧化处理，处理时间为1 h，阳极氧化电压分别为5 V和20 V，分别记为5 V阳极氧化组和20 V阳极氧化组。以抛光处理光滑钛表面为对照组。采用场发射扫描电子显微镜观察3组试样表面形貌。

1.4.2 原代大鼠骨髓间充质干细胞培养 采用全骨髓细胞贴壁法对SD大鼠骨髓间充质干细胞进行原代培养。取SD大鼠双侧股骨和胫骨，剪去股两端骨骺端，用DMEM培养液冲洗髓腔并收集冲洗液至离心管中，800 r/min离心15 min，吸弃离心管上层浮脂层，加入8 mL 含有体积分数20%胎牛血清的DMEM培养液并轻轻吹打至均匀，接种于培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂、95%相对湿度下培养。每隔3 d换液，细胞生长至80%浓度时，采用0.25%胰蛋白酶消化后传代培养。选择第3-5代细胞用于后继实验。

1.4.3 干细胞的鉴定 采用成脂诱导液诱导成脂分化 10 d后，油红O染色观察成脂分化能力；采用成骨诱导液成骨诱导21 d后，茜素红染色观察矿化结节形成能力。

1.4.4 细胞接种 将原代培养的骨髓间充质干细胞以2×10⁴/孔的密度接种到3组试样表面。

1.5 主要观察指标

1.5.1 实时定量PCR检测Wnt信号通路蛋白的基因表达 接种3 d后终止培养，采用Trizol总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，采用实时荧光定量PCR技术检测非经典Wnt信号通路配体Wnt5a、Wnt11和Wnt7a的表达，经典Wnt信号通路配体Wnt1、Wnt3a、Wnt4的表达。所有引物均有南京建成生物工程研究所设计合成。每组实验重复3次。

1.5.2 Western blot检测细胞核内β-catenin蛋白表达 接种7 d后终止培养，采用RIPA缓冲液和细胞核蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白和细胞核蛋白。采用BCA蛋白试剂盒测量蛋白浓度。将每组20-30 μg的蛋白在10%SDS凝胶上电泳，并将分离后的蛋白条带转移至聚二氟乙烯膜。将聚二氟乙烯膜用5%的BSA封闭1 h后，与β-catenin一抗孵育过夜，再与辣根过氧化酶标记二抗作用2 h。采用免疫光化学检测成像仪采集蛋白条带图像。

1.6 统计学分析 采用SPSS 15.0软件对数据进行单因素方差分析，两两比较用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

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讨论

种植体表面形貌对骨细胞的黏附、增殖、功能表达和细胞内信号传导有重要的影响。采用氢氟酸酸蚀和阳极氧化方法能够在纯钛表面构建出微米级粗糙度表面与纳米管的微纳米复合形貌，扫描电子显微镜下可见管径为30-100 nm的有序排列纳米管阵列。种植体周围骨形成是干细胞向成骨细胞分化、成熟的复杂过程。鉴于干细胞在成人体内的多向分化能力及可塑性，被认为是组织工程领域的种子细胞。已有大量研究证实了骨髓间充质干细胞具有向成骨细胞分化的潜能，并且已被广泛应用于颌面部缺损修复和口腔种植体领域^[16-17]。Heiden等^[18]研究发现，金属表面纳米孔洞形貌能够诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。作者所在课题组前期研究显示，这种复合梯度形貌具有一定的仿生效果，除了可促进成骨细胞的多种细胞功能外，该形貌能够促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，成骨基因Runx2、Osx、BSP等表达水平在复合梯度形貌表面升高，碱性磷酸酶分泌水平、胶原分泌水平和细胞外基质矿化水平也均增强^[19]。这说明单纯的对种植体表面形貌做优化处理，就能够促进骨髓间充质干细胞的成骨方向分化，以达到更好更快的种植体表面骨结合，然而其相关的分子机制尚不明确。

细胞的黏附、增殖和分化等一系列生物学行为都是由细胞内部的信号通路系统调控的。目前有研究证实，骨形成蛋白信号^[20-21]、Wnt^[22]、丝裂原活化激酶(MAPK)和整合素信号途径都是促进成骨的重要信号通路^[23-25]。Wnt信号通路在骨和软骨组织代谢中发挥重要的调控作用。Wnt信号通路按照对胞浆内β-catenin蛋白的依赖性，分为经典Wnt信号通路(β-catenin依赖性Wnt信号通路)和非经典Wnt信号通路(非β-catenin依赖性Wnt信号通路)及Ca²⁺和细胞极性信号通路^[26]。研究表明，Wnt/β-catenin信号通路中LRP5基因的失活会导致啮齿类动物骨量的减少^[27]。条件性敲除了β-catenin蛋白的小鼠会导致小鼠骨折愈合延迟^[28]。因此作者将具有多向分化潜能的骨髓间充质干细胞接种到微纳米复合形貌表面，检测细胞中Wnt信号通路的变化，以探明Wnt信号通路是否参与种植体形貌对干细胞的调控。

Wnt家族蛋白是体内一类重要的调节糖蛋白，它们作为Wnt信号通路的起始因子，其种类和数量影响着信号通路的活性。经典Wnt信号蛋白，主要包括Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a等，通过引起细胞质内β-catenin的累积，导致β-catenin进入细胞核，启动下游靶基因的转录。非经典Wnt蛋白，主要包括Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a和Wnt11等，通过调节细胞内Ca²⁺水平激活非经典Wnt信号通路^[29-31]。此次实验数据表明，微纳米形貌能够显著促进BMSCs内经典Wnt蛋白中的Wnt1和Wnt3a的mRNA表达。Wnt3a能够有效激活经典Wnt/β-catenin 途径，目前对Wnt3a促进成骨细胞或是干细胞成骨的研究较多^[32-33]。将可溶性Wnt3a接种到种植体周围后，Li等^[34]发现可提高小鼠种植体周围Wnt3a的含量，这种瞬态传递Wnt配体量的提高对种植体周围细胞分化为成骨细胞表型很重要。对于非经典Wnt蛋白，此次实验检测了Wnt4、Wnt5a、Wnt7a和Wnt11的mRNA表达水平。虽然已有研究显示，非经典Wnt蛋白对骨组织及骨发生都具有积极的调控作用，如Wnt4能够防止骨骼衰老及炎症的发生^[35]，Wnt5a能够促使人脂肪干细胞向成骨细胞分化^[36-37]。但是，此次实验显示，材料表面的微米纳米形貌对非经典Wnt蛋白mRNA表达的影响并没有明显规律。Wnt4在微纳米结构表面表达增强；Wnt5a表达水平不受材料表面形貌影响；Wnt7a在小管径纳米管的材料表面表达下降，在大管径纳米管的材料表面表达水平反而上升；Wnt11在两种微纳米结构表面表达升高。以上实验结果说明微米纳米形貌对骨髓间充质干细胞的影响，主要是通过上调经典Wnt信号蛋白的表达来起作用。

经典Wnt蛋白与细胞膜表面LRP/FZD受体激活细胞的第二信使，引起细胞质内β-catenin的累积。β-catenin是由130个氨基酸残基构成的，在细胞质中含量最多，在细胞膜及细胞核中也有发现。β-catenin是Wnt经典通路中的关键因子，其量的累积是Wnt经典通路的关键环节^[38-39]。β-catenin在细胞质内聚集到一定程度后，将转位入核，启动核内转录因子cyclinD1和Tcf1的激活，促进Runx2表达^[40]。为了进一步验证微纳米形貌对骨髓间充质干细胞内经典Wnt信号通路的影响，实验检测了骨髓间充质干细胞细胞核内β-catenin的表达水平。结果发现，微米纳米形貌确实显著促进了β-catenin在骨髓间充质干细胞中的核转移，激活经典Wnt信号通路，并且这种促进作用在含有大管径纳米管(100 nm管径)的微米纳米形貌表面更加明显。

实验采用酸蚀和阳极氧化方法在纯钛表面制备出微米级粗糙度复合纳米管形貌的微纳米形貌，并将大鼠骨髓间充质干细胞接种到材料表面，采用分子生物学手段检测Wnt信号通路中关键蛋白的表达，结果表明微纳米形貌通过激活经典Wnt信号通路来调控骨髓间充质干细胞的生物学行为。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程