胚脑和新生动物脑内富含成体神经干细胞,其主要集中在嗅球、前脑、侧脑室室管膜下区、海马、脊髓、小脑(部分后脑)和大脑皮质共7个区域,尤其室管膜下区是神经发育和中枢神经再生的重点部位
[10-11]。成年动物脑内的神经干细胞则数量稀少,主要位于室管膜下区部位,目前多选用胚脑成体神经干细胞用于移植治疗研究。外源性神经干细胞移植不仅可以在移植物体内存活,并可以诱导内源性神经干细胞的发生
[12]。对成年动物的移植研究已有较长时间,对新生动物的研究则相对较少。从有限的新生动物神经干细胞移植实验结果表明,新生动物具有明显优于成年动物的移植内环境及移植效果,因而对新生动物进行脑内神经干细胞移植,较成年动物具有更好的可行性。研究证实,新生动物脑正处于发育状态,脑内促生长、促分裂因子的表达均十分活跃,神经细胞赖以迁移的放射状胶质细胞尚未消失,对新生动物进行脑内神经干细胞移植,所植入神经干细胞的增殖、迁移、分化、轴突形成以及髓鞘化等能力,将均为成年动物所望尘莫及,因而外源性的修复作用在新生动物脑内较成年动物具有更明显的效果。实验通过分离孕12~14 d胎鼠大脑皮质的成体神经干细胞进行纯化培养,成功培养了成体神经干细胞。可见呈悬浮状生长的神经干细胞在3 d左右形成神经细胞球,其体积并逐渐增大,每六七天传代1次。培养的第1~3代神经球少见分化,因而第1~3代均可视为纯神经球。经过特性的神经干细胞标志物巢蛋白鉴定,各代神经球中几乎均呈巢蛋白染色阳性,因而可确认培养物为神经干细胞,并表明所培养的神经干细胞具有稳定的自我更新和增殖能力
[6]。 1992年,有作者利用含有表皮生长因子的无血清培养基悬浮培养鼠脑的纹状体细胞,证实该细胞群具有未分化特点
[7]。实验采用含碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、B27的无血清培养基,所培养的神经干细胞可以自我更新,增值迅速,传代稳定,并保持未分化特点,因此该培养基可推荐用于神经干细胞的培养。在培养过程中观察到所培养的神经干细胞经过反复传代后,至10代左右神经干细胞球的细胞团增殖速度比原代明显减慢,且部分老化。因而今后如何建立一个能稳定传代的神经干细胞系尚待进一步探讨
[13]。
实验曾尝试通过单细胞克隆的方法进行神经干细胞的培养纯化,但发现经机械分离后的单细胞悬液不易形成神经球,这可能与神经干细胞的生长特点需要与其他神经干细胞互相支持生长有关,其可能还需要依赖其他神经干细胞分泌的各种细胞因子以及细胞外基质分子的作用,在多个神经干细胞聚集在一起、分泌一些利于神经干细胞生长的细胞因子的情况下,神经干细胞才能正常生长。当培养的细胞密度不够时,培养液中所分泌的各种细胞因子浓度也不足,因而不能满足神经干细胞的生长需求
[14]。实验中每个培养瓶的细胞接种密度为0.25×10
9 L
-1。注意到细胞接种密度小于或等于0.25×10
8 L
-1(25 mL培养瓶)时,细胞生长差,神经干细胞球形成较少;而细胞接种密度大于或等于0.25×10
10 L
-1(25 mL培养瓶)时,细胞生长则过于旺盛,神经干细胞成片生长,营养消耗大,导致很快死亡。因而掌握合宜的细胞接种密度对能否成功培养至关重要。将第4代神经干细胞放入去除B27、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、并含有体积分数为10%小牛血清的分化培养基进一步诱导分化培养,显示其迅速贴壁生长,并逐渐出现突起和分支,培养至4 d可见细胞突起之间相互连接形成网状并逐渐稠密。10~14 d可辨认出不同的细胞形态,如呈多角形的散在胶质细胞、典型的突起长、细胞小的神经元形态细胞,以及呈现分支短、细胞小的少突胶质细胞等。免疫组化结果分别证实呈GFAP、β-tublin和O4阳性的胶质细胞、神经元以及少突胶质细胞前体。其中呈现多量β-tubin阳性神经元,其体积小,明显的较长突起,分支较多,呈双极或多级细胞为其特征。GFAP阳性胶质细胞,表现为细胞体积较大,突起多而短,有的呈膜片状。O4阳性少突胶质细胞前体,在集落中其细胞体积最小,突起很少且短。上述细胞形态观察以及免疫组化分析结果证实,所培养的成体神经干细胞完全具备向多种神经细胞类型分化的潜能,这也和其他作者的研究结果相似
[15]。实验通过对孕14 d胎鼠大脑皮质进行分离后纯化培养,并对培养的成体神经干细胞进行干细胞标志物鉴定和诱导分化鉴定,确认所培养的细胞确系成体神经干细胞,并完全具备向多种神经细胞类型分化的潜能。应用上述培养的神经干细胞,课题组成功对脑室周围白质软化新生大鼠进行了经脑室神经干细胞移植,证实经脑室植入的外源性神经干细胞在脑内具有良好的迁移和分化能力,在脑室周围主要分化为少突胶质细胞前体,移植后21 d光镜和电镜显示脑白质病理明显改善,髓鞘形成显著增加
[16-17]。