SP细胞是由 ABCG2和P-gp所介导的染料外泵机制的结果
[7,9]。运用流式细胞术检测,在二维散点图上该群细胞明显偏离主群细胞而分布在靠近原点的低染区域,同时,在SP细胞群的判定上必须结合被维拉帕米所抑制的区域。Goodell等
[7]推荐在SP细胞检测中维拉帕米的浓度为50 mmol/L(25 mg/L),虽然大多数研究在检测SP细胞时使用上述推荐浓度,但SP区域被完全抑制的不多见。而本实验过程中,在对照管中做了3种维拉帕米质量浓度(25,37.5,50 mg/L)的对照,发现推荐浓度的维拉帕米并不完全抑制SP区域;增加维拉帕米至2倍(即50 mg/L)时,基本能完全抑制(SP细胞比例下降至0),而并未发现此浓度的维拉帕米对N-SP区域细胞分布形态有明显的影响。因此,作者认为维拉帕米质量浓度在50 mg/L时所抑制的这部分低染区域细胞确实是Raji中的SP细胞。本实验结果表明,Raji细胞系中可检测到的SP细胞比例在2%左右,与大多数肿瘤中SP细胞比例接近
[10-12],同时也有研究表明在一些肿瘤细胞中SP细胞的比例并不占少数
[13-14],而临床上这类肿瘤往往表现出难治性、高耐药性
[14]。因此,“SP表型”也许最主要的是反映了干细胞在耐药方面的“异质性”,有学者指出,数量的多少并不是CSCs的本质特征,应当转变对CSCs概念的认识
[15]。
Raji为人Burkitt’s淋巴瘤的建株系,该类型肿瘤为淋巴组织滤泡的生发中心B细胞来源[16],表达成熟B淋巴细胞相关抗原,如CD20,CD22和CD19,同时表达CD10,Bcl-6等生发中心抗原,而静止期B淋巴细胞抗原CD5表达为阴性[17]。因此,Raji是一群CD20+CD5-肿瘤细胞,这与作者所检测到的Raji中N-SP细胞(即主群细胞)抗原表达一致,而与其中的SP细胞亚群相反,后者表达CD5,而不表达CD20,提示Raji中的SP细胞是较主群细胞具有明显“异质性”的亚群细胞。在B淋巴细胞成熟过程中,CD20的表达最早出现在前B淋巴细胞,并持续表达至成熟B淋巴细胞的整个过程,而其后分化至浆细胞的过程中失去表达,因此它是成熟B淋巴细胞最广泛的分化标记[18];CD5最典型的是表达于静止的成熟B淋巴细胞(未接受抗原刺激),迁移至淋巴组织皮质部分套区时仍表达,而后至滤泡区受到有丝分裂原刺激后开始增殖后,CD5的表达逐渐失去,这一点也与CD5在慢性淋巴细胞白血病和套区淋巴瘤的表达高度一致(生发中心来源淋巴瘤不表达)[19]。WHO淋巴组织肿瘤类型及分化程度界定以正常淋巴细胞各分化阶段为参照基础,分化抗原表达情况是主要指标,反映了肿瘤分化停滞所在的阶段。因而从分化抗原表达情况来看,生发中心B淋巴细胞来源的肿瘤细胞Raji,其中的SP细胞亚群并非具有生发中心B淋巴细胞特点,似乎处于更早的分化阶段(更类似予静止期或套区B淋巴细胞的表达)。从分化程度来看,Raji中CD5+CD20-SP亚群可能为该类型肿瘤的起源细胞,而CD5-CD20+主群细胞(N-SP)极有可能是由前者分化而来,这一点与Matsui等[3]在多发性骨髓瘤干细胞研究中的理论相似。他们发现多发性骨髓瘤中主群细胞CD20-CD138+并不具有致瘤能力,而具有成熟B淋巴细胞标记的CD20+CD138-细胞亚群具有干细胞特性,后者分化程度更早期,且在正常淋巴及浆细胞成熟过程中CD20-CD138+细胞由CD20+CD138-分化而来;而在更早的关于急性白血病研究也显示,CD34+CD38-lin-亚群具有干细胞特性,CD34-lin+主群细胞却不具备[1,4,20],从分化程度来看,前者也处于更早期阶段。作者认为,Raji所代表的该类型肿瘤与急性白血病和多发性骨髓瘤中干细胞与主群细胞的分化关系类似,似乎“复制”了正常造血细胞分化成熟的某个过程,只是各处的阶段不同而已,因此CD5+CD20-SP亚群可能为该类型肿瘤的“干细胞”。
虽然CD34在Raji中SP和N-SP细胞中表达有一定差异性,但作者认为意义不大。CD34为造血干细胞重要标记,CD34+提示造血细胞分化较早,也是急性白血病CSCs重要标记[21]。目前的观点认为造血系统肿瘤CSCs有两个来源:①直接来源于正常的造血干细胞。②非正常干细胞直接来源,例如可以来源于外周处于持续增值状态的成熟淋巴细胞[22-23]。对于分化程度较低的肿瘤(如急性白血病)来说,已有研究提示其CSCs来源于前者(CD34+),而对于分化程度相对较高的外周成熟淋巴肿瘤来说(如生发中心来源淋巴瘤Raji),人们更倾向于其CSCs来源于后者,因此CD34并不是其特异标志。
P-gp是最早发现的介导肿瘤细胞多药耐药机制的重要分子[24]。通过其外排药物分子使肿瘤细胞避免化疗药物的打击,从而长期存活。该蛋白分子高表达于正常的干细胞及肿瘤干细胞中,和肿瘤耐药有直接关系。最早发现钙离子通道拮抗剂维拉帕米可以阻断P-gp“外泵”功能,因此临床上用于逆转肿瘤细胞的多药耐药性[25]。从SP及N-SP两组细胞P-gp的表达可以发现,虽然阳性表达率无明显差异,但SP细胞群中阳性细胞的表达强度明显高于N-SP,前者的平均荧光道数为后者的2倍以上。这说明在SP细胞中,与多药耐药有关的蛋白分子P-gp含量高于N-SP细胞群,这也与SP细胞本身外泵染料而表现为低染的特征相符,并与肿瘤干细胞高度耐药性有直接关系;而N-SP细胞P-gp的表达率和荧光强度已经有明显下调趋势。上述结果和现象也提示着Raji中SP细胞有可能富集了CSCs。
相关研究表明,富集了CSCs(或SP细胞)群中的细胞绝大多数处于G0/G1期[5,26],而N-SP细胞中G0/G1期细胞比例则明显减少。正是由于CSCs所具备这一特性,它们才能避免大多数化疗药物(细胞周期依赖性药物)的“攻击”。而本实验却发现,所检测到的分选后的RajiN-SP细胞中,G0/G1期比例竟然高达90%以上,这与目前的观点相悖,可能与本实验在设定细胞范围时只设定了其中一小部分为所需细胞范围,而作者所设定的这部分极有可能是属于二倍体区,因此,所检测到的N-SP细胞周期结果恰好是G0/G1期高比例。
结论:CSCs在造血系统肿瘤中的急性白血病和多发性骨髓瘤研究相对较多,也较深入,而仅有极少数关于分化成熟的淋巴细胞肿瘤干细胞的研究报
道
[27-30]。CSCs理论强调“异质性”细胞亚群,表现为致瘤能力、耐药性及分化程度的差异性,而本实验主要是从分化程度上的“异质性”(即分化抗原表达的差异性)来论证了淋巴细胞肿瘤中CSCs存在的可能性,这也为研究淋巴瘤提供了一定的理论依据。其次,作者在研究中发现Raji中SP细胞亚群为CD20
-,这一点似乎暗示了在Raji所能代表的该类型的成熟B淋巴细胞肿瘤中,经利妥昔单抗治疗后该群CD20
-细胞能逃避其打击,从而存活下来成为肿瘤复发的根源?这其实也是目前在临床上治疗B淋巴细胞肿瘤所面临的重要问题之一。当然,作者的研究只是初步的,尚需要更多的实验加以论证和完善。