金属植入物及Ⅰ型胶原蛋白基因多态性与自体骨移植后脊柱融合效果的相关性

doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.09.020

摘要/Abstract

摘要：

背景：基础研究表明Ⅰ型胶原蛋白在骨生成、骨的质量及骨折方面作用突出，同时参与骨融合过程，但关于此基因多态性与脊柱融合的关系鲜见报道。

目的：观察Ⅰ型胶原蛋白基因多态性，并探讨其与金属植入物及自体骨移植脊柱融合效果的相关性。

方法：随机选择青岛大学医学院附属医院住院患者中需行脊柱融合的自愿受试者200例，其中行颈椎前路椎体次全切除减压自体髂骨植骨融合钛板内固定者102例，腰椎后路椎板切除减压横突间植骨融合内固定者98例，以223名健康正常人作对照。抽取受试者外周静脉血，并提取白细胞DNA；采用聚合酶链反应扩增目的基因所在的DNA片段，扩增片段长度为293 bp；应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法检测外周血白细胞基因组Ⅰ型胶原蛋白基因Pcol2位点多态性，扩增产物经限制性内切酶Eco31I酶切，琼脂糖凝胶电泳观察，有酶切位点用G基因表示，无酶切位点用T基因表示；术前及术后3，6，12个月的X射线片观察植骨融合情况，按照快(< 3个月)、中(3~6个月)、慢(7~12个月)分期进行对比。

结果与结论：两组受试者均存在Ⅰ型胶原蛋白基因Pcol2位点-1997G/T多态性，GG型166例，GT型232例，TT型25例，并发现GG基因型与颈椎前路减压自体髂骨植骨融合有相关性(P=0.004)，该基因型在快组中占50%，明显高于中组(33.3%)和慢组(16.7%)；-1997G/T多态性与腰椎后路横突间植骨融合无相关性(P=0.831)。结果提示Ⅰ型胶原蛋白基因Pcol2位点-1997G/T单核苷酸多态性GG基因型可能是促进颈椎前路自体髂骨植骨融合的重要遗传基因。

关键词: 脊柱融合, COLIA1基因, 多态性, PCR-RFLP, 硬组织植入物

Abstract:

BACKGROUND: Basic research demonstrated that type I collagen exhibited prominent effect on osteogenesis, bone mass and bone fracture, which also participated in the bone fusion. However, few reports concerning the polymorphism of type I collagen gene and spinal fusion.

OBJECTIVE: To investigate the polymorphism of type I collagen and to explore its relationship with the spinal fusion rate following metal implant or autogenous bone transplantation.

METHODS: A total of 200 volunteers who need to receive spinal fusion in the Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College were selected, including 102 cases received anterior cervical subcorpectomy combined with iliac bone implantation fusion following decompression, and 98 cases received posterior laminectomy for decompression combined with intertransverse process fusion. Meantime, 223 normal adults were served as the control group. The peripheral blood was drawn-off and genomic DNA was extracted from white blood cells. The specific fragment which includes the objective gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR), with length of 293 bp. The genotypes of Pcol2 site in type I collagen were detected by PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method. The PCR product was digested with restriction endonuclease Eco31I and the result was observed by agarose gel electrophoresis. The G gene represented for the presence of the restriction endonuclease site, while the T gene for the absence of the restriction endonuclease site. The fusion rate of the bone graft was evaluated by x-ray film prior to and at months 3, 6 and 12 after operation, and the results were compared by stages including quick (<3 months), middle (3-6 months) and slow (6-12 months).

RESULT AND CONCLUSION: There were the -1997G/T polymorphisms of the type I collagen gene in 423 cases, including 166 cases with GG, 232 cases with GT, and 25 cases with TT, in addition, there was some correlation between the GG genotype and the iliac bone implantation fusion (P =0.004). The GG genotype accounted for 50% in the fast group, which was obviously greater than that of the middle and slow groups (33.3% and 16.7%, respectively). However, the -1997G/T polymorphisms had no correlation with the bone graft fusions inter transverse process of lumbar vertebra (P=0.831). The GG genotype in the -1997G/T polymophsim of the type I collagen gene may be the essential factor which can promote the C-spine auto-ilium graft fusion

中图分类号:

R394.2

胡明涛，陈晓亮，周传利，王德春，刘涛. 金属植入物及Ⅰ型胶原蛋白基因多态性与自体骨移植后脊柱融合效果的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2010, 14(9): 1607-1611.

Hu Ming-tao, Chen Xiao-liang, Zhou Chuan-li, Wang De-chun, Liu Tao. Correlation between type Ⅰ collagen gene polymorphism and spinal fusion rate following autologous bone transplantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2010, 14(9): 1607-1611.

参考文献

引言

脊柱融合是治疗脊柱疾患最常用的手术方法之一，骨性融合重建脊柱稳定性是此类手术治疗远期疗效的保障，自体松质骨移植被称作促进脊柱融合的金标准，但因手术时间长且易致供骨区出现长期慢性疼痛、感染，更有甚者可导致疝的发生，给患者带来了极大的痛苦。同种异体骨及生物替代材料因存在融合率低等问题临床应用受到诸多限制。随着内固定材料的发展和各类手术方式的改进创新，现已完全能够实现对脊柱坚强的内固定，但是无论术中采用何种内固定系统，如果术后未能达到有效的骨性融合，可能会出现内固定松动、移位甚至出现断钉、断棒等临床并发症，最终会导致手术节段失稳，甚至手术失败。脊柱融合过程复杂，其中的各种机制尚未完全阐明。但可以肯定的是脊柱融合除了依靠坚强的内固定器械以外还依靠植骨材料及植骨部位共同参与来调控植骨融合部位以达到完全的骨性融合^[1-3]。这就要求人们寻求一种新的思路来解决现存的植骨融合率低的问题。近年来快速发展起来的基因技术为植骨融合的发展指出了新的方向，而大量的基础研究表明，基因因素在骨生成、骨的质量及骨折方面作用突出^[1]。因此，基因治疗在脊柱融合的临床治疗中可能会成为现有各种促进脊柱融合方法的重要补充。目前国内外对于Ⅰ型胶原蛋白基因的多态性进行了大量的研究，结果表明其与骨质疏松及成骨功能障碍等关系密切，但在既往的各项研究中作者发现对该基因多态性与脊柱融合的关系鲜有报道^[2]。本实验旨在通过山东半岛地区的脊柱融合患者的该基因多态性的研究，探讨Ⅰ型胶原蛋白基因多态性与金属植入物及自体骨移植脊柱融合之间的关系。

材料方法

讨论

据以往的研究结果，骨形态发生蛋白2、生长分化因子5、Ⅰ型胶原蛋白等因子是调节骨生成和骨诱导的重要因子，同时参与骨融合过程，任何基因的异常均有可能影响脊柱融合的质量，其中骨形态发生蛋白2、生长分化因子5经国内研究表明其基因突变与脊柱融合存在相关性^[4-5]。胶原蛋白为生物体提供机械支撑，其中Ⅰ型胶原蛋白在骨骼的有机质中比例超过了80%，其主要生理功能即形成和保持骨架的完整性。Ⅰ型胶原蛋白是细胞外基质(尤其是骨组织)的最主要组成成分，该蛋白由Ⅰ型胶原蛋白和Ⅱ型胶原蛋白两种基因控制，并编码产生两条a1和一条a2肽链，由3条肽链组合形成三螺旋结构。当基因突变会导致两者比例失衡，影响软骨及骨形成。研究表明由Ⅰ型胶原蛋白合成的有序排列的胶原纤维数量与其形成骨的强度正相关^[6]。Ⅰ型胶原编码区的基因突变会产生常染色体遗传病即成骨不全症。而现阶段对Ⅰ型胶原蛋白的研究多是关于其与骨质疏松、成骨不全及骨折等方面^[7]，国外报道Ⅰ型胶原蛋白基因内含子1的G/T(sp1)单基因多态性与腰椎及股骨颈的骨密度相关^[8-16]。Bernad等^[16]发现Ⅰ型胶原蛋白sp1 TT基因型的绝经后妇女骨折率是其他基因型的4.8倍。在亚洲地区包括中国的大部分地区、韩国及日本的大量人群的试验研究却尚未发现该多态性位点的基因多态性^[12-13]。而国内多项研究除陶军等^[4-6]2004年报道1例sp1GT外，余尚未发现该位点突变报道，由此可以推断Ⅰ型胶原蛋白基因SP1位点多态性存在地区或种族差异，而在亚洲罕见或不存在。2002年，在西班牙有265名绝经妇女接受研究表明在Ⅰ型胶原蛋白基因的启动子存在单基因(-1997G/T)多态性，且与腰椎的骨密度之间存在高度相关性，TT基因型较其他基因型腰椎密度显著减少。2004年，在对国内湖南1 263名受试者研究显示-1997G/T多态性与股骨颈密度显著相关(P=0.036)，GG基因型受试者骨密度较GT、TT基因型者平均高2.41%^[16]。现尚未有涉及Ⅰ型胶原蛋白基因多态性与脊柱融合的关系的研究，因其是调节骨生成和骨诱导并参与骨融合过程，其基因发生异常改变可能会影响脊柱融合的质量。本实验的结果显示Ⅰ型胶原蛋白基因-1997G/T单核苷酸多态性与脊柱融合之间存在相关性，在病例组与对照组中都存在-1997G/T单核苷酸多态性的三种基因型即GG、GT、TT，但其在两组中的分布差别无统计学意义(P=0.745)，病例组多态性分布差异与颈椎前路减压自体髂骨椎间植骨融合有相关性(P=0.004)，GG基因型病例数在快组中占50%，远高于中组(33.3%)和慢组(16.7%)，因此GG可能是促进颈椎融合的重要遗传因子。而多态性分布与腰椎后路横突间植骨融合之间没有相关性(P=0.831)，因为影响腰椎后路横突间植骨融合的因素较多，脊柱后外侧横突间融合具有独特的局部微环境，横突细小，去皮质后对移植物的血液供应小，特别是移植物的中央部位，需要血管再化生；横突间融合是在椎体旁肌肉间的大段异位成骨，其融合的机制和所受的力学环境比较复杂，影响因素较多。骨融合是一个涉及多因子的复杂过程，包括骨生成、骨诱导和骨传导3个环节直至在成骨和破骨间达到动态平衡，随着内固定器械的进步，骨融合率得到了明显提高，但却依然不能避免融合失败的发生，据报道有5%~35%的单节段脊柱融合患者发生植骨不融合的情况，而多节段脊柱融合患者骨不连的发生率更高^[17]。10%~15 %的脊柱融合患者有假关节的发生^[18]。因此对影响植骨融合的影响因子的研究变得尤为重要，本实验通过对Ⅰ型胶原蛋白基因-1997G/T多态性的研究发现，该基因多态性与颈椎前路自体髂骨植骨融合间有相关性，可能是促进脊柱融合的关键因子。目前对于行脊柱融合的患者而言，选择自体髂骨植骨融合仍然是临床的常规治疗方法，动物试验研究表明局部基因治疗可以促进脊柱融合^[1,19]。根据本实验结果可尝试将Ⅰ型胶原蛋白基因GG型种子细胞导入需行融合的脊柱节段特定解剖部位以期促进局部脊柱融合。由于本实验该仅是初步探索，需要继续扩大样本量进行更深一步的临床研究，基因治疗技术有望成为促进脊柱融合的常规手段。

[1]	姬志祥, 蓝常贡. 尿酸盐转运蛋白在痛风中的多态性和治疗相关性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1290-1298.
[2]	陈江, 李晋玉, 郑晨颖, 白春晓, 张帆, 刘楚吟, 赵学千, 袁巧妹, 邸学士, 康晟乾, 贾育松. 双节段颈人工椎间盘置换与颈椎间盘切除融合后颈椎矢状位参数的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(15): 2341-2346.
[3]	刘君昌, 高小林, 姜泰茂. CYP3A5基因多态性与肾移植受者他克莫司浓度/剂量的关系及个体化用药[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1740-1744.
[4]	冯程钦, 曾平, 罗钧, 刘金富, 黄佳兴. 维生素D受体基因多态性与骨关节炎关系的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(33): 5405-5412.
[5]	杨金丰, 马三辉. 椎间盘退行性变与HTRA1和HAPLN1基因多态性的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(32): 5128-5132.
[6]	卢秋平，桂裕昌，许建文，覃海飚，饶远森. 维生素D受体基因多态性与胸腰段骨质疏松性椎体压缩骨折半定量分型的关联[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(35): 5577-5581.
[7]	杨金丰，马三辉. 聚集蛋白代谢通路基因多态性与腰椎间盘突出严重程度的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(31): 4939-4944.
[8]	全湛柔，何柳媚，陈浩，洪文旭，高素青. 深圳地区乙型肝炎病毒携带者人白细胞抗原C等位基因多态性分布特点[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(3): 482-486.
[9]	易国良，王善坤，宋西正. 腰骶椎带锁轴向融合内固定的生物力学测试[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(28): 4546-4551.
[10]	梁茂华，毛克亚，夏波，刘强，唐佩福，王继芳. β-磷酸三钙/α-半水硫酸钙复合人工骨修复兔脊柱多节段椎板间融合的成骨性能[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(22): 3500-3505.
[11]	李鹏飞，王涛，马信龙. 亚洲人COL9A2基因单核苷酸多态性与椎间盘退变相关性的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(20): 3275-3280.
[12]	刘洋，杨庆华，关业文，王嘉琦，江华. 广西壮族人群8q24.21区域单核苷酸多态性与腰椎退行性疾病的相关性：800例资料分析[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(19): 2980-2985.
[13]	梁茂华，毛克亚，夏波，刘强，唐佩福，王继芳. Micro-CT评价β-磷酸三钙/α-半水硫酸钙复合人工骨在脊柱多节段椎板间融合中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(18): 2800-2805.
[14]	唐福波，周劲衍，张翼升，钟远鸣，李智斐，莫怡. 颈椎前路单椎体次全切钛笼植骨融合后钛笼下沉的相关危险因素[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(12): 1818-1823.
[15]	范思奇，曾平，赖崇荣，刘雄. 亚甲基四氢叶酸还原酶C677T基因位点多态性与股骨头坏死关系的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(35): 5730-5734.