转化生长因子β1基因转染鼠脂肪间充质干细胞的可行性

doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.01.014

摘要/Abstract

摘要：

背景：脂肪间充质干细胞在转化生长因子β1等生长因子的调控下可被诱导分化为软骨细胞。然而，外源性转化生长因子β1存在引起趋化性、激发炎症反应、造成局部损伤、有效成分容易被稀释或丢失、半衰期短、缺少理想的转运蛋白等缺陷。因此，利用基因重组技术，使种子细胞表达转化生长因子β1，对软骨组织工程的进一步发展具有重要的指导意义。

目的：探讨真核表达载体pcDNA3.1-转化生长因子β1质粒的构建方法，并观察其转染脂肪间充质干细胞的可行性。

方法：利用基因重组技术，将大鼠转化生长因子β1全长基因的PCR产物与克隆载体pT7Blue连接，并用大肠杆菌筛选阳性重组体构建真核表达质粒，采用XboⅠ、Hind Ⅲ双酶切及测序方法对质粒进行鉴定；将已经纯化的pcDNA3.1-转化生长因子β1质粒和空载体pcDNA3.1质粒分别采用阳离子脂质体试剂Lipofectamine^TM2000转染脂肪间充质干细胞，经G418抗性筛选后扩大培养，同时用pcDNA3.1-绿色荧光蛋白观察转染效率。

结果与结论：重组质粒经XboⅠ、Hind Ⅲ双酶切后出现1.35 bp和5.4 kb 2条带，测序结果显示重组质粒所包含的转化生长因子β1全长碱基序列完全正确，绿色荧光蛋白显示其转染脂肪干细胞的转染效率> 80%，且转染细胞后有转化生长因子β1 mRNA和蛋白的表达上调。提示利用基因重组技术可成功构建能转染脂肪间充质干细胞的真核表达载体pcDNA3.1-转化生长因子β1质粒。

关键词: 基因重组, 载体, 质粒, 脂肪间充质干细胞, 转化生长因子β1

Abstract:

BACKGROUND: Adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) can be induced toward the chondrogenic lineages with chondrogenic medium contained transforming growth factor-β1(TGF-β₁). However, it remains concerned about the disadvantage with use of TGF-β₁ in vitro, which can induce chemotaxis, activate inflammatory cells, cause local defect and want an ideal matrix to deliver proteins. Therefore, with advanced gene-delivery techniques, TGF-β₁ can be long-lasting expressed by transduced stem cells, which is very useful for Chondrogenic Tissue Engineering.

OBJECTIVE: To master the method of construction and transfection of eukaryotic expression vector for rat transforming growth factor-β1 and to study the possibility of gene transfection to ADSCs with this vector.

METHODS: Recombining DNA techniques were applied to construct recombinant plasmid pcDNA3.1-TGF-β₁. And this plasmid was verified by restriction endonuclease mapping and DNA sequencing; Then the plasmid with TGF-β₁ gene or not was transfected into ADSCs by use of Lipofectamine^TM2000. After infection, transduced ADSCs were diluted and cultured with neomycin (G418). Gene transfer efficiency compared on the basis of green fluorescent protein expression was assessed.

RESULTS AND CONCLUSION: Digestion of the plasmid with double restriction endo- nuclease XboⅠand Hind Ⅲ showed about two specific electrophoretic strips (1.35 bp and 5.4 kb), and the sequence of the rat TGF-β₁ gene in recombinant was concorded with that reported in Genbank. There were 80 percent of the cells which were transduced, and the expressions of mRNA and protein of TGF-β₁ in ADSCs were discovered positively. These indicated that the eukaryotic expression vector for rat TGF-β₁ (i.e. pcDNA3.1-TGF-β₁) , which is able to transfect the ADSCs, can be constructed through genetic recombination.

中图分类号:

R394.2

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参考文献

引言

材料方法

讨论

临床上因肿瘤、感染、退行性病变和创伤导致的关节软骨的损伤和缺损的治疗面临着再生能力低，修复差的挑战^[5]。近年来，随着组织工程科学和生命科学的交叉，结合细胞生物学、工程学、材料科学和外科学的软骨组织工程技术为解决软骨修复难题开辟了一条新的途径。软骨组织工程的目的是重建新的有功能组织，为关节软骨的修复奠定基础，以期能够获得最终长期的功能恢复^[6-7]。在构建组织工程化软骨的过程中，种子细胞、细胞外基质材料和促进细胞分化与组织再生的生物活性分子三要素相互作用，相互影响，缺一不可，是构成软骨组织工程学的基本要素^[8]。作为软骨组织工程种子细胞的来源之一，软骨细胞是一种高分化细胞，它位于软骨陷窝中，主要呈圆形，其平均直径为13 μm，具有高度特异性。研究表明，正常的软骨细胞能分泌细胞外基质蛋白，同时也合成、分泌多种基质降解酶，软骨细胞通过合成和降解细胞外基质而在维持正常关节功能中发挥关键的作用。Brittberg等^[9]总结采用自体软骨细胞移植治疗的950例膝关节损伤患者的临床资料，发现在获得随访的213例中，有84%~90%的股骨不同类型缺损的患者经过2~10年后仍有良好的疗效。然而，人类的软骨细胞难于分离，复制慢，可获得的细胞数量小，其增殖和分化能力有限，且培养过程中易于去细胞表型分化，并可因供区病变而形成新的关节软骨损伤，同时它还受供者年龄和健康状态的影响^[10-11]。此外，随着体外培养时间的延长，软骨细胞逐渐丧失其特异性蛋白Ⅱ型胶原的表达，而其反分化标志Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达逐渐增加，软骨细胞出现老化^[12-13]。Barbero等^[14]通过研究发现当人的年龄超过30岁时，软骨组织中所含的软骨细胞明显减少，而当年龄大于20岁时，从软骨组织中获得的软骨细胞的增殖率也随着年龄的增长而下降。因此软骨细胞的应用显著受到抑制。由于干细胞具有无限或较长期的自我更新能力，且有多向分化潜能，因而成为构建组织工程化软骨很有潜力的种子细胞。其中，间充质干细胞是主要来源，在一定的条件下，其能分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞和成肌肉细胞^[15-17]。有关骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞，进而构建组织工程化软骨的研究较多，但是由于骨髓间充质干细胞来源有限，且可导致伤口感染，供区畸形，甚至引起全身脓毒血症^[18]，故其应用也受到极大的限制。随着干细胞研究的深入，人们发现ADSCs与骨髓基质干细胞一样，也来源于胚胎早期的中胚层，Zuk等^[19]于2001年在脂肪组织中分离出一种能自我更新、稳定增殖、具有多向分化潜能的成体干细胞，即ADSCs，后来人们证实在体外特定的培养基诱导条件下，ADSCs可以定向诱导分化为成骨细胞、神经细胞、肌细胞、脂肪细胞和软骨细胞^[20-23]。相对于骨髓基质干细胞而言，ADSCs具有来源广泛、易于获得、对机体影响小、并且可获得大量的细胞数目等优点^[24-26]。在前期的研究中，课题组将从SD大鼠双侧腹股沟脂肪或加取雄鼠附睾脂肪获得的原代细胞进行流式细胞仪检测，结果发现细胞表面表达CD29、CD44均超过95%，仅有5%表达CD34，从而初步认定培养细胞为间充质干细胞^[27]。Winter等^[28]发现从脂肪组织和骨髓组织中获得的基质细胞在数量、生长动态、细胞凋亡和基因转染方面没有明显的区别，同时在特定的成软骨培养基条件下，无论是单层培养还是高密度微团培养，两者的软骨分化能力并没有明显差异。而De Ugarte等^[29]在同样条件下从同一患者获取ADSCs和MSCs，并进行分析，结果发现ADSCs的成软骨能力优于MSCs。所以在本实验也将采用ADSCs作为种子细胞来构建组织工程化软骨。目前，调节ADSCs向软骨细胞分化的机制尚未完全清楚，但近年研究表明，TGF-β1是成软骨细胞分化的重要调节因子，它作为TGF-β家族中的一员，既在细胞分化期发挥分化作用；同时又能阻止软骨细胞肥大，是维持关节软骨所必须的^[30-31]。TGF-β1可通过外源性途径作用于种子细胞，即在细胞培养基中加入外源性TGF-β1、把细胞外基质材料与TGF-β1复合或向关节腔分次注射TGF-β1等；然而，和其他生长因子与细胞因子一样，在局部应用外源性TGF-β1治疗时，其有效成分很容易被稀释或丢失，从而无法充分有效地发挥作用；并且，外源性蛋白治疗存在费用高，半衰期短，易超过生理剂量而出现不良反应，以及缺乏能长时间保持不变的理想转运蛋白等局限性而致其应用受阻^[32]。随着现代分子生物学技术的发展，通过利用基因重组技术，将编码治疗因子的基因转染到种子细胞，使治疗因子作为内源性因子由种子细胞合成、分泌，从而减少治疗因子大剂量反复使用的不良反应，保持治疗因子在损伤局部达到稳定有效的浓度^[33]。这些对于软骨组织工程的进一步发展具有重要的指导意义和应用价值。本实验利用基因重组技术，通过非病毒载体pcDNA3.1将编码TGF-β1的基因转染到种子细胞上，使TGF-β1通过内源性途径由种子细胞编码合成，并表达分泌，以克服使用外源性TGF-β1时的种种缺陷。因为总RNA的质量是合成PCR产物的前提，所以实验将抽提的ADSCs的总RNA进行浓度和纯度的鉴定，结果总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S、5S 3条带，紫外分光光度计测A₂₆₀/A₂₈₀均在1.8~2.0之间，说明抽提总RNA纯度较高、完整性好，未降解且纯度符合要求。就基因治疗而言，真核表达载体的构建及其能在真核细胞中获得表达是基因治疗能否取得成功的关键。在选择转染方式和媒介方面，脂质体(liposome)由脂质双分子层构成，它与细胞膜的结构十分相似，因此它极易覆着于细胞膜，而其携带的目的基因也随之进入细胞胞浆而被导入细胞核内；同时其免疫源性较小，使用时较为安全；此外，它们容易大量生产，花费也更便宜；因此，本实验选择脂质体为载体转染目的基因。实验通过利用基因重组技术，将TGF-β1基因的PCR产物与克隆载体pT7Blue连接，并用大肠杆菌筛选阳性重组体，构建真核表达质粒，同时该质粒经XboⅠ、HindⅢ双酶切出现2条带，其中一条相对分子质量较小约为1.35 bp，另一条相对分子质量较大约为5.4 kb，表明重组的质粒为所需的质粒；而该质粒经测序鉴定，结果显示其所包含的TGF-β1全长碱基序列完全正确，与基因库中的人TGF-β1序列完全一致，从而进一步证实了实验已用脂质体成功构建出真核表达载体pcDNA3.1-TGF-β1质粒。随后，分别将已经纯化的pcDNA3.1-TGF-β1质粒和空载体pcDNA3.1质粒分别采用阳离子脂质体试剂Lipofectamine^TM2000转染ADSCs，3 d后用G418筛选抗性细胞，2周后(终浓度达400 mg/L)未转染的细胞(阴性对照)全部死亡，而转染空质粒pcDNA3.1 (阳性对照)、目的基因质粒pcDNA3.1-TGF-β1的细胞绝大多数死亡，仅残留少数贴壁细胞。而多个视野荧光细胞计数显示其转染效率> 80%，提示已有效的将目的基因片段转染入细胞中。最后，挑选呈克隆样生长的细胞继续扩大培养，经700 mg/L的G418作用2周后，未转染基因的ADSCs全部死亡，从而初步证明脂质体介导的基因转染获得成功，实验已建立转染pcDNA3.1空质粒或TGF-β1基因的ADSCs细胞系；接着，按常规方法检测已转染pcDNA3.1-TGF-β1质粒的第4代ADSCs中TGF-β1 mRNA的表达，并将转染空载体pcDNA3.1的细胞为阴性对照，结果见转染组细胞中有相对分子质量为480 bp的TGF-β1片断，说明TGF-β1基因已被转染ADSCs并转录成mRNA。同时实验采用Western Blot方法检测了TGF-β1蛋白的表达，结果显示TGF-β1蛋白的表达水平较转染空质粒组明显增高，说明TGF-β1基因转染ADSCs后，TGF-β1 mRNA合成了TGF-β1蛋白。

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