骨硬化蛋白单链抗体对骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0402

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (1): 1-6.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0402

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骨硬化蛋白单链抗体对骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响

李世飞¹，祝孟海²，张树东¹，姚琦^1，3

¹首都医科大学附属北京世纪坛医院骨科，北京市 100038；²北京大学第九临床医学院骨科，北京市 100038；³中国人民解放军总医院骨科，北京市 100853

修回日期:2017-09-12 出版日期:2018-01-08 发布日期:2018-01-08
通讯作者: 姚琦，博士，主任医师，教授，首都医科大学附属北京世纪坛医院骨科，北京市 100038；中国人民解放军总医院骨科，北京市 100853
作者简介:李世飞，男，1986年生，河南省濮阳市人，汉族，首都医科大学在读硕士，主要从事骨质疏松基础与临床研究。
基金资助:
中国博士后科学基金资助项目(2015T81104(2014-c02))；北京市科委项目(Z151100003915094)

Effects of sclerostin-single chain antibody fragment on the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

Li Shi-fei¹, Zhu Meng-hai², Zhang Shu-dong¹, Yao Qi^{1, 3}

¹Department of Orthopedics, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100038, China; ²Department of Orthopedics, Ninth Clinical School, Peking University Health Science Center, Beijing 100038, China; ³Department of Orthopedics, PLA General Hospital, Beijing 100853, China

Revised:2017-09-12 Online:2018-01-08 Published:2018-01-08
Contact: Yao Qi, M.D., Chief physician, Professor, Department of Orthopedics, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100038, China; Department of Orthopedics, PLA General Hospital, Beijing 100853, China
About author:Li Shi-fei, Studying for master’s degree, Department of Orthopedics, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100038, China
Supported by:
China Postdoctoral Science Foundation, No. 2015T81104(2014-c02); the Funded Project of Beijing Municipal Science and Technology Commission, No. Z151100003915094

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
骨硬化蛋白单链抗体：在获得分泌抗骨硬化蛋白单克隆抗体基础上，利用RT-PCR技术扩增了抗体可变区基因VH和VL，组装成了骨硬化蛋白单链抗体基因，具有完全抗原结合位点的最小抗体片断，与单克隆抗体比较，单链抗体相对分子质量小、渗透性高、抗原结合活性较高。
Wnt/β-catenin信号通路：是Wnt信号通路的经典信号通路，在骨骼发育和成骨分化中起着重要作用，Wnt/β-catenin信号通路实现过程中有多种因子参与，包括 Wnt蛋白、β-catenin、Fz受体、共受体LRP5/6、蛋白激酶GSK-3β以及APC蛋白等。骨硬化蛋白可通过与Wnt通路中Lrp5/6结合，抑制Wnt/β-catenin通路的活化，对骨形成起负性调控作用。

摘要
背景：拮抗骨硬化蛋白可影响Wnt/β-catenin信号通路，刺激成骨活动，增加骨合成代谢。
目的：观察骨硬化蛋白单链抗体对小鼠骨髓间充质干细胞增殖、分化的影响。
方法：全骨髓贴壁法分离得到C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞，成骨诱导14 d后茜素红染色，成脂诱导7 d后油红O染色，检测骨髓间充质干细胞的分化能力；取第3代骨髓间充质干细胞，实验组用含50 μg/L骨硬化蛋白单链抗体(Scl-scFv)的α-MEM完全培养基培养，对照组用等量α-MEM完全培养基培养，MTT法检测细胞的增殖能力；第7天Real-Time PCR检测Col1、ALP、RUNX2、OPN、OCN 的mRNA表达，同时进行碱性磷酸酶染色；第4，7，10天Western blot检测Col1和OPN蛋白表达，ELISA检测细胞培养上清中骨钙素水平。
结果与结论：①骨髓间充质干细胞成骨诱导后茜素红染色可见明显钙结节，成脂诱导后油红O染色可见橘红色油滴；②随着培养时间的延长，实验组的吸光度值与对照组比较差异无显著性意义；③实验组Col1、ALP、RUNX2、OPN、OCN的mRNA表达均高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，碱性磷酸酶染色强于对照组；④实验组Col1、OPN蛋白水平高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；⑤结果表明，骨硬化蛋白单链抗体对骨髓间充质干细胞增殖无明显作用，可以促进其向成骨分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-9929-4365(李世飞)

关键词: 骨硬化蛋白单链抗体, 骨髓间充质干细胞, 增殖, 成骨分化, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Antagonism of bone sclerosis protein can stimulate osteogenesis and increase bone synthesis and metabolism through the Wnt/β-catenin signaling pathway.
OBJECTIVE: To investigate the effects of sclerostin-single chain antibody fragment (Scl-scFv) on the proliferation and osteogenic differentiation of C57BL/6 mouse bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs).
METHODS: BMSCs were isolated from C57BL/6 mice using whole bone marrow adherence method. Alizarin red staining was performed at the 14th day of osteogenic induction, and oil red O staining performed at the 7th day of adipogenic induction. Passage 3 BMSCs were cultured with α-MEM complete medium with (experimental) or without (control) 50 μg/L Scl-scFv aScl-scFv. Real-time PCR was used to detect type 1 collagen, alkaline phosphatase, RUNX2, osteopontin, osteocalcin at the 7th day of culture and meanwhile, alkaline phosphatase staining was done; western blot assay was used to detect expression of type 1 collagen and osteopontin proteins, and ELISA was used to detect the level of osteocalcin in the cell supernatant at 4, 7, 10 days of culture.
RESULTS AND CONCLUSION: Formation of calcium nodules and orangered oil droplets was obviously visible in the BMSCs after osteogenic and adipogenic induction, respectively. Over time, the absorbance value showed no difference between the experimental and control group. Compared with the control group, the experimental group showed significant increases in mRNA and protein expression of type 1 collagen and osteopontin as well as in protein expression of alkaline phosphatase, RUNX2 and osteocalcin (P < 0.05). Moreover, stronger alkaline phosphatase staining was found in the experimental group relative to the control group. These findings indicate that Scl-scFv has no effect on BMSCs proliferation, but can promote the osteogenic capacity of BMSCs in vitro.

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Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Single-Chain Antibodies, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

李世飞，祝孟海，张树东，姚琦. 骨硬化蛋白单链抗体对骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(1): 1-6.

Li Shi-fei, Zhu Meng-hai, Zhang Shu-dong, Yao Qi. Effects of sclerostin-single chain antibody fragment on the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(1): 1-6.

图/表（结果） 2

2.1 骨髓间充质干细胞形态 接种后4 h即可见细胞贴壁生长，呈亮圆形的单核细胞。1 d后首次半量换液去除未贴壁细胞，贴壁细胞胞体明显增大，细胞内颗粒增多，2 d后梭形生长的细胞数量明显增多，偶可见胞体有多个突起的细胞，呈多角形，立体感不强。3 d后全量换液，细胞形态以长梭形为主，可见克隆。4 d后分散生长细胞减少或消失，克隆明显增多，细胞多呈漩涡状或放射状层叠交织生长，为成纤维细胞样特征。7 d左右细胞汇合率达80%，在原代培养的单核细胞中还可见异质细胞，这些异质细胞及圆形的单核细胞均随传代而逐渐减少，细胞形态比较单一，呈漩涡状或放射状平行排列。见图1。

2.2 成脂诱导油红O染色结果 实验组和对照组培养7 d后油红O染色，实验组细胞中可见大小不等的圆形红色脂滴，对照组没有脂滴，见图2。

2.3 成骨诱导茜素红染色结果 成骨诱导培养和Scl-scFv作用14 d后，可见散在钙结节，实验组茜素红染色强于阳性对照组和对照组，见图3。

2.4 细胞增殖情况 对照组的吸光度值与实验组的吸光度值差异无显著性意义，提示Scl-scFv对骨髓间充质干细胞增殖的作用可能不大，见图4。

2.5 Scl-scFv对骨髓间充质干细胞成骨基因表达的影响 在Scl-scFv作用下，实验组成骨基因Col1、ALP、RUNX2、OPN、OCN均有一定程度的上调，与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5。

2.6 Scl-scFv作用下骨髓间充质干细胞成骨分化过程中碱性磷酸酶的表达 骨髓间充质干细胞在成骨分化过程中表达的碱性磷酸酶可以将底物去磷酸化，是评价成骨活性的早期指标。细胞培养7 d后进行碱性磷酸酶染色，碱性磷酸酶表达阳性的部位被染成蓝色，结果发现，实验组细胞染色强度和阳性细胞数目都强于阳性对照组和对照组，见图6。

2.7 Scl-scFv对骨髓间充质干细胞成骨分化过程中相关蛋白检测结果

2.7.1 Western blot检测Col1、OPN蛋白表达 见图7。实验组Col1和OPN的表达强于对照组。

2.7.2 ELISA检测骨钙素水平 见图8。实验组细胞上清中骨钙素水平较对照组显著升高，差异有显著性意义(P < 0.05)。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机分组对照细胞学实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年6月至2017年2月在首都医科大学附属北京世纪坛医院中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 C57BL/6雌性小鼠20只，清洁级，3周龄，体质量9-13 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.3.2 主要试剂及仪器 α-MEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青-链霉素(P-S)(美国Gibco公司)；PBS(Hyclone公司)；地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、茜素红、碱性磷酸酶染液(美国Sigma公司)；骨钙素试剂盒(南京建成)；Anti-Collagen I antibody(博士德)；Anti-Osteopontin antibody(abcam)；TRIzol reagent(ambion公司)；cDNA反转录试剂盒、SYBR Green PCR试剂盒(康为世纪)；引物合成(上海生工)；Scl-scFv(中国科学院微生物研究所)；Airstream生物安全柜(Esco公司)；PCR热循环仪、荧光定量PCR仪、CO₂培养箱(Thermo公司)；ODYSSEY CLx(LI-COR公司)；电泳槽、电泳仪(BIO-Red公司)；普通离心机(Biofuge公司)；低温高速离心机(Biofuge公司)；全波段酶标仪(TECAN公司)；TE300型倒置相差显微镜(Nikon公司)。

1.4 方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离与培养 全骨髓贴壁法获得骨髓间充质干细胞^[8-9]。用颈椎脱臼引颈法处死C57BL/6小鼠，在体积分数为70%乙醇中浸泡5 min。准备两套已消毒的手术器械，在超净台中用第1套机械迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉，尽量保持小鼠股骨和胫骨完整性的条件下取股骨及胫骨，浸泡在含5%双抗的PBS中30 min。用第2套器械处理股骨和胫骨上残留的肌肉，PBS反复冲洗，剪去股骨和胫骨两端，暴露骨髓腔，用装有α-MEM培养基的1 mL注射器冲出骨髓腔内的骨髓，整个过程操作轻柔，减少细胞的机械损伤。将细胞悬液以1 500 r/min离心5 min形成细胞沉淀，弃上清液。用α-MEM完全培养基重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹，接种到培养皿中，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂饱和湿度细胞培养箱中静置培养。培养1 d后首次半换液弃去未贴壁的细胞，以后每3 d常规换液。在倒置相差显微镜下观察到原代细胞汇合达到80%-90%时，即可进行传代培养。传至第3代，备用。

1.4.2 骨髓间充质干细胞成脂诱导 取第3代骨髓间充质干细胞以每孔3×10⁴/cm²的密度接种至6孔板，细胞贴壁后换液，实验组加成脂诱导液(含α-MEM完全培养基、1 mmol/L地塞米松、10 mg/L胰岛素、50 mmol/L IBMX、0.2 mmol/L吲哚美辛)2.5 mL；对照组加等量α-MEM完全培养基；每3 d常规换液，培养7 d后进行油红O染色，倒置显微镜下观察。

1.4.3 骨髓间充质干细胞成骨诱导 取第3代骨髓间充质干细胞以每孔3×10⁴/cm²的密度接种至6孔板，细胞贴壁后换液，实验组加含50 μg/L Scl-scFv的α-MEM完全培养基2.5 mL；对照组加等量α-MEM完全培养基；阳性对照组加成骨诱导液(含α-MEM完全培养基、100 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 mg/L抗坏血酸)。每3 d常规换液，培养14 d后茜素红染色，倒置显微镜下观察。

1.4.4 Scl-scFv对骨髓间充质干细胞增殖的影响 取生长良好的第3代骨髓间充质干细胞，调整细胞浓度为1×10⁷ L^-¹，接种于96孔板，每孔细胞数1×10³个，总体积为100 μL。骨髓间充质干细胞贴壁后用不含血清的α-MEM培养基同步化处理24 h。实验组加入含50 μg/L Scl-scFv的α-MEM完全培养基，对照组仅加α-MEM完全培养基，每组设6个复孔，分别在第1，3，5，7，9天同一时间点各取1板，每孔加MTT(5 g/L)20 μL，37 ℃，体积分数为5%CO₂，饱和湿度培养箱孵育，4 h后每孔加二甲基亚砜150 μL，置于摇床上低速振荡约10 min，使紫色结晶物溶解，酶标仪490 nm波长检测吸光度值。

1.4.5 Scl-scFv对骨髓间充质干细胞成骨分化过程中碱性磷酸酶活性的影响 取第3代骨髓间充质干细胞，以3×10⁴/cm²，每孔2.5 mL接种至6孔板，细胞贴壁后换液，实验组加入含50 μg/L Scl-scFv的α-MEM完全培养基2.5 mL，对照组加入等量α-MEM完全培养基，阳性对照组加入等量成骨诱导液，常规3 d换液，培养7 d后，对细胞进行碱性磷酸酶染色。

1.4.6 Scl-scFv对骨髓间充质干细胞成骨基因表达的影响 取第3代骨髓间充质干细胞以3×10⁴/cm²，每孔2.5 mL接种至6孔板，细胞贴壁后换液，实验组加入含50 μg/L Scl-scFv的α-MEM完全培养基2.5 mL，对照组加入等量α-MEM完全培养基。每3 d换液培养，第7天收集样品，用Trizol裂解细胞，提取细胞RNA，反转录为cDNA，采用实时定量PCR检测成骨基因Col1，ALP，RUNX2，OCN，OPN的表达，GAPDH作为内参，结果采用2^-^??Ct法进行计算，对照组的相应基因表达水平为1，比较Scl-scFv作用后的成骨基因表达水平。实时定量PCR所用引物见表1。

1.4.7 Scl-scFv对骨髓间充质干细胞成骨分化过程中相关蛋白的影响

Western blot检测Col1、OPN蛋白的表达：取第3代骨髓间充质干细胞以3×10⁴/cm²，每孔2.5 mL接种至6孔板，细胞贴壁后换液，实验组加入含50 μg/L Scl-scFv的α-MEM完全培养基，对照组加入等量α-MEM完全培养基。每3 d换液，分别在第4，7，10天收样，用PBS漂洗细胞，加入预冷的蛋白裂解液充分裂解，收集裂解物，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，收集上清，测定蛋白浓度，标准化后，按4倍体积蛋白提取液加1倍体积5×SDS蛋白Loading buffer(4︰1)混匀，95 ℃加热5 min。加热后降至室温再4 ℃，12 000 r/min离心10 min，留上清备用。以每泳道30 μg，SDS-丙烯酰胺凝胶电泳槽中电泳，转膜后室温脱脂牛奶封闭1 h，Col1(1︰500)和OPN(1︰2 000)一抗4 ℃孵育过夜。次日，室温下，二抗孵育1 h，显色，以GAPDH为内参。

ELISA检测上清中的骨钙素水平：分组同上，在第4，7，10天收集各组上清，2 000 r/min离心20 min左右。按照说明加入准备好的样品、标准品、酶标试剂，37 ℃反应60 min，洗板5次，加入显色液A、B，37℃显色10 min，加入终止液，10 min之内读吸光度值，根据浓度和吸光度值算出标准曲线的回归方程，得到骨钙素水平。

1.5 主要观察指标 ①Scl-scFv干预后骨髓间充质干细胞的增殖能力；②Scl-scFv干预后骨髓间充质干细胞成骨分化基因Col1、ALP、RUNX2、OPN、OCN的mRNA表达；③Scl-scFv干预后骨髓间充质干细胞成骨分化过程中碱性磷酸酶的表达；④Scl-scFv干预后骨髓间充质干细胞成骨分化过程中Col1、OPN的蛋白表达；⑤Scl-scFv干预后骨髓间充质干细胞成骨分化过程中骨钙素的水平。

1.6 统计学分析 使用SPSS20.0 软件进行统计分析，两两独立样本比较用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

临床治疗骨质疏松以抑制破骨为主，抑制骨吸收虽能改善和维持骨强度，却无法使已经被吸收的骨再生成^[10-11]。通过促进骨生成的途径来治疗骨质疏松较为理想，有学者研究表明拮抗骨硬化蛋白时会刺激成骨活动，骨合成代谢显著增加，但不会刺激破骨活动，即其可以提高骨细胞生成，抑制破骨细胞生成^[5^，^12]，Sclerostin的相关研究为骨质疏松症的治疗带来了突破性的进展^[13-14]。

骨硬化蛋白由骨硬化蛋白基因(SOST)编码，是一种含有胱氨酸结的分泌型糖蛋白，在成骨微环境中起到重要的作用^[15]，与骨形成以及骨吸收过程中多种信号通路中的转录因子均有交互作用^[16]。有研究发现骨硬化蛋白经Wnt/β-catenin信号通路负向调节骨代谢的作用是引起骨质疏松症的原因之一^[17]，骨硬化蛋白过表达可以使骨量下降^[18-20]。有学者研究发现骨硬化蛋白可以通过结合Lrp4/5/6受体抑制Wnt/β-catenin信号通路发挥调节骨代谢的作用^[21-22]，而骨硬化蛋白抗体(Scl-Ab)可拮抗该负向调节作用，抑制骨丢失并促进骨生成^[23-24]。Li等^[25]用骨硬化蛋白单克隆抗体治疗去势大鼠可以显著提高大鼠骨密度和骨形成。有学者将骨硬化蛋白抗体治疗大鼠骨质疏松骨折模型，结果表明可以刺激骨形成，减少骨丢失，改善骨折部位修复，增加骨强度^[26-28]。Padhi等^[29]将骨硬化蛋白单克隆抗体临床应用于健康男性和绝经期女性可以提高骨的形成。McClung等^[30]对低骨量绝经妇女进行临床Ⅱ期多中心随机试验，结果表明骨硬化蛋白单克隆抗体具有增加骨密度、促进骨形成、减少骨吸收等作用。Cosman等^[7]进行的临床Ⅲ期多中心、随机试验，数据显示romosozumab治疗绝经后女性骨质疏松症疗效显著优于特立帕肽。

目前大多研究着重于骨硬化蛋白单克隆抗体的研究，但单克隆抗体相对分子质量大，免疫原强，生产价值高，不易于临床推广。scFv是将抗体的轻、重链可变区基因通过一个连接肽连接起来的基因工程抗体，其相对分子质量小，组织穿透性强，易于进入局部发挥作用，有较强的结合力，同时其结构简单，可由大肠杆菌表达系统批量生产，显著降低生产成本。

动物实验证明拮抗骨硬化蛋白在增加骨量，改善骨强度和骨折愈合都有很好的效果^[26^，^31-33]，但很少有研究其对体外细胞培养的影响。作者在前期获得骨硬化蛋白单链抗体的基础上观察其对小鼠骨髓间充质干细胞的作用，MTT结果显示Scl-scFv对骨髓间充质干细胞的增殖作用并不明显。成脂诱导7 d后油红O染色，实验组细胞中可见明显红色圆形脂滴，说明所得骨髓间充质干细胞具有成脂能力。成骨诱导14 d后，实验组的钙结节多于阳性对照组，表明实验组细胞形成钙结节的能力要强于阳性对照组。同样在成骨诱导7 d后进行碱性磷酸酶染色，Scl-scFv促进了碱性磷酸酶的表达。实验组与对照组相比无论是Col1，Runx2或骨基质蛋白OCN和OPN在基因水平都有不同程度的上调，差异有显著性意义(P < 0.05)。Western blot显示实验组Col1和OPN的蛋白表达强于对照组，ELISA检测显示实验组细胞上清骨钙素表达强于对照组(P < 0.05)，说明骨硬化蛋白单链抗体可以促进骨髓间充质干细胞向成骨分化。

综上所述，将Scl-scFv作用于C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞，细胞增殖作用不明显，但可以促进成骨分化，为拮抗骨硬化蛋白治疗骨质疏松症的临床应用提供了新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

骨硬化蛋白单链抗体对骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响

Effects of sclerostin-single chain antibody fragment on the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

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