白芷细胞外囊泡对抗黑色素的思路和方法

doi:10.12307/2026.310

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (7): 1747-1754.doi: 10.12307/2026.310

• 干细胞外泌体 Stem cell exosomes • 上一篇下一篇

白芷细胞外囊泡对抗黑色素的思路和方法

周思瑞1，徐玉坤1，赵可伟2

1广州中医药大学第三临床医学院，广东省广州市 510378；2广州中医药大学第三附属医院检验科，广东省广州市 510378

收稿日期:2025-02-05 修回日期:2025-06-13 接受日期:2025-06-30 出版日期:2026-03-08 发布日期:2025-08-20
通讯作者: 赵可伟，博士，主任技师，广州中医药大学第三附属医院检验科，广东省广州市 510378
作者简介:周思瑞，女，1999年生，2025年广州中医药大学毕业，硕士，主要从事中草药囊泡在美容美白方面的研究

Ideas and methods of anti-melanogenesis of Angelica dahurica extracellular vesicles

Zhou Sirui1, Xu Yukun1, Zhao Kewei2

1Third Clinical Medical College, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510378, Guangdong Province, China; 2Department of Laboratory Medicine, Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510378, Guangdong Province, China

Received:2025-02-05 Revised:2025-06-13 Accepted:2025-06-30 Online:2026-03-08 Published:2025-08-20
Contact: Zhao Kewei, MD, Chief technician, Department of Laboratory Medicine, Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510378, Guangdong Province, China
About author:Zhou Sirui, MS, Third Clinical Medical College, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510378, Guangdong Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

网络药理学：是一种新兴的交叉学科，结合了系统生物学、生物信息学、药理学和多组学技术，旨在从整体层面深入研究药物与生物系统之间的复杂相互作用，其核心理念是通过构建和分析生物分子网络，研究药物与疾病之间的多靶点、多途径相互作用机制，从而打破传统药物研究中“单一药物、单一靶点”的局限，为药物研发和疾病治疗提供更为全面和系统的理论支持。
细胞外囊泡：是由细胞主动分泌或被动释放的纳米级(30-1 000 nm)膜包被结构，具有脂质双分子层，内含蛋白质、核酸(DNA、RNA)和代谢物等生物活性分子。根据细胞外囊泡来源、大小和形成机制，主要分为3类：外泌体、微囊泡、凋亡小体，分别通过内体途径、细胞膜出芽和细胞凋亡形成。细胞外囊泡在细胞间通讯、免疫调节、组织修复和疾病发生中发挥重要作用。

摘要
背景：黑色素的过度生成是导致皮肤色素沉着和色斑形成的主要原因，生成过程受多种酶和细胞信号通路的调控。白芷作为一种传统中药材，其提取物在美白和抗炎方面具有一定的功效，但其细胞外囊泡在抗黑色素生成中的作用尚不清楚。
目的：探讨白芷细胞外囊泡对黑色素生成的影响及潜在机制。
方法：首先利用超速差速离心法从白芷中分离和纯化细胞外囊泡，通过透射电子显微镜和纳米流式分析仪对细胞外囊泡形态和粒径进行表征。采用网络药理学分析方法，筛选出9种白芷的活性成分，并预测活性成分与黑色素生成相关基因的相互作用。最后利用野生AB型斑马鱼动物模型，将不同浓度的白芷细胞外囊泡作用于斑马鱼，通过观察体表色素沉着变化以及测定酪氨酸酶活性，评估白芷细胞外囊泡的抗黑色素生成效果。

结果与结论：白芷细胞外囊泡呈典型的囊泡形态，粒径分布在30-150 nm。网络药理学分析发现，白芷中的多种活性成分如油酸乙酯、别欧前胡素等与黑色素生成相关基因如GSK3β、MITF等可能存在相互作用。在斑马鱼模型中，白芷细胞外囊泡处理组的体表色素沉着明显减少。此外，白芷细胞外囊泡还能显著降低斑马鱼的酪氨酸酶活性，其中1×108 particle/mL细胞外囊泡降低酪氨酸酶活性约30%。这些结果表明，白芷细胞外囊泡具有显著的抗黑色素生成功效，作用机制可能与调控黑色素生成相关基因酪氨酸酶的表达有关。因此，白芷细胞外囊泡有望作为美白化妆品的活性成分，为皮肤色素沉着问题的解决提供了新的思路和方法。

https://orcid.org/0009-0004-0600-6769 (周思瑞)；https://orcid.org/0000-0002-0500-5295 (赵可伟)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 抗黑色素, 白芷细胞外囊泡, 网络药理学, 斑马鱼模型, 酪氨酸酶, 色素沉着

Abstract: BACKGROUND: Excessive melanin production is a primary cause of skin pigmentation and the formation of age spots. This process is intricately regulated by various enzymes and cellular signaling pathways. Angelica dahurica, a traditional Chinese medicinal herb, has long been recognized for its potential benefits in skin whitening and anti-inflammatory effects. However, the role of its extracellular vesicles in inhibiting melanogenesis remains largely unexplored.
OBJECTIVE: To investigate the effects of Angelica dahurica extracellular vesicles on melanin production and their underlying mechanisms.
METHODS: Extracellular vesicles were first isolated and purified from Angelica dahurica using ultracentrifugation. The morphology and size distribution of these vesicles were characterized using transmission electron microscopy and nanoparticle tracking analysis. Through network pharmacology analysis, we identified nine active components in Angelica dahurica and predicted their interactions with genes involved in melanogenesis. Finally, different concentrations of Angelica dahurica extracellular vesicles were applied to a wild-type AB zebrafish model to assess their anti-melanogenesis effects by observing changes in surface pigmentation and measuring tyrosinase activity.
RESULTS AND CONCLUSION: Angelica dahurica extracellular vesicles exhibited typical vesicular morphology with a size distribution ranging from 30 to 150 nm. Network pharmacology analysis suggested that several active components in Angelica dahurica, such as ethyl linoleate and byakangelicin, may interact with melanogenesis-related genes like GSK3β and MITF. In the zebrafish model, treatment with Angelica dahurica extracellular vesicles significantly reduced surface pigmentation. Moreover, these Angelica dahurica extracellular vesicles notably decreased tyrosinase activity in zebrafish, with a reduction of approximately 30% at a concentration of 1×108 particles/mL. These findings indicate that Angelica dahurica extracellular vesicles possess significant anti-melanogenesis effects, likely through the regulation of melanogenesis-related genes and enzymes. Therefore, Angelica dahurica extracellular vesicles hold great potential as active ingredients in whitening cosmetics, offering new insights and approaches for addressing skin pigmentation issues.

Key words: anti-melanogenesis, Angelica dahurica extracellular vesicles, network pharmacology, zebrafish model, tyrosinase, pigmentation

中图分类号:

周思瑞, 徐玉坤, 赵可伟. 白芷细胞外囊泡对抗黑色素的思路和方法[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(7): 1747-1754.

Zhou Sirui, Xu Yukun, Zhao Kewei. Ideas and methods of anti-melanogenesis of Angelica dahurica extracellular vesicles[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(7): 1747-1754.

图/表（结果） 3

2.1 白芷细胞外囊泡的表征 超速差速离心法从白芷中提取出细胞外囊泡，透射电镜观测到白芷细胞外囊泡呈双分子层椭圆形状(图1A)，通过纳米流式仪检测白芷细胞外囊泡的粒径、浓度，粒径在50-180 nm之间(图1B)，蛋白条带显示白芷细胞外囊泡蛋白分子质量在30-35 kD之间(图1C)。Triton X-100破膜结果显示提取出来的白芷细胞外囊泡的纯度为82%(图1D)。
2.2 白芷内含物与黑色素瘤相关成分靶点的联系 在TCMSP数据库中检索“白芷”，设定筛选条件为生物利用度≥30%和类药性≥0.18，共筛选出17种有效成分。随后，通过Swiss Target Prediction数据库查询这些成分的SMILES号。在17种有效成分中，有8种未能找到相关靶点。经过合并与去重处理后，最终获得302个潜在靶点。此外，从GeneCards数据库中总共鉴定了999个黑色素瘤相关的靶标。如图2A所示，共鉴定了61个白芷和黑色素瘤的共同靶标。此外，网络药理图(图2B)进一步展示了白芷细胞外囊泡中活性化合物与色素沉着相关交集靶点之间的相互作用。
将白芷和黑色素瘤的61个共同靶点导入到STRING 11.5数据库中，构建蛋白互作网络图。如图2C所示，其中有2个与黑色素生成相关的核心蛋白MITF与GSK3β。
将白芷和黑色素瘤的交集靶点导入Metascape数据库进行GO富集分析和KEGG通路富集分析(图2D，E)，其中GO分析主要是生物过程。

2.3 白芷细胞外囊泡对斑马鱼胚胎的抗黑色素作用 用含白芷细胞外囊泡以及熊果苷的培养液培养斑马鱼胚胎，于72 h后在体式显微镜下拍摄斑马鱼的体表侧面图(图3)，与单纯培养液组相比，随着白芷细胞外囊泡浓度的增加，斑马鱼体表色素呈逐渐变浅的趋势。熊果苷作为阳性对照，结果显示该组斑马鱼体表色素逐渐变浅，最终证明白芷细胞外囊泡与熊果苷均能显著降低斑马鱼体表色素沉着，表明两者在抑制黑色素生成方面具有较强的活性。

同时，评估不同浓度白芷细胞外囊泡(1×108 particle/mL，1×109 particle/mL)和熊果苷(1 mg/mL)对斑马鱼胚胎发育的影响，结果表明这些浓度均未对胚胎产生毒害作用(图4A-C)。随后，将给药后72 h的斑马鱼进行组织研磨，采用NaOH法检测黑色素含量，结果显示，与单纯培养液组相比，熊果苷组和1×109 particle/mL白芷细胞外囊泡组黑色素含量降低(P < 0.05)(图4D)。
2.4 白芷细胞外囊泡对斑马鱼胚胎酪氨酸酶的影响为了证实白芷细胞外囊泡在斑马鱼胚胎中对酪氨酸酶的抑制作用，通过L-多巴氧化法来检测斑马鱼体内酪氨酸酶的活性[29]，结果显示，在1×108 particle/mL白芷细胞外囊泡作用下，斑马鱼体内的酪氨酸酶浓度降低了30.3%，在1×109 particle/mL白芷细胞外囊泡作用下，斑马鱼体内的酪氨酸酶浓度降低了25.5%(图4E)。PCR实验结果显示，两种不同粒子数的白芷细胞外囊泡显著抑制了黑色素生成关键因子酪氨酸酶的表达，证明了白芷细胞外囊泡具有很好的降低黑色素生成的效果(图4F)。

参考文献

[1] LI Y, XIAO Q, TANG J, et al. Extracellular Vesicles: Emerging Therapeutics in Cutaneous Lesions. Int J Nanomedicine. 2021;16:6183-6202.
[2] HUMPHREY S, MANSON BROWN S, CROSS SJ, et al. Defining Skin Quality: Clinical Relevance, Terminology, and Assessment. Dermatol Surg. 2021;47(7):974-981.
[3] BELLU E, MEDICI S, CORADDUZZA D, et al. Nanomaterials in Skin Regeneration and Rejuvenation. Int J Mol Sci. 2021;22(13):7095.
[4] 何毅帆,龙芸鸾,李征,等.天然植物美白成分作用机理的研究进展[J].日用化学品科学,2022,45(10):37-43.
[5] PROSPÉRI MT, GIORDANO C, GOMEZ-DURO M, et al. Extracellular vesicles released by keratinocytes regulate melanosome maturation, melanocyte dendricity, and pigment transfer. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024;121(16):e2321323121.
[6] JIANG X, YANG C, WANG Z, et al. Loss-of-function variants in GLMN are associated with generalized skin hyperpigmentation with or without glomuvenous malformation. Br J Dermatol. 2024;191(1):107-116.
[7] SAMPEDRO-GUERRERO J, VIVES-PERIS V, GOMEZ-CADENAS A, et al. Encapsulation Reduces the Deleterious Effects of Salicylic Acid Treatments on Root Growth and Gravitropic Response. Int J Mol Sci. 2022;23(22):14019.
[8] CHENG Y, ZHANG L, YOU Y. The effects of supramolecular nicotinamide combined with supramolecular salicylic acid on chloasma. J Cosmet Dermatol. 2024;23(2):681-686.
[9] SEARLE T, AL-NIAIMI F, ALI FR. The top 10 cosmeceuticals for facial hyperpigmentation. Dermatol Ther. 2020;33(6):e14095.
[10] PHILIPP-DORMSTON WG. Melasma: A Step-by-Step Approach Towards a Multimodal Combination Therapy. Clin Cosmet Investig Dermatol. 2024;17:1203-1216.
[11] 郭聪颖.富硒绿豆发酵液面膜的研发和富硒黑茶的活性初探[D].上海:上海师范大学,2020.
[12] 李薄薄,马洁,朱士强,等.抑制黑色素合成信号通路的植物美白原料的研究与开发[J].日用化学品科学,2023,46(3):21-28.
[13] 马畅,李妍.白芷、白芍水和乙醇提取物对酪氨酸酶的抑制效应[J].香料香精化妆品,2023(2):54-58.
[14] 鹿发展,刘平平,刘娟.白芨花提取物的美白、抗氧化和抗衰老功效研究[J].云南化工,2024,51(10):100-104.
[15] 付媛媛,顾玲,何艳,等.洋甘菊提取物在化妆品中的应用研究进展[J].香料香精化妆品,2023(2):132-137.
[16] ALBUQUERQUE PBS, DE OLIVEIRA WF, DOS SANTOS SILVA PM, et al. Skincare application of medicinal plant polysaccharides - A review. Carbohydr Polym. 2022;277:118824.
[17] NG SY, EH SUK VR, GEW LT. Plant polyphenols as green sunscreen ingredients: A systematic review. J Cosmet Dermatol. 2022;21(11): 5409-5444.
[18] POLERÀ N, BADOLATO M, PERRI F, et al. Quercetin and its Natural Sources in Wound Healing Management. Curr Med Chem. 2019;26(31): 5825-5848.
[19] LAN J, SUN L, XU F, et al. M2 Macrophage-Derived Exosomes Promote Cell Migration and Invasion in Colon Cancer. Cancer Res. 2019;79(1): 146-158.
[20] CHUNG CC, CHAN L, CHEN JH, et al. Plasma extracellular vesicles tau and β-amyloid as biomarkers of cognitive dysfunction of Parkinson’s disease. FASEB J. 2021;35(10):e21895.
[21] KESHTKAR S, AZARPIRA N, GHAHREMANI MH. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Res Ther. 2018;9(1):63.
[22] 鲍少杰.虾青素对肠道炎症的影响及西兰花胞外囊泡载虾青素体系构建[D].扬州:扬州大学,2021.
[23] LI C, SONG Q, YIN X, et al. Preparation, Characterization, and In Vitro Anticancer Activity Evaluation of Broccoli-Derived Extracellular Vesicle-Coated Astaxanthin Nanoparticles. Molecules. 2022;27(12):3955.
[24] CONG L, MA J, ZHANG Y, et al. Effect of anti-skin disorders of ginsenosides- A Systematic Review. J Ginseng Res. 2023;47(5):605-614.
[25] GABRIELLI M, BATTISTA N, RIGANTI L, et al. Active endocannabinoids are secreted on extracellular membrane vesicles. EMBO Rep. 2015; 16(2):213-220.
[26] COSSETTI C, IRACI N, MERCER TR, et al. Extracellular vesicles from neural stem cells transfer IFN-γ via Ifngr1 to activate Stat1 signaling in target cells. Mol Cell. 2014;56(2):193-204.
[27] PARK JJ, HWANG SJ, KANG YS, et al. Synthesis of arbutin-gold nanoparticle complexes and their enhanced performance for whitening. Arch Pharm Res. 2019;42(11):977-989.
[28] DING Y, JIANG Y, IM ST, et al. Diphlorethohydroxycarmalol inhibits melanogenesis via protein kinase A/cAMP response element-binding protein and extracellular signal-regulated kinase-mediated microphthalmia-associated transcription factor downregulation in α-melanocyte stimulating hormone-stimulated B16F10 melanoma cells and zebrafish. Cell Biochem Funct. 2021;39(4):546-554.
[29] SHI G, FENG Y, TONISSEN KF. Development of a human tyrosinase activity inhibition assay using human melanoma cell lysate. Biotechniques. 2024;76(11):547-551.
[30] 朱翠翠.调节黑色素生成的主要信号通路[J].日用化学品科学, 2023,46(7):61-70.
[31] WANG Z, ZHANG D, SHUI M, et al. Investigation of the whitening activity of ginsenosides from Panax notoginseng and optimization of the dosage form. J Ginseng Res. 2024;48(6):543-551.
[32] SANJAYA SS, PARK MH, KARUNARATHNE WAHM, et al. Inhibition of α-melanocyte-stimulating hormone-induced melanogenesis and molecular mechanisms by polyphenol-enriched fraction of Tagetes erecta L. flower. Phytomedicine. 2024;126:155442.
[33] CHO J, JUNG H, KANG DY, et al. The Skin-Whitening and Antioxidant Effects of Protocatechuic Acid (PCA) Derivatives in Melanoma and Fibroblast Cell Lines. Curr Issues Mol Biol. 2023;45(3):2157-2169.
[34] TUNG XY, YIP JQ, GEW LT. Searching for Natural Plants with Antimelanogenesis and Antityrosinase Properties for Cosmeceutical or Nutricosmetics Applications: A Systematic Review. ACS Omega. 2023;8(37):33115-33201.
[35] CAI CS, HE GJ, XU FW. Advances in the Applications of Extracellular Vesicle for the Treatment of Skin Photoaging: A Comprehensive Review. Int J Nanomedicine. 2023;18:6411-6423.
[36] JANG B, CHUNG H, JUNG H, et al. Extracellular Vesicles from Korean Codium fragile and Sargassum fusiforme Negatively Regulate Melanin Synthesis. Mol Cells. 2021;44(10):736-745.
[37] CHAMBERS ES, VUKMANOVIC-STEJIC M. Skin barrier immunity and ageing. Immunology. 2020;160(2):116-125.
[38] ZHAO B, LIN H, JIANG X, et al. Exosome-like nanoparticles derived from fruits, vegetables, and herbs: innovative strategies of therapeutic and drug delivery. Theranostics. 2024;14(12):4598-4621.
[39] WOITH E, GUERRIERO G, HAUSMAN JF, et al. Plant Extracellular Vesicles and Nanovesicles: Focus on Secondary Metabolites, Proteins and Lipids with Perspectives on Their Potential and Sources. Int J Mol Sci. 2021;22(7):3719.
[40] NATANIA F, IRIAWATI I, AYUNINGTYAS FD,et al. Potential of Plant-derived Exosome-like Nanoparticles from Physalis peruviana Fruit for Human Dermal Fibroblast Regeneration and Remodeling. Pharm Nanotechnol. 2025;13(2):358-371.

引言

皮肤是人体的第一道防线，它能保护身体免受有害的外部环境刺激，如果干扰皮肤正常的结构和功能会导致各种皮肤异常[1]。关注皮肤状态不止是为了外在的美观，也反映了自身的整体健康、活力以及营养状态[2]。皮肤状态与内在的细胞衰老、年龄相关的改变、黑色素的变化等影响因素有关。皮肤组织再生与年轻化是护肤品市场追求的目标[3]。人体肤色差异通常取决于表皮层黑色素、类胡萝卜素以及真皮层血红素等含量与分布，其中黑色素为主要影响因素，皮肤白皙与否主要取决于黑色素细胞合成黑色素的能力[4-6]。
目前，市面上常用的美白化学剂主要有熊果苷及衍生物、虾青素、曲酸及衍生物、烟酰胺、水杨酸等，这些产品长期使用容易导致皮肤不适以及皮肤炎症，同时表现出较差的皮肤穿透性[7-10]。研究表明，许多植物来源的天然分子通过不同的机制来影响黑色素的生成[11-14]，安全性已经得到了临床验证[15]。许多植物来源成分对人体还具有抗菌、防晒、愈合伤口、免疫调节等作用[16-18]。
与市面上已有的植物衍生美容产品相比，植物源性囊泡样纳米颗粒更易于细胞吸收且安全稳定、亲和力高。植物源性囊泡样纳米颗粒的脂质双分子层结构，使它成为运送疏水以及亲水药物和成分的理想载体，例如它可以装载抗胃肿瘤的药物，从而诱导细胞凋亡，抑制肿瘤增殖[19-21]。在护肤领域，植物源性囊泡样纳米颗粒同样可以负载虾青素、视黄醇等分子[22-23]。已有研究发现人参来源囊泡状纳米颗粒可以降低黑色素生成相关因子酪氨酸酶(tyrosinase，TYR)、酪氨酸酶相关蛋白2(tyrosinase-related protein 2，TRP2)和Ras相关蛋白27(ras-related protein 27，RAB)的蛋白表达水平[24]。
植物源性囊泡样纳米颗粒能够通过与靶细胞相互作用以调控靶细胞的功能，靶细胞可通过两种方式摄取囊泡样纳米颗粒，第一种是内吞作用或者是与囊泡样纳米颗粒直接融合，第二种是通过与囊泡样纳米颗粒表面的蛋白质结合并激活细胞上表达的受体[25-26]，这种高效的细胞摄取机制不仅提高了药物的传递效率，还减少了药物在非靶组织中的分布，从而降低了潜在的不良反应。
该研究旨在探讨白芷细胞外囊泡对黑色素生成的影响及潜在机制。首先，通过超速差速离心法从白芷中分离和纯化细胞外囊泡，并对细胞外囊泡形态和粒径进行表征；然后，结合网络药理学分析，筛选白芷中的活性成分，并预测白芷活性成分与黑色素生成相关基因的相互作用；最后，利用野生AB型斑马鱼动物模型，评估白芷细胞外囊泡的抗黑色素生成效果。该研究不仅为白芷细胞外囊泡在皮肤美白领域的应用提供了科学依据，还为开发新型美白化妆品和解决皮肤色素沉着问题提供了新的思路和方法。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 ①细胞外囊泡的提取与表征：从白芷中提取细胞外囊泡，并对细胞外囊泡的粒径、浓度和形态进行表征；②网络药理学分析：通过数据库分析白芷的有效成分及其与黑色素瘤的潜在靶点关系；③斑马鱼体内实验：研究白芷细胞外囊泡对斑马鱼胚胎黑色素生成和酪氨酸酶活性的影响。
1.2 时间及地点 实验于2024年6-11月在中草药囊泡工程研究中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验药物、动物、试剂、耗材 药材白芷[国药集团冯了性(佛山)药业有限公司]；麻醉剂MS-222(JY-B30815062，北京玖研科技有限公司)；野生AB型斑马鱼(环特生物科技有限公司)；甲基纤维素(S14010，源叶生物)；Triton X-100(上海碧云天生物技术有限公司)；DNase(赛默飞世尔科技有限公司)；超离管(贝克曼库尔特有限公司)；蛋白酶K(伊莱瑞特生物技术有限公司)；1.5 mL EP管(广州信禾生物科技有限公司)；50×TAE电泳缓冲液(上海爱必信生物科技有限公司)；磷钨酸(索莱宝生物技术有限公司)；酮网(中镜科仪科技有限公司)；甲醇(中国上海Aladdin试剂有限公司)；PBS(武汉普诺赛生命科技有限公司)；胰酶(上海麦克林生化科技有限公司)；预染蛋白marker(上海爱必信生物科技有限公司)；反转录试剂盒[宝日医生物技术(北京)有限公司]；UltraSYBR Mixture (High ROX)(北京康为世纪生物科技有限公司)；熊果苷(上海麦克林生化科技股份有限公司)；NAOH溶液(广州化学试剂厂)；L-多巴(深圳赛尔玛生物技术有限公司)。
1.3.2 实验仪器 超高速离心机(赛默飞世尔科技有限公司)；0.22 μm/0.45 μm微孔过滤膜(天津市津腾实验设备有限公司)；电子天平(上海卓精电子科技有限公司)；切向流仪器(保定迪创电子科技有限公司)；凝胶成像分析系统(上海勤翔科学仪器)；多功能破壁机(广东省中山市德力霸电器有限公司)；透射电子显微镜(日本电子株式会社)；纳米流式检测仪(Nano FCM)(厦门福流生物科技有限公司)；酶标仪(帝肯奥地利有限责任公司)；3000离心机(北京白洋医疗器械有限公司)；抽滤仪器(杭州博钻机电制造有限公司)；混匀振荡器(北京白洋医疗器械有限公司)；PCR扩增仪(珠海海马医学仪器有限公司)；黑马PCR分析仪(德国QIAGEN公司)；10000离心机(高速冷冻离心机)(广州极迪仪器有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 白芷细胞外囊泡的提取 从500 g白芷中提取细胞外囊泡，首先用冷的PBS浸泡白芷15 min，然后用榨汁机在4 ℃低温下进行榨汁，用超精细过滤袋(100目)过滤汁液，再将滤液10 000×g离心30 min，用VRera磁力搅拌器过滤上清液，去除100 kD分子质量以下的分子，浓缩后的液体再次10 000×g离心60 min，通过0.22 μm滤膜过滤以去除大碎片，最后使用wX+ULTRA SERIES超离机在4 ℃、100 000×g离心70 min以浓缩细胞外囊泡，用PBS重悬后保存于-80 ℃。
1.4.2 白芷细胞外囊泡的表征 使用纳米流式仪测定细胞外囊泡的粒径和浓度。通过0.1% Triton X-100处理白芷细胞外囊泡30 min以破膜，再次检测细胞外囊泡的粒径和浓度。白芷细胞外囊泡的纯度(%)=(破膜前粒子数-破膜后粒子数)/破膜前粒子数×100%。透射电镜(JEOL-1400)观察细胞外囊泡的形态，具体步骤：在6 cm培养皿上放置铜网，滴加10 μL样本并沉降10-30 min，吸干后滴加10 μL磷钨酸染色30 s，再吸干，将铜网转移到滤纸上阴干至少2 h，然后进行透射电镜拍摄。
1.4.3 白芷-黑色素瘤的网络药理学分析 利用TCMSP数据库找出白芷的有效成分，将筛选条件设置为生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18。将各个有效成分输入PubChem数据库(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取SMILES号，并在Swiss Target Prediction数据库(http://swisstargetprediction.ch/)中搜集各个成分的潜在靶点，导出预测靶点的标准基因ID名，合并去重后得到成分靶点。通过Gene Cards数据库(http: //www.genecards.org)查找与黑色素瘤相关的靶点，通过Venny2.1.0(http: //liuxiaoyuyuan.cn)获得黑色素瘤与白芷的交集靶点。将获取到的交集靶点导入到String数据库(http: //www.string-db.org)中，得到蛋白互作网络图。
将靶点和药物活性成分导入Cytoscape 3.9.0软件，建立有效成分-靶点的网络图。在Metascape数据库(http://metascape.org/)中对交集基因进行GO生物过程分析以及KEGG信号通路分析。
1.4.4 斑马鱼体内研究 在正式实验开展前，通过预实验确定了斑马鱼对熊果苷和白芷细胞外囊泡的适宜生长浓度，阳性药物熊果苷适宜质量浓度为1 mg/mL，白芷细胞外囊泡低、高浓度分别设置为1×10⁸ particle/mL和1×10⁹ particle/mL。将受精后5 h的野生AB型斑马鱼胚胎按15个/孔放入6孔板中，在受精后5-24 h内，采用斑马鱼专用培养液进行培养，以帮助斑马鱼胚胎逐步适应实验环境，为后续实验处理奠定基础。受精后24 h分别用斑马鱼培养液、含1 mg/mL阳性药物熊果苷的斑马鱼培养液、含1×108 particle/mL白芷细胞外囊泡的斑马鱼培养液、含1×109 particle/mL白芷细胞外囊泡的斑马鱼培养液处理72 h，置于28.5 ℃恒温培养箱，每天光照14 h，每24 h更换1次培养液。给药后每隔24 h记录斑马鱼的存活率。
实验选用的是斑马鱼胚胎，并在给药后3 d结束实验。根据欧盟动物保护法，斑马鱼胚胎在孵化后5 d内通常被认为不属于受保护的动物阶段，因为此时胚胎尚未发育到具有独立生存能力的状态。因此，在该阶段进行的实验操作可免于完整的伦理审查。
1.4.5 斑马鱼体表色素沉着拍摄 将麻醉剂MS-222稀释100倍，然后加入到含6%甲基纤维素的沸水中搅拌均匀。用一次性巴氏吸管将给药72 h后的斑马鱼仔从6孔板中吸出，置于凹玻片，将配好的0.5 mL含0.05%麻醉剂的纤维素液滴到凹玻片上，通过体式显微镜LGY-20拍摄活斑马鱼仔的数字图像，观察斑马鱼体表色素沉着情况[27]。
1.4.6 白芷细胞外囊泡对斑马鱼胚胎的抗黑色素作用 将发育至6-8 h的斑马鱼胚胎随机分配到6孔板中，每孔15枚胚胎，在受精后24 h，向各孔中分别加入2 mL含1 mg/mL熊果苷或1×108 particle/mL白芷细胞外囊泡或1×109 particle/mL白芷细胞外囊泡的斑马鱼培养液处理72 h，随后收集15只斑马鱼胚胎，置于-80 ℃处死，组织研磨，4 ℃、10 000 r/min离心15 min，采用NaOH裂解法测定斑马鱼黑色素含量：向离心后的沉淀物中加入500 µL含10%二甲基亚砜的1 mol/L NaOH溶液重悬，置于80 ℃水浴60 min，将冷却后的液体转入96孔板，以未处理组作为空白对照，使用酶标仪测定405 nm波长的吸光度值，计算斑马鱼体内黑色素相对含量。黑色素相对含量=实验组吸光度值/空白对照组吸光度值×100%[28]。
1.4.7 白芷细胞外囊泡对斑马鱼胚胎酪氨酸酶活性的影响 用1.4.6方法处理72 h后收集15只斑马鱼胚胎，置于-80 ℃处死，PBS洗涤3次，加入含1%Triton X-100的PBS 100 μL，超声破碎处理5 min，4 ℃、10 000 r/min离心15 min，上清液即斑马鱼酪氨酸酶粗提液，采用L-多巴氧化法测定斑马鱼酪氨酸酶活性。酪氨酸酶活性(%)=(样本吸光度值/空白对照组吸光度值)×100%，该检测方法是基于酪氨酸酶催化3，4-二羟基苯丙氨酸氧化生成多巴醌，进而形成多巴色素的过程。
1.4.8 斑马鱼黑色素生成相关基因酪氨酸酶的表达 为了进一步探究白芷细胞外囊泡调节黑色素生成的机制，将白芷细胞外囊泡和阳性药物熊果苷给药干预72 h后的斑马鱼使用TRIzol Reagent进行裂解，从斑马鱼中分离出总RNA，使用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR检测。引物序列合成如下：β-actin-F：5'-GGC TGT ATT CCC CTC CAT CG-3'；β-actin-R：5'-CCA GTT GGT AAC AAT GCC ATG T-3'；TYR-F：5'-CTC TGG GCT TAG CAG TAG GC-3'；TYR-R：5'-GCA AGC TGT GGT AGT CGT CT-3'。
1.5 主要观察指标 ①斑马鱼体内黑色素细胞的数量和分布情况；②斑马鱼胚胎的黑色素相对含量；③斑马鱼胚胎的酪氨酸酶活性。

1.6 统计学分析 采用 GraphPad Prism 9.5软件进行统计学分析，计量资料均以x±s表示，符合正态分布且满足方差齐性的计量资料，多组间均值比较采用one-way ANOVA单因素方差分析，多重比较采用LSD 法。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已通过广州中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

既往研究表明，黑色素生成是一个复杂的生物过程，受多种酶(如酪氨酸酶)和细胞信号通路(如MITF、GSK3β)的调控[30]。传统美白成分如熊果苷、曲酸等虽然具有一定的美白效果，但长期使用可能导致皮肤不适和炎症，且皮肤穿透性较差。近年来，天然植物来源的美白成分逐渐受到关注，如人参、白芷等中药植物提取物，因安全性高和多靶点作用机制而被广泛研究[31-34]。然而，既往研究多集中于植物提取物的整体功效，对于细胞外囊泡这一特定组分在抗黑色素生成中的作用机制尚不清楚。
细胞外囊泡包括外泌体、微囊泡和凋亡小体，是一类具有脂质双层结构的生物颗粒，它们不仅存在于动物细胞，也存在于植物细胞中[35-36]。囊泡样纳米颗粒在皮肤护理学中已取得显著成就，特别是在皮肤伤口愈合方面，发挥着促进血管生成、调节局部炎症和促进胶原沉积等关键作用。囊泡样纳米颗粒与皮肤修复过程的协同作用，以及在调节细胞间通讯中的功能，预示着它在皮肤美白领域的潜在功效[37]。
此研究首次利用超速差速离心法从白芷中分离和纯化细胞外囊泡，并结合透射电镜、纳米流式分析仪等技术对形态和粒径进行了详细表征。研究发现，白芷细胞外囊泡具有典型的囊泡形态，粒径分布为30-180 nm，且纯度较高。通过网络药理学分析发现白芷的有效活性成分可能与黑色素生成相关基因相互作用，揭示了其潜在的分子机制。已有研究表明，植物源性细胞外囊泡属于植物成分，具备其同源植物潜在的生理功能[38-40]。此研究利用野生AB型斑马鱼模型，证实了白芷细胞外囊泡在体内环境中对黑色素生成的显著抑制作用，且未观察到明显的毒性。PCR结果显示，白芷细胞外囊泡能够显著降低黑色素生成关键因子酪氨酸酶mRNA表达。这些结果不仅填补了白芷细胞外囊泡在抗黑色素生成领域的研究空白，还为天然植物来源的美白成分开发提供了新的方向，后续研究可进一步开发基于白芷细胞外囊泡的复合制剂，以增强其美白效果并减少潜在的不良反应，通过临床前和临床试验验证白芷细胞外囊泡的安全性和有效性。
综上所述，此研究为白芷细胞外囊泡在抗黑色素生成领域的应用奠定了基础，但其临床转化仍需进一步深入研究和验证。
结论：此研究首次从中药白芷中提取出白芷源性细胞外囊泡，系统性地探索了白芷细胞外囊泡在抗黑色素生成中的作用机制，并通过斑马鱼模型验证了其显著的美白效果。研究结果表明，白芷细胞外囊泡能够有效抑制黑色素生成，且无显著毒性，作用机制可能与下调黑色素生成关键因子酪氨酸酶mRNA表达水平有关。基于此研究的成果，白芷细胞外囊泡有望成为一种新型的天然美白成分，为皮肤美白和色素沉着相关疾病的治疗提供新的选择。

白芷细胞外囊泡对抗黑色素的思路和方法

Ideas and methods of anti-melanogenesis of Angelica dahurica extracellular vesicles

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[1]	陈钰璘, 何莹莹, 胡凯, 陈枝凡, 聂莎, 蒙衍慧, 李闰珍, 张小朵, 李宇稀, 唐耀平. 瓜蒌类外泌体囊泡防治动脉粥样硬化的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(7): 1768-1781.
[2]	彭志伟, 陈雷, 佟磊. 木犀草素促进糖尿病小鼠创面愈合的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(6): 1398-1406.
[3]	陈伊娴, 陈晨, 卢立恒, 汤锦鹏, 于晓巍. 雷公藤甲素治疗骨关节炎的网络药理学分析与实验验证[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(4): 805-815.
[4]	陈跃平, 陈锋, 彭清林, 陈荟伊, 董盼锋. 三七治疗骨关节炎机制：基于UHPLC-QE-MS、网络药理学及分子动力学模拟[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1751-1760.
[5]	江启煜, 曾慧妍. 基于人工智能和组学数据驱动的中药潜在机制新型分析预测方法[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(35): 7552-7561.
[6]	王通, 郑宇, 贾承明, 杨虎, 张广飞, 纪垚垚. 基于TCMSP数据库分析葛根麻芪方治疗肩周炎并2型糖尿病的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(35): 7669-7678.
[7]	方源, 钱智勇, 何源哈达, 王海燕, 沙丽蓉, 李筱贺, 刘婧, 贺雅超, 张凯, 特木日巴根. 蒙药蓝刺头对血管内皮细胞增殖和血管生成能力的潜在作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(35): 7519-7528.
[8]	张鑫, 郭宝娟, 徐慧鑫, 沈玉珍, 杨晓帆, 杨旭芳, 陈培 . 丁苯酞对帕金森病细胞模型的保护作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(30): 6466-6473.
[9]	李溯, 王清华, 达梦婷, 杨蕊, 陈道桢. 藤黄酸下调蛋白C受体表达杀伤三阴性乳腺癌干细胞的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(23): 4888-4898.
[10]	赖越, 林轩, 徐淼, 刘欢, 沈剑粦, 黄文华. 海洋中药治疗骨质疏松的用药规律及作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(17): 3713-3723.
[11]	古玉凤, 邓丙英, 李倪仁, 曾译萱, 鲁思凡, 朱晨, 陈磊, 刘怡. 苦参总黄酮改善非酒精性脂肪肝的作用机制及斑马鱼实验验证[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(14): 2969-2978.
[12]	张文胜, 郭海威, 翁汭, 莫凌, 宋振杰, 田瀚, 钟业霖, 王元成, 唐汉武, 刘才俊, 原超, 李颖. 甘草苷抑制破骨细胞分化缓解骨丢失[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(12): 2429-2437.
[13]	张天栋, 彭青平, 刘欢, 冯建国, 易茜, 黄文华. 菟丝子治疗骨关节炎：网络药理学分析及实验验证[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(28): 4516-4521.
[14]	杨敬言, 马涉, 黄仁俊, 杨骁侠, 汤笑尘, 于栋. 右归丸治疗腰椎间盘突出症：网络药理学分析活性成分及潜在治疗靶点[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(27): 4346-4352.
[15]	郑俭彬, 陆玉春, 江自鲜, 李秀芳, 王涛, 王文静. 彝药斯赤列甲醇提取物对骨关节炎模型大鼠的治疗作用及靶点预测[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(23): 3627-3635.