NOD2、NLRP3在石膏关节制动法建立兔膝骨性关节炎模型关节软骨中的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0139

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
高分子石膏：统称“高分子绷带或高分子夹板”，是传统石膏的升级换代产品，其主要由进口聚氨酯、聚酯和高分子纤维组成，其使用卫生、简单、轻便、硬化快、不怕水、无毒、无副作用，是骨科外固定理想的固定材料。
NOD样受体：又被称作炎症小体，是一种模式识别受体，主要存在于细胞质中，作为模式识别受体在自身免疫反应起始阶段中起重要作用，当受到细菌外毒素、破裂的溶酶体等等刺激之后活化，活化之后的炎症小体可以激活半光天冬氨酸蛋白酶1(caspase-1)蛋白从而促进细胞的死亡以及炎症反应。

摘要
背景：NOD样受体在抵抗外部病原微生物、自身的非细菌性炎症反应以及自身免疫反应过程的起始阶段中起着重要的作用，而NLRP3和NOD2是NOD样受体家族中具有代表性的两种重要蛋白。
目的：观察兔膝骨性关节炎模型中软骨细胞NOD2、NLRP3表达。
方法：30只新西兰大白兔随机分为6组：实验组分别设置2，4，6，8，10周组，采用石膏关节制动法建立兔左侧膝关节膝骨性关节炎模型，分别于术后2，4，6，8，10周处死对应实验组兔子；对照组不做任何处理，于第10周处死兔子5只。留取所有兔子的左股骨远端关节软骨标本，进行番红固绿染色，用Mankin’s法进行关节病理评分，免疫组织化学检测关节软骨中NOD2、NLRP3的表达水平。
结果与结论：①Mankin’s评分结果显示：实验组病理评分显著高于对照组(P < 0.01)，而且随着造模时间的推移各组间的Mankin’s评分增加，均有显著性差异(P < 0.01)；②免疫组织化学结果表明：NLRP3、NOD2在软骨细胞中的表达含量随着造模时间的推移也显著增高(P < 0.01)；③结果说明，NOD2、NLRP3在软骨细胞中的表达与膝骨性关节炎的病理变化程度呈正相关性，可能是通过促进细胞凋亡进而加速膝骨性关节炎的发生发展。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-0473-1604(孙银铁)

关键词: 骨性关节炎, NOD样受体, 半胱天冬氨酸蛋白酶1, 白细胞介素1β, 软骨凋亡, 关节蜕变, 无菌性炎症, 组织构建

Abstract:

BACKGROUND: Nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptor plays an important role against inflammatory responses caused by pathogens and non-pathogens, as well as in the initial stage of autoimmune response. Meanwhile, NOD2 and NOD-like receptor protein 3 (NLRP3) are the representative proteins of NOD-like receptor family.
OBJECTIVE: To detect the expression of NOD2 and NLRP3 in a rabbit model of osteoarthritis.
METHODS: Thirty New Zealand rabbits were randomly divided into six groups (n=5 per group), including five experimental groups (2, 4, 6, 8 and 10 weeks) and one control group. The model of osteoarthritis was established by fixing the left knee joints using plaster cast, and were sacrificed at postoperative 2, 4, 6, 8 and 10 weeks. The controls received no intervention, and were killed at 10 weeks postoperatively. The left distal femur articular cartilage was taken for safranin-fast green staining. The pathological changes were evaluated by Mankin’s scores, and the expression levels of NOD2 and NLRP3 were detected by immunohistochemistry.
RESULTS AND CONCLUSION: The Mankin’s scores in the experimental groups were significantly higher than those in the control group (P < 0.01). Moreover, the scores in the experimental groups were significantly increased with time (P < 0.01). The expression levels of NOD2 and NLRP3 in the chondrocytes were also increased with time (P < 0.01). These results indicate that the expresison of NOD2 and NLRP3 in the cartilage cells is positively correlated with the pathological changes of osteoarthritis, which may be through promoting apoptosis in cartilage cells, thus accelerating the development of osteoarthritis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Osteoarthritis, Caspase 1, Chondrocytes, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

孙银铁，郭开今，蔡红星. NOD2、NLRP3在石膏关节制动法建立兔膝骨性关节炎模型关节软骨中的表达[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(8): 1211-1216.

Sun Yin-tie, Guo Kai-jin, Cai Hong-xing. Expression of NOD2 and NLRP3 in the articular cartilage of a rabbit model of osteoarthritis established by arthrorisis using plaster cast[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(8): 1211-1216.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 30只新西兰大白兔在整个造模过程之中无脱失，均计入结果分析。

2.2 番红固绿染色结果对照组软骨表面光滑，软骨基

质呈红色，分布均匀，软骨细胞数量正常，无明显簇集、减少，潮线完整(图1A)；2周组软骨表面平整、光滑，软骨基质番红染色均匀、无明显减退，潮线完整清晰(图1B)；4周组软骨表面欠光滑，软骨基质番红染色稍减退，软骨细胞数量轻微减少，潮线较紊乱(图1C)；6周组软骨表面不光滑，基质番红染色减退较重，软骨细胞数量重度减少、成簇分布，潮线不完整(图1D)；8周组软骨表面崎岖、磨损较重，基质番红着色明显减退，软骨表面纤维化增生，潮线紊乱、消失(图1E)；10周组软骨表面有较大裂隙，部分软骨缺失，软骨基质番红染色不明显，软骨细胞数量严重减少，潮线模糊不清(图1F)。

Mankin’s评分的统计结果如表3所示：随着造模的时间的推移，各组关节软骨 Mankin’s评分逐步增加，各组之间比较差异有显著性意义(P < 0.01)。

2.3 免疫组织化学染色结果

2.3.1 NLRP3免疫组织化学染色对照组免疫组织化学染色无明显阳性细胞，仅有个别细胞有不明显的染色。实验组中NLRP3阳性细胞为棕色，主要表达于细胞质中，且随着造模时间的延长视野中的阳性细胞比例增高、阳性细胞染色强度也增加。见图2。

2.3.2 NOD2免疫组织化学染色结果对照组免疫组织化学染色无明显阳性细胞，仅有个别细胞有不明显的染色。实验组中NOD2阳性细胞为棕色，主要表达于细胞质中，且随着造模时间的延长视野中的阳性细胞比例增高、阳性细胞染色强度也增加。见图3。

统计结果见表4，实验组NLRP3、NOD2的免疫组织化学评分见图4。与对照组相比明显升高(P < 0.01)，且实验组免疫组织化学评分随着造模时间的延长逐步升高，各组间比较差异有显著性意义(P < 0.01)。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2016年6至12月在徐州医科大学中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物三四月龄新西兰大白兔30只，雌雄不限，由徐州医科大学实验动物中心提供。

1.3.2 实验用主要试剂与仪器番红固绿染色试剂盒(上海源叶生物科技有限公司)cryopyrin(NLRP3)单克隆抗体(biorbyt公司)，CARD1(NOD2)多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，超敏二步法免疫组织化学检测试剂盒(中杉金桥公司)，DAB显色试剂盒(中杉金桥公司)生物素-链霉卵白素免疫组织化学检测试剂盒(中杉金桥公司)。石蜡切片机(德国莱卡公司)，石蜡包埋机(德国莱卡公司)。普通管型石膏：冀州宏安医疗器械公司，高分子石膏：苏州可耐特医疗设备有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 动物模型制备将依次编号的30只新西兰大白兔按随机数字法分为6组，每组5只，分别设置为对照组1组和实验组5组，对照组不做任何处理，实验组采用伸直位固定法建立兔膝骨性关节炎模型，采用普通石膏和高分子材料结合的方法伸直位固定膝关节2，4，6，8，10周^[⁹^]。

1.4.2 动物组织处理过量二氧化碳法处死兔子，取股骨远端骨组织，浸入多聚甲醛溶液中固定24 h后PBS冲洗3次，每次2 min，浸入EDTA脱钙液中，每周更换脱钙液1次，待针刺组织无明显阻力感时取出，流水冲洗24 h，将组织沿矢状面切为4 mm组织块，脱水、包埋、切片。

1.4.3 番红固绿染色组织切片于70 ℃烤箱中过夜，后分别经过二甲苯脱蜡20 min 2次，梯度乙醇脱水后，铁苏木精染色5 min，蒸馏水冲洗，1%盐酸乙醇分化数秒，蒸馏水冲洗2 min，固绿染色5 min，蒸馏水漂洗30 s，番红染色5 min，蒸馏水漂洗1 min，乙酸漂洗1 min，蒸馏漂洗1 min，风干，二甲苯透明数秒，中性树脂封固，显微镜观察。

1.4.4 免疫组织化学染色组织切片于70 ℃烤箱中过夜，二甲苯脱蜡20 min两次，梯度乙醇脱水后蒸馏水、PBS漂洗各3 min。组织片于柠檬酸钠缓冲液中微波炉煮沸13 min，自然冷却后体积分数3%H₂O₂去离子水浸泡 10 min，PBS冲洗3次，滴加一抗4 ℃冰箱孵育，8 h后取出PBS冲洗3次，滴加聚合物辅助剂孵育15 m，滴加辣根酶标记抗兔IgG聚合物孵育15 min，PBS冲洗3次，DAB显色液显色15 s，PBS冲洗3次，苏木精复染5 min，蒸馏水冲洗2次，1%盐酸乙醇分化数秒，蒸馏水冲洗2 min梯度乙醇复水，二甲苯透明后中性树脂封固，显微镜观察。

1.5 主要观察指标

1.5.1 关节病理评分关节病理评分法采用Mankin’s关节评分法(表1)^[¹⁰^]。

1.5.2 NOD2、NNLRP3免疫组织化学表达含量评分NOD2、NNLRP3蛋白的表达含量以细胞质呈现棕褐色颗粒为阳性，高倍镜视野下每张切片随机选取3个视野进行评分，免疫组织化学评分根据阳性细胞百分比和染色强度综合评分。免疫组织化学阳性细胞的评分标准如表2所示，最终的评分结果为2个指标的乘积^[¹¹^]。

1.6 统计学分析以SPSS 16.0统计软件进行分析，统计分析中各指标数据均以x(_)±s表示，两组之间比较用q检验，多组比较用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

实验采用伸直位固定法建立兔膝骨性关节炎模型，利用管型石膏保持兔膝关节伸直位使兔膝关节长期处于负重状态，从而造成兔膝关节的骨性关节炎^[¹²^]。相对于各种膝关节炎的造模方法^[1³^]，实验在石膏材料上采用普通石膏和高分子材料结合的方法，内层直接以普通石膏包裹伸直位的膝关节，在兔髌骨部位垫以厚棉花以防止膝关节与石膏体摩擦发生炎症从而影响炎症指标的表达，普通石膏外层贴合高分子石膏，待外层高分子石膏干硬之后放回笼中自由活动。从结果来看，由于兔无法咬掉外层高分子石膏，所以石膏很少发生因被咬碎而脱落的情况，膝关节炎的造模结果比较理想。这种方法建立的关节炎模型更接近膝关节炎形成的自然过程，避免了因手术而引起的炎症对蛋白质表达的影响。

膝骨性关节炎是目前最常见的一种关节病变，为关节的退行性改变，主要表现为软骨下骨的硬化、软骨基质的崩解和软骨细胞数量的减少^[1⁴^]。软骨细胞的主要功能为合成和分泌Ⅱ型胶原蛋白、蛋白多糖等细胞外基质，对于维持软骨组织结构、形态正常起着重要的作用。软骨组织中软骨细胞数量的减少在膝骨性关节炎的发病发展中起着重要作用^[15-16]。

NOD样受体又称作炎症小体，和TLRs、RLRs、CTLs一样同为模式识别受体。作为模式识别受体在自身免疫反应起始阶段中起重要作用^[⁷^，¹⁷^-1⁸^]。研究表明，NLRPs通过接受PAMPs以及DAMPs的刺激而活化，从而激活caspase-1的2个亚基p10、p20，使白细胞介素1β、白细胞介素18的前体pro-IL1β、pro-IL18成熟，促进免疫应答的启动和细胞的炎性坏死^[⁸^，¹⁹^-²⁰^]；活化的白细胞介素1β可以激活核转录因子途径和丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径从而影响软骨细胞内基因的转录和修饰，引起细胞合成Ⅱ型胶原蛋白、蛋白多糖能力下降，最终导致关节基质的降解和关节炎症^[²¹^]。不仅如此，NLRPs在一种特殊的细胞死亡方式——细胞焦亡中也起着重要作用^[²²^-²⁴^]；细胞焦亡是一种被NLRPs激活的caspase-1和caspase-11引发的程序性死亡方式，caspase-1可以促进Gsdmd蛋白的活化使细胞发生死亡，其与细胞凋亡的区别在于不依赖caspase-3、-6、-8的活化^[²⁵^-2⁶^]。

从本实验结果可以看出：膝骨关节炎造模比较成功，各组之间Mankin’s关节评分均具有显著性统计学差异，膝关节退变情况随着时间的推移而加重；NLR在造模家兔软骨组织中表达含量随着关节炎的病情进展而递增，各实验组与对照组相比有统计学差异。鉴于该研究结果作者猜测NLR可能参与了骨关节炎的进展。推测：软骨细胞有可能受到外界的各种因素刺激后使细胞内部的NLR表达量增加促进了caspase-1的活化，导致其下游分子pro-IL1β、pro-IL18活化为白细胞介素1β、白细胞介素18的水平也随之升高，升高的白细胞介素1β、白细胞介素18通过一系列反应促进了骨关节炎的发展。受到NLR表达量增加的影响，caspase-1也有可能通过促进细胞焦亡使软骨组织中软骨细胞数量减少使得关节基质降解和减少、关节炎症进一步发展。本实验的局限性在于缺乏对于软骨细胞的干预手段，无法通过对细胞的直接干预阻断NLR的表达和活化，无法直接从细胞层面上测得caspase-1、白细胞介素1β等蛋白质的变化情况，从而在细胞层面上证明NLR与软骨死亡之间的确切关系。

综上所述：本实验的结果表明管型石膏固定兔膝关节诱发的骨性关节炎模型中，软骨细胞中NOD样受体在实验组的表达含量高于对照组，且随着造模的时间的延长表达量增加。提示NOD样受体在与骨关节炎的严重程度呈正相关。这为骨关节炎病理机制的深入研究提供了新的思路，即通过阻滞NOD样受体在的表达可能延缓软骨细胞的凋亡从而延缓骨关节炎的进一步发展。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程