海洋中药治疗骨质疏松的用药规律及作用机制

doi:10.12307/2025.646

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (17): 3713-3723.doi: 10.12307/2025.646

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海洋中药治疗骨质疏松的用药规律及作用机制

赖越1，林轩2，徐淼3，刘欢4，沈剑粦5，黄文华1，6

1广东医科大学第一临床医学院，广东省湛江市 524023；2莆田学院环境与生物工程学院，福建省莆田市 351100；3福建医科大学基础医学院，福建省福州市 350100；4西南医科大学附属中医医院骨科，四川省泸州市 646000；5莆田学院附属医院中心实验室，福建省莆田市 351100；6南方医科大学基础医学院人体解剖学国家重点学科，广东省数字医学与生物力学重点实验室，广东省医学3D打印应用转化工程技术研究中心，广东省广州市 510515

收稿日期:2024-04-11 接受日期:2024-06-15 出版日期:2025-06-18 发布日期:2024-11-07
通讯作者: 沈剑粦，副教授，莆田学院附属医院中心实验室，福建省莆田市 351100 并列通讯作者：黄文华，教授，广东医科大学第一临床医学院，广东省湛江市 524023；南方医科大学基础医学院人体解剖学国家重点学科，广东省数字医学与生物力学重点实验室，广东省医学3D打印应用转化工程技术研究中心，广东省广州市 510515
作者简介:赖越，男，1998年生，福建省龙岩市人，汉族，在读硕士，主要从事骨外科学研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(82301785)，项目负责人：沈剑粦

Medication pattern and mechanism of marine traditional Chinese medicine in the treatment of osteoporosis

Lai Yue1, Lin Xuan2, Xu Miao3, Liu Huan4, Shen Jianlin5, Huang Wenhua1, 6

1The First Clinical Medical School, Guangdong Medical University, Zhanjiang 524023, Guangdong Province, China; 2Department of Environmental and Biological Engineering, Putian University, Putian 351100, Fujian Province, China; 3School of Basic Medicine, Fujian Medical University, Fuzhou 350100, Fujian Province, China; 4Department of Orthopaedics, The Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 5Central Laboratory, the Affiliated Hospital of Putian University, Putian 351100, Fujian Province, China; 6Guangdong Engineering Research Center for Translation of Medical 3D Printing Application, Guangdong Provincial Key Laboratory of Digital Medicine and Biomechanics, National Key Discipline of Human Anatomy, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China

Received:2024-04-11 Accepted:2024-06-15 Online:2025-06-18 Published:2024-11-07
Contact: Shen Jianlin, Associate professor, Central Laboratory, the Affiliated Hospital of Putian University, Putian 351100, Fujian Province, China Co-corresponding author: Huang Wenhua, Professor, The First Clinical Medical School, Guangdong Medical University, Zhanjiang 524023, Guangdong Province, China; Guangdong Engineering Research Center for Translation of Medical 3D Printing Application, Guangdong Provincial Key Laboratory of Digital Medicine and Biomechanics, National Key Discipline of Human Anatomy, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
About author:Lai Yue, Master candidate, The First Clinical Medical School, Guangdong Medical University, Zhanjiang 524002, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 82301785 (to SJL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
分子对接：是通过受体的特征以及受体和药物分子之间的相互作用方式来进行药物设计的方法，主要研究分子间(如配体和受体)相互作用并预测其结合模式和亲合力的一种理论模拟方法。近年来，分子对接方法已成为计算机辅助药物研究领域的一项重要技术。
Rap1/丝裂原活化蛋白激酶信号通路：Rap1/丝裂原活化蛋白激酶通路中的细胞外信号调节激酶(ERK)分支对骨发育和维持至关重要，这一途径的中断可能影响骨代谢进而导致骨质疏松。抑制Rap1可导致破骨细胞活性增加。成骨细胞中Rap1/丝裂原活化蛋白激酶通路被激活以实现成骨细胞的增殖分化。

背景：海洋中药为治疗骨质疏松提供了一种潜在有效且不易产生不良反应的方法。
目的：应用数据挖掘和网络药理学方法分析并探讨中医临床治疗骨质疏松的用药规律及作用机制。
方法：采用数据挖掘和网络药理学方法，对国家知识产权局批准的治疗骨质疏松的海洋中药专利处方进行用药模式和作用机制研究，并特别关注这些处方中的核心中药成分，利用超高效液相色谱串联质谱对牡蛎-续断-淫羊藿组成的复方药组核心成分进行全面的鉴定分析。
结果与结论：①从国家知识产权局(SIPO)网站建立到2024-04-01，检索发现381项骨质疏松治疗的授权专利，共鉴定出48首含有海洋中药的中成药处方，这些处方包含183味中药，其中13种海洋中药用药频次共574次，单首专利组方中用药味数2-41种不等；②牡蛎是最常用的海洋中药，续断、淫羊藿、地黄、杜仲是最常用的非海洋中药；关联规则分析确定了牡蛎、续断和淫羊藿为核心药物群；网络药理学分析显示该核心药组治疗骨质疏松的核心靶点包括ALB、AKT1、TP53、PPARG和SRC；核心药组发挥疗效的核心成分为谷甾醇、甘草素、臭山羊碱、木犀草素、山奈酚；③GO与KEGG富集分析显示，Rap1/丝裂原活化蛋白激酶信号通路在核心药物组的骨质疏松作用机制中起着重要作用；④分子对接结果显示核心成分与核心靶点之间存在良好的相互作用；⑤超高效液相色谱串联质谱检测复方药组核心成分为木犀草素、谷甾醇、山奈酚等，与网络药理学鉴定的药物成分相符合；对复方药组成分进行定量分析得出，黄酮类化合物、萜类化合物以及生物碱这3类物质在药物成分占比中较大。
https://orcid.org/0009-0007-5888-0150(赖越)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨质疏松, 海洋中药, 数据挖掘, 网络药理学, 分子对接

Abstract: BACKGROUND: Marine traditional Chinese medicine offers a potentially effective and less adverse treatment for osteoporosis.
OBJECTIVE: To explore the pharmacological regulations and procedures of traditional Chinese medicine in treating osteoporosis through data mining and network pharmacology techniques.
METHODS: Data mining and network pharmacology methods were used to study the medication pattern and mechanism of marine Chinese medicine patented prescriptions approved by China National Intellectual Property Administration for the treatment of osteoporosis, and special attention was paid to the core Chinese medicine constituents of these prescriptions. The core constituents of the compound drug group composed of oyster-Dipsacus asper-epimedium were comprehensively identified and analyzed by using ultra-high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) We collected 381 authorized compound patents for the treatment of osteoporosis from the database inception to April 1, 2024. Among these, 48 patent groups utilized marine traditional Chinese medicine. These prescriptions contained 183 Chinese herbal medicines, of which 13 marine traditional Chinese medicines were used 574 times in total, and the number of flavors used in a single patented formula ranged from 2 to 41. (2) Oyster was the most frequently used marine ingredient, while Dipsacus asper, epimedium, Rehmannia glutinosa, Eucommia ulmoides Oliv. were the most frequent non-marine components. Association rule analysis identified oyster, Dipsacus asper, and epimedium as the core drug group. Network pharmacology analysis revealed that the core targets of this group for the treatment of osteoporosis included ALB, AKT1, TP53, PPARG, and SRC. Sitosterol, liquiritigenin, japonine, luteolin, and kaempferol were identified as the core components within the marine traditional Chinese medicine prescriptions. (3) The GO and KEGFG enrichment analyses suggested a potential association between the mechanism of the core drug group and the rap1/mapk signaling pathway in the treatment of osteoporosis. (4) The molecular docking verified the beneficial interactions between core components and core targets. (5) The ultra-high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry analysis of the compound medicine confirmed the presence of luteolin, sitosterol, kaempferol, and other components, aligning with the drug components identified by network pharmacology. Quantitative analysis indicated that flavonoids, terpenes, and alkaloids constituted a significant proportion of the compound medicine’s components.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: osteoporosis, marine traditional Chinese medicine, data mining, network pharmacology, molecular docking

中图分类号:

赖越, 林轩, 徐淼, 刘欢, 沈剑粦, 黄文华. 海洋中药治疗骨质疏松的用药规律及作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(17): 3713-3723.

Lai Yue, Lin Xuan, Xu Miao, Liu Huan, Shen Jianlin, Huang Wenhua. Medication pattern and mechanism of marine traditional Chinese medicine in the treatment of osteoporosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(17): 3713-3723.

图/表（结果） 14

2.1 数据挖掘结果
2.1.1 中药频数统计文献检索发现381项骨质疏松症治疗的授权专利，筛选出48首含海洋中药的中成药处方，这些处方包含183味中药，其中13种海洋中药用药频次共574次；单首专利组方中用药味数为2-41种不等。统计单味药在48首处方中出现次数大于10次的中药，见表4。

2.1.2 聚类分析采用SPSS Statistics 27.0软件对频数≥10次的常用药物进行聚类分析。以Pearson相关性作为距离测度的组间聚类分析用于识别高频药物之间的关联，生成的树形图(图1)。当组间距离为21时，可将药物分为3类：类别A，熟地黄、山药、何首乌、黄芪、杜仲、枸杞子、骨碎补；类别B，当归；类别C，淫羊藿、续断、牡蛎。
2.1.3 中药的关联规则分析将专利组方数据导入SPSS Modeler 18.0，创建用于关联规则挖掘的数据流。通过将数据源(Excel表格)与Apriori算法集相结合，最低支持度为10%，最低的置信度为80%，见表5。根据数据

挖掘结果，选择置信度最高的牡蛎、续断和淫羊藿进行网络药理学分析。该软件的可视化工具被用来生成一个描述这些高频中药之间关联的网络，线条的粗细表示关联频率(图2)。
2.2 网络药理学分析结果
2.2.1 核心药组的药物作用靶点获取及疾病靶点筛选在所选的3种中药中共鉴定出35种(淫羊藿22种、续断8种和牡蛎5种)独特的药物成分，见表6。去除重复序列后，这些药物共537个药物靶点。
从GeneCards、OMIM、TTD、Pharmgkb数据库中查询“osteoporosis”，以确定骨质疏松的靶点，检索得5 741，45，29，3个骨质疏松的潜在靶点。为了确定相关性高的靶点，通过选择相关性得分超过中位数2倍的GeneCards数据库结果，排除相关性低的疾病靶点，共产生1 650个潜在靶点。通过Cytoscape软件(3.10.1版)可以创建出一个完整的药物成分靶点网络图，如图3所示。
2.2.2 药物-疾病共同靶点获取及蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建结果通过建立蛋白质-蛋白质相互作用网络系统，能够更好地理解药品与其他疾病的作用。为了实现这一目标，需要在Venn图(图4)中引用0.4的中等置信阈值，使用Cytoscape(版本3.10.1)对蛋白质-蛋白质相互作用网络实现可视化，如图5所示。拓扑分析显示ALB为最高值，提示其有可能成为研究药物治疗干预的关键靶点，AKT1、TP53和其他靶点也具有潜在的重要性。
2.2.3 核心靶点获取为了探究核心组方对骨质疏松的治疗作用机制，将127个交集靶点导入Cytoscape 3.10.1，运用插件Centiscape 2.2分析网络的拓扑参数，构建蛋白质-蛋白质相互作用网络。该网络包括127个节点和1 207条边，度中心性、紧密中心性和中介中心性分别为 19.008，0.004和 131.575。以度中心性≥2 倍作为筛选标准，经筛选后得到关键核心靶点10个(图6)及10个核心靶点信息(表7)。基于拓扑分析确定了核心蛋白质-蛋白质相互作用网络。在蛋白质-蛋白质相互作用网络中，节点大小、颜色与目标度数呈正比。
2.2.4 核心成分获取使用Cytoscape软件(3.10.1版)构建药物成分靶网络(图7)。利用Cytoscape插件CytoNCA研究网络拓扑参数，包括度中心性、紧密中心性、特征向量中心性和中介中心性。参数值超过平均值的组件被视为核心成分。
表8列出了前10个核心组成部分，谷甾醇作为具有最高拓扑值，表明其是高频药组发挥疗效的主要成分；甘草素、臭山羊碱、木犀草素、山奈酚也被鉴定为潜在的重要成分。
2.2.5 GO 与 KEGG 富集分析结果为阐明核心药组治疗骨质疏松症的作用机制，对127个已鉴定的靶基因进行了GO富集分析。结果表明，在1 407个生物过程、76个细胞成分和136个分子功能中均有富集。根据P值显著性选择每个类别(生物过程、细胞成分和分子功能)中前20个富集项，并在气泡图中显示(图8A)。为了清晰起见，以柱状图(图8B)突出呈现每个类别中P值最低的一个项目共30

个。GO富集分析结果表明，核心药物群主要影响与激素反应、细胞对脂质和肽的反应相关的生物过程，并涉及膜筏、受体复合物和膜微区等细胞成分；此外，核受体和配体激活转录因子，而分子功能与转录因子的活性相关联。
对127个交集靶点进行KEGG通路富集分析。结果显示，177条通路的靶标具有较高的富集程度，其中前20条通路的P值最高(图9A)，绘制了基于KEGG富集分析的前20条通路的KEGG类型(图9B)。KEGG通路富集分析结果表明，丝裂原活化蛋白激酶、Rap1、环磷酸腺苷和松弛素信号通路可能与核心药物组对骨质疏松症的治疗作用有关。
2.3 分子对接结果选取靶点 ALB (PBDID：7VR0)、AKT1(PBDID：7NH5)、TP53(PBDID：6SL6)、PPARG (PBDID：8FKC)、SRC(PBDID：1FMK)与核心成分谷甾醇、甘草素、臭山羊碱、木犀草素、山奈酚进行分子对接。核心成分与其靶蛋白之间的对接分数(结合能)范围为-22.8至-46.3 kJ/mol(图10)。较低的结合能表明更强的相互作用，例如谷甾醇与ALB的对接能为-39.9 kJ/mol(图11)，表明其与靶蛋白结合良好(使用PyMOL进行可视化)。
2.4 超高效液相色谱串联质谱定性定量分析结果使用Analyst 1.6.3软件处理质谱数据。图12描述了复合药物组的总离子电流色谱图以及MRM代谢物检测多峰图(也称为提取离子色谱图)。X轴表示代谢物检测的保留时间，Y轴表示检测到的离子电流强度。以下部分介绍了从该分析中获得的结果。
利用本地代谢数据库，使用质谱进行代谢产物定性和定量分析。图13显示了多反应监测代谢物检测多峰色谱图，展现了样品中的可检测物质，每个色谱峰以颜色区分，对应于一个不同的检测代谢物。使用三重四极杆质谱仪分离每个代谢物的特征离子，并通过检测器记录其信号强度(每秒计数，CPS)。数据采集后，使用Multi Quant软件处理原始质谱文件，以整合和校正色谱峰。每个峰的峰面积代表相应代谢物的相对丰度。最后，将

所有综合峰面积数据导出并保存以供进一步分析。
为了确保实验结果的可靠性，对所有样本中检测出的代谢产物都进行了色谱峰校正，该过程同时考虑了代谢物保留时间和峰特性。实验共检测出代谢物1 987类，其中所检测到的部分代谢物的分子式、电离模式以及对应代谢物名称等信息，见表9。
代谢物组成对于每个样品都具特异性，不同的样品类型在代谢物的特性和丰度方面具有不同的特征。图14为复方药组中各代谢物组成比例示意图。

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引言

骨质疏松是骨科退行性疾病中的一种，病理特征是骨密度降低和骨微结构的破坏，这些变化导致骨骼脆性增加，从而增加骨折风险[1]。骨质疏松在女性中的发病率远大于男性[2]。与其他年龄组相比，老年人表现出更高的骨质疏松发病率，骨质疏松性骨折是致残和死亡的主要原因[3]。目前，原发性骨质疏松的治疗方式有多种，包括骨吸收抑制剂、骨形成促进剂、双作用药物等[4-6]，这些方法虽然能够有效改善骨质疏松症症状，但也存在不良反应大以及治疗花费高等缺点。因此，有必要开发一种新型的、安全有效的治疗方法[7-8]。
中国传统医学有着丰富而广泛的历史，其核心原理已被记载了2 000多年，其中，海洋的巨大资源也在这一整体治疗系统中发挥了重要作用。中国海洋资源丰富，在海洋中药领域的研究开发价值较大[9]。中国利用海洋中药治病具有悠久的历史，从古代的《神农本草经》到近现代的《中华本草》都收录有功效明确的海洋中药。在临床实践中，牡蛎、玳瑁、昆布和瓦楞子等海洋药物被广泛使用[10]。目前，中国利用海洋生物开发了约22种单味处方药和152种复方中药制剂。将海洋衍生药物与现代医学理论和技术相结合，显著提高了海洋衍生药物的临床效果[11]。现如今，淫羊藿、巴戟天、牛膝、杜仲、牡蛎等单味中药治疗骨质疏松的使用频率最高。然而，含有海洋中药的复合方剂治疗骨质疏松的研究相对较少。
此次研究搜集了有关使用海洋中药来治疗骨质疏松的专利信息，使用了数据挖掘技术对这些信息进行了深入分析和比较，利用超高效液相色谱串联质谱进行定性定量分析，以期揭示海洋中药治疗骨质疏松的独到之处和有效组合。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1 资料和方法 Data and methods
1.1 资料
1.1.1 生物信息数据库网络药理学分析所应用的数据库，见表1。
1.1.2 主要试剂与仪器见表2，3。
1.2 方法
1.2.1 数据来源数据检索自国家知识产权局(SIPO)网站，检索词为“骨质疏松症与中医药”和“骨质疏松症与海洋中医药”，检索日期为数据库建立至2024-04-01。在初始搜索之后删除重复条目，合并并筛选结果以获得最终数据集。
1.2.2 纳入标准 ①治疗骨质疏松症的中药复方制剂，包括含有中药提取物的制剂；②发明专利在标题中未明确提及骨质疏松治疗，但在详细描述中具有骨质疏松治疗的适应证；③授权的专利；④在中药配方中使用海洋衍生成分的专利。
1.2.3 排除标准 ①外用制剂(例如外敷、膏药、熏蒸配方)、药酒、茶替代品、食品和保健品；②配方中含有西药成分的专利；③单一中药专利；④重复用药的专利；⑤专利是公开、驳回、撤回等其他法律状态下的。
1.2.4 建立数据库与数据标准化
建立数据库：将检索到的数据导入Excel 2016，建立海洋中药制剂治疗骨质疏松症的专利数据库。为了确保数据的准确性，2名研究人员独立录入并复查，修改差异的数据。
数据标准化：药物命名遵循《中华人民共和国药典》2020版本。对于未纳入2020年《中华人民共和国药典》的药物，则参考《中华本草》。例如“川段”(规范为续断)“仙灵脾”(淫羊藿)和“元胡”(延胡索)。
1.2.5 数据分析使用 Excel 2016 中的数据透视表进行药物频率分析，然后

使用SPSS Statistics软件对频数≥10的药物进行聚类，在SPSS Modeler 18.0中采用Apriori关联规则算法对药物共现模式进行建模和分析。
1.2.6 网络药理学分析
核心药组的活性成分筛选及靶点信息预测：研究通过使用多数据库的方法去确定续断、淫羊藿和牡蛎中生物活性成分的潜在药物靶点。首先，为了得出川续断和淫羊藿的主要成分，以口服生物利用度≥30%和药物相似性≥0.18为选取指标，在中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)中进行筛选。随后，在BATMAN-TCM数据库中对牡蛎的主要成分进行了筛选。在这里，采用≥20的分数界限和< 0.5的P值。接下来，从PubChem数据库检索已识别药物成分的SMILES号并导入SwissTargetPrediction平台。
Probability≥0.1的药物靶点进行进一步分析。对于在PubChem中未找到的药物成分，利用PharmMapper服务器，采用标准拟合度≥0.9作为筛选标准来识别潜在靶点。最后，从UniProt数据库中检索到经过验证的人类靶基因名称。然后将所有信息汇编成Excel 2016电子表格，使用Cytoscape软件(版本3.10.1)构建描述药物成分-靶相互作用的网络图。
骨质疏松相关靶点筛选：为了确定骨质疏松症的潜在药物靶点，使用了GeneCards、OMIM、TTD及PharmGKB 4个数据库。在每个数据库中使用搜索词“osteoporosis”来检索相关疾病目标靶点。随后，将检索到的结果进行合并并消除重复部分，最后将结果录入Excel 2016表格。
蛋白质相互作用网络的构建与核心靶点获取：运用微生信网站生成Venn图以识别骨质疏松症和核心治疗药物之间的重叠靶标。将靶标信息存储在STRING数据库中，得到蛋白质-蛋白质相互作用网络。在该网络中，关注置信度中等(> 0.4)的人类蛋白质。应用带有Centriscape 2.2插件的Cytoscape软件(版本3.10.1)用于计算拓扑参数，筛选与骨质疏松症治疗相关的关键核心目标。
核心成分获取：采用Cytoscape软件(3.10.1版)进行网络分析。通过将药物和疾病产生的交集靶点，将靶点导入药物-成分-靶点网络图，有效地构建出一个全面的成分-靶点网络。同时，通过CytoNCA获取其核心成分。
GO富集分析与KEGG富集分析：在Metascape数据库，进行Gene Ontology (GO)和 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)富集分析。最小重叠为3，P值截止值为0.01，最小富集度为1.5。利用微生信网站绘制GO富集分析和KEGG富集分析结果。
1.2.7 分子对接从PubChem数据库检索配体信息，使用Open Babel (版本2.4.1)将其转换为mol2格式。
AutoDockTools(版本1.5.7)用于配体制备，包括氢化、电荷分配和设置扭转键。受体信息来自蛋白质数据库(PDB)。随后，利用PyMOL软件去除受体结构中的水和任何结合配体。然后使用AutoDockTools通过添加氢来制备受体。以pdbqt格式保存上述文件。通过使用AutodockTools中的AutoGrid4和AutoDock4，可以实现受体与配体的有效对接，从而确定药物与靶标之间的结合稳定性。当结合能低于0 kJ/mol时，表明双方之间的相互作用是自发的；当结合能低于-20.9 kJ/mol时，表明双方之间已经可以组装，因此，在完成对接之后应该根据实际情况选择最小的结合能，以确保药物与靶标之间的有效结合。通过使用PyMOL将结果可视化。
1.2.8 超高效液相色谱串联质谱分析利用超高效液相色谱串联质谱对牡蛎-续断-淫羊藿组成的复方药组(广东医科大学第一临床医学院提供)核心成分进行全面的鉴定分析。
干样提取：使用Scientz-100 F冷冻干燥机能够在真空条件下保持生物样品63 h的干燥。使用研磨仪(MM 400，Retsch)，在30 Hz的频率下将所得粉末进行均匀化处理，持续1.5 min。随后，使用电子天平精确称量50 mg样品粉末，用1 200 μL预冷(20 ℃)体积分数70%甲醇溶液(含内标物，小于50 mg/mL)萃取。将1 mg标准溶液溶解于1 mL体积分数70%甲醇中制备内标溶液，得到1 000 μg/mL储备溶液。然后用体积分数70%甲醇稀释储备溶液，以制备最终质量浓度为250 μg/mL的工作溶液。每30 min旋转样品-溶剂混合物30 s，共6个循环。12 000 r/min离心3 min后，收集上清液并通过0.22 μm微孔膜过滤，然后将最终滤液储存在进样瓶中，以进行后续超高效液相色谱串联质谱分析。
色谱质谱采集条件：数据采集系统由超高效液相色谱仪器(ExionLC™ AD，Sciex；https://sciex.com.cn/)与串联质谱仪结合。①液相色谱条件：色谱柱为Agilent SB-C18(1.8 µm，2.1 mm×100 mm)；流动相：A为超纯水+0.1%甲酸，B为乙腈+0.1%甲酸；洗脱梯度：初始值为5% B(0.00 min)，线性增加至95% B(0-9.00 min)，保持在95% B(9.00-10.00 min)，降至5% B (10.00-11.10 min)，保持在5% B(11.10-14.00 min)；流速0.35 mL/min；柱温40 ℃；进样量2 μL。②质谱条件：ESI源温度为500 ℃；离子输出电压(IS)：5 500 V(输出模式)-4 500 V (负离子模式)；离子源气体压力设置：电压Ⅰ(GSⅠ)为344.8 kPa，气体Ⅱ(GSⅡ)为413.7 kPa，帘气为172.4 kPa；碰撞诱导电离参数设置为高；QQQ扫描模式：多反应监测；碰撞材料为氮气。
代谢物定性定量分析：代谢物定性分析基于自建数据库Metware database。在分析过程中，排除了同位素信号及含K+、Na+和NH+的重复离子以及来自高分子量物质的碎片离子。通过利用三重四极杆质谱仪技术，可以有效地实现对代谢物的准确定量。在多反应监测模式下，第一个四极(Q1)选择性地传输对应于目标代谢物的前体离子(母体离子)，有效地消除了不同分子质量离子的干扰。接着，前驱体离子在碰撞室中受到激发，经过诱导碰撞解离反应最终形成碎片状的离子。第二个和第三个四极(Q2和Q3)作为过滤器，选择一个特定的、特征性的碎片离子进行检测。这种多级选择过程将非目标离子的干扰降至最低，提高了定量的准确性和再现性。对不同样品中的代谢物进行质谱分析后，对所有色谱峰的峰面积进行整合，对不同样品中具有相应峰的代谢物进行校正。
1.3 主要观察指标含海洋中药的复方药组在骨质疏松治疗中的应用潜力。

讨论

骨质疏松是一种与年龄紧密相关的代谢性疾病，在中医学中将骨质疏松归属于“骨痿”“骨痹”的范畴[12]。在现代医学中，骨髓间充质干细胞诱导成骨分化成为骨质疏松治疗的基础理论。在中医学中，将骨髓间充质干细胞归属于“肾精”的范畴，因此在中药治疗骨质疏松多以补肾壮骨类药物为主[13]。中医药在治疗骨质疏松症方面具有优势，包括疗效好、不良反应小等。海洋中药是一种特殊类型的中药，具有抗骨质疏松症的特性，还有其他益处，如减少炎症、延缓衰老和改善微循环[14]。
对授权专利的数据挖掘显示，牡蛎是骨质疏松症治疗配方中使用的主要海洋中药。牡蛎的钙储量极为可观，其中碳酸钙、磷酸钙、硫酸钙、镁、铝、硅、氧化铁的比例介于80%-95%之间。值得注意的是，牡蛎的煅烧会导致碳酸钙分解，产生氧化钙，氧化钙已被用于解决孕妇和儿童的缺钙问题。然而，这种方法在骨质疏松症治疗中的有效性仍有待确定。在非海洋中药中，淫羊藿、熟地黄、续断具有补肾壮阳的功效，用于缓解四肢不仁、腰膝酸软、胫股酸痛等症状。
高频药物聚类分析结果显示，类别A中山药、熟地黄可补血滋阴，何首乌、黄芪可托毒排脓，枸杞子、杜仲具有补肝肾，骨碎补可补肾强骨，该组药主要是补肾健脾益气的作用；类别B中当归可补血活血、调经止痛、润肠通便；类别C中淫羊藿、续断可补肾阳、强筋骨、祛风湿，牡蛎可平肝潜阳、软坚散结，该组药主要是补肾壮阳的功效。关联规则分析结果表明牡蛎-续断-淫羊藿药组关联性最高。淫羊藿与续断相结合既能补肾阳又能起到强筋骨的功效，再加以海洋中药牡蛎平肝潜阳、软坚散结功效，使得该组药物能补肾壮阳。因肾主骨，所以骨质疏松需要补肾，骨与筋相连，筋强便可以壮骨。骨松宝配方含有牡蛎和淫羊藿，在骨质疏松症的临床实践中得到了广泛应用。研究表明，骨松宝在抑制骨转换、增强骨重塑、增加骨密度和在雌性去势大鼠中实现抗骨质疏松作用方面具有疗效，然而需要进一步的临床验证[15]。
运用网络药理学对核心药组进一步分析，结果显示谷甾醇、甘草素、臭山羊碱、木犀草素、山奈酚度值最高。谷甾醇具有降低胆固醇的特性。体内实验表明，β-谷甾醇能够上调β-catenin信号通路，从而增强成骨分化并促进骨形成[16]。甘草素不仅能够抑制炎症反应，还能够保护肝脏功能，并且能够调整机体的免疫系统，显著降低骨质疏松大鼠在接受内分泌治疗之后出现的雌激素水平降低情况，促进骨细胞增殖分化，从而改善骨组织形态[17]。臭山羊碱具疏风清热、行气活血功效。木犀草素具有消炎、抗过敏、抗病毒等功效，可以改善大鼠绝经后骨质疏松症状，可能与调节磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路有关[18]。山奈酚具有抗菌、抗炎、止咳和祛痰的特性，值得注意的是，山奈酚具有调节骨髓间充质干细胞、成骨细胞和破骨细胞中多种信号通路的潜力[19]，这种调节可能会影响细胞分化、增殖和凋亡，最终有助于预防和治疗骨质疏松症。
此次研究确定了537个潜在的药物靶点。基于网络的拓扑分析，ALB、AKT1、TP53、PPARG和SRC成为核心靶点，可能与骨质疏松症核心药组的治疗效果有关。研究表明，骨质疏松患者和骨质疏松小鼠模型中TP53基因表达显著增加，血清TP53水平也随之提高，骨量减少；如果敲低TP53这种情况就会得到一定程度的缓解[20]。SRC是最早被鉴定的原癌基因之一，也是非受体型酪氨酸激酶的原型。SRC在骨代谢中的作用首先在SRC缺乏的小鼠中被发现，使用低分子量SRC抑制剂可治疗动物骨质疏松[21]。研究结果显示，AKT1对保护骨骼结构至关重要[22]；当AKT1基因敲除时会导致成骨及破碎的细胞发生功能紊乱，从而导致小鼠体质量显著下降[23]。AKT1参与了破骨细胞的分化和存活，是核因子κB受体活化因子配基/核因子κB轴的一部分[24-25]；AKT1还参与了依赖转化生长因子β1的成骨细胞分化早期阶段[26-27]。研究表明，PPARG基因过表达抑制FTO介导的间充质干细胞成骨分化，而PPARG基因敲除促进FTO诱导的间充质干细胞成骨分化[28]。低ALB水平可能是糖尿病和健康男性骨质疏松症的一个标志物[29]。
GO功能富集分析结果显示，高频药组可能于受体复合物、膜筏、膜微区等部位发挥治疗骨质疏松的作用。膜微区是细胞质膜的动态区域，对信号转导、转运过程和病原体防御至关重要[30]。膜筏是真核细胞膜内不同的实体，参与各种细胞活动，如生物合成、内吞和信号传递[31]。此次研究GO富集分析显示，核心药组主要针对与激素反应相关的生物过程、细胞对脂质和肽的反应、核受体和配体激活的转录因子活性相关的分子功能。
此次研究发现，Rap1/丝裂原活化蛋白激酶信号通路可能是牡蛎-续断-淫羊藿药组治疗骨质疏松的重要通路。Rap1/丝裂原活化蛋白激酶信号通路可调节细胞增殖、分化和凋亡[32]。
研究表明，下调miR-182-5p可通过上调adcy6和激活Rap1/丝裂原活化蛋白激酶通路促进骨质疏松大鼠成骨细胞增殖和分化[33]。值得注意的是，AKT1、TP53和SRC位于Rap1/丝裂原活化蛋白激酶通路中，这表明它们可能是核心药组抑制该通路的关键介质。
超高效液相色谱串联质谱分析用于验证复方药物制剂中预测的有效成分的存在，该方法对目标化合物具有良好的敏感性和特异性。此次实验共鉴定出1 987个成分，包括木犀草素、β-谷甾醇、槲皮素、山柰酚等有效成分，这些成分与网络药理学的预测一致。定量分析显示复方药物中黄酮类化合物是最丰富的成分，其次是萜类化合物，这些发现有力地支持了基于网络药理学成分预测的准确性，为进一步的机制研究提供了坚实基础。但是尽管网络药理学具有强大的预测能力，超高效液相色谱串联质谱分析未能检测出网络药理分析中的臭山羊碱、淫羊藿E、三溴乙酸乙酯等复合药物有效成分，这种差异可能归因于多种因素，包括基质效应、低分析物浓度或化合物不稳定性。草药基质的复杂性和潜在的离子抑制对基于质谱方法的灵敏度是一个潜在挑战。为了解决这些局限性，未来的研究应探索替代分析技术，如液相核磁共振连用技术或液相高分辨高精密度质谱，以全面表征复合药物并识别潜在的生物标记物。
此次研究采用数据挖掘和网络药理学方法探讨海洋中药对骨质疏松症的治疗潜力，从理论层面探讨了含有海洋中药组方的治疗原则和核心药组作用机制，研究结果支持牡蛎-续断-淫羊藿组合治疗骨质疏松症的潜力，强调以牡蛎为基础的海洋中药成分在这方面的前景。继续探索海洋中药的有效成分，有可能进一步突破其治疗骨质疏松症的药理机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

海洋中药治疗骨质疏松的用药规律及作用机制

Medication pattern and mechanism of marine traditional Chinese medicine in the treatment of osteoporosis

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