白藜芦醇洗脱支架的理化特性和体外生物学效应

doi:10.12307/2026.158

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
超声雾化：是利用超声波能量将液体分散成微米级液滴形成雾化的技术。超声雾化的工作原理是通过高频振动使液体表面产生破裂，进而形成均匀的液滴。
洗脱支架：是一种释放药物的植入式医疗装置，由金属支架和药物涂层组成，金属支架用于支撑血管，防止再次狭窄；药物涂层缓慢释放抗增殖药物或抗炎药物，有效抑制血管内膜的过度增生，从而减少再狭窄的发生概率。洗脱支架主要用于治疗冠状动脉狭窄等心血管疾病。

背景：传统药物洗脱支架虽然已成为冠状动脉粥样硬化性心脏病介入治疗的主流选择，但仍存内皮修复延迟、晚期血栓风险及慢性炎症反应等问题，因此，开发具有选择性细胞调控功能和可降解载体的新型药物洗脱支架已成为当前研究的迫切需求。
目的：制备负载白藜芦醇洗脱涂层的316L不锈钢支架，系统研究该涂层的理化性能、生物相容性以及对动脉粥样硬化病灶的治疗效果。
方法：①配置白藜芦醇与聚乳酸-羟基乙酸共聚物质量比分别为0%，10%，20%，30%，40%的溶液，采用蒸发沉积法在316L不锈钢片材表面制备质量分数0%，10%，20%，30%，40%白藜芦醇洗脱涂层，表征5组涂层的水接触角、血液相容性、抗氧化特性以及对人脐静脉内皮细胞、人主动脉平滑肌细胞与巨噬细胞生长行为的影响，表征质量分数30%白藜芦醇洗脱涂层的药物释放动力学与机械性能；将巨噬细胞分别接种于316L不锈钢片材、负载聚乳酸-羟基乙酸共聚物涂层316L不锈钢片材与负载质量分数30%白藜芦醇洗脱涂层316L不锈钢片材表面，加入脂多糖刺激因子建立动脉粥样硬化模型，免疫荧光染色检测CD206(抗炎型巨噬细胞)、CD86(促炎型巨噬细胞)表达。②配置白藜芦醇与聚乳酸-羟基乙酸共聚物质量比分别为0%，30%的溶液作为喷涂液，采用超声雾化喷涂法在316L不锈钢支架表面制备质量分数0%，30%白藜芦醇洗脱涂层，通过球囊扩张实验评估涂层的机械性能。
结果与结论：①负载涂层316L不锈钢片材表面的水接触角均大于316L不锈钢片材，并且随着涂层中白藜芦醇质量分数的增加，不锈钢片材表面的水接触角呈降低趋势。316L不锈钢片材与负载涂层316L不锈钢片材均具有较低的溶血率(溶血率< 5%)；体外血小板黏附与激活实验显示白藜芦醇洗脱涂层有效抑制了血小板的附着与活化，其中质量分数30%，40%白藜芦醇洗脱涂层的作用更显著。白藜芦醇洗脱涂层可抑制巨噬细胞的活性氧释放，发挥抗氧化特性。白藜芦醇洗脱涂层可促进人脐静脉内皮细胞的增殖、抑制人主动脉平滑肌细胞与巨噬细胞的增殖，其中质量分数30%，40%白藜芦醇洗脱涂层的作用更显著。因此，后续实验选择质量分数30%白藜芦醇洗脱涂层。白藜芦醇洗脱涂层能够实现至少30 d的稳定可控药物释放。免疫荧光染色显示白藜芦醇洗脱涂层能够促进巨噬细胞向抗炎表型转化。②经球囊扩张后，不锈钢支架表面的白藜芦醇洗脱涂层未出现剥落、裂缝扩展等问题，具有良好的机械性能。
https://orcid.org/0009-0007-9037-8291 (李可韵)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 白藜芦醇, 洗脱支架, 超声雾化喷涂, 动脉粥样硬化, 生物相容性, 血液相容性, 抗血栓, 药物释放

Abstract: BACKGROUND: Although conventional drug-eluting stents have become the mainstream choice for interventional treatment of coronary atherosclerotic heart disease, they still suffer from delayed endothelial repair, the risk of late thrombosis, and chronic inflammatory responses. Therefore, the development of novel drug-eluting stents with selective cell-modulating properties and biodegradable carriers has become an urgent research need.
OBJECTIVE: To prepare a 316L stainless steel stent loaded with a resveratrol-eluting coating and systematically investigate the coating's physicochemical properties, biocompatibility, and therapeutic efficacy against atherosclerotic lesions.
METHODS: (1) Resveratrol and poly(lactic-co-glycolic acid) solutions with a mass ratio of 0%, 10%, 20%, 30%, and 40% were prepared on 316L stainless steel sheets by evaporation deposition. Resveratrol elution coatings with mass fractions of 0%, 10%, 20%, 30%, and 40% were prepared. The water contact angle, blood compatibility, antioxidant properties, and effects on the growth behavior of human umbilical vein endothelial cells, human aortic smooth muscle cells, and macrophages of the five coatings were characterized. The drug release kinetics and mechanical properties of the 30% resveratrol elution coating were also characterized. Macrophages were seeded on the surfaces of 316L stainless steel sheets, 316L stainless steel sheets loaded with poly(lactic-co-glycolic acid) coating, and 316L stainless steel sheets loaded with 30% resveratrol elution coating, respectively. Lipopolysaccharide-stimulating factor was added to establish an atherosclerosis model. Immunofluorescence staining was used to detect the expression of CD206 (anti-inflammatory macrophages) and CD86 (pro-inflammatory macrophages). (2) Solutions of resveratrol and poly(lactic-co-glycolic acid) copolymer at 0% and 30% mass ratios, respectively, were prepared as spray solutions. Ultrasonic atomization spraying was used to prepare 0% and 30% resveratrol-eluted coatings on 316L stainless steel stents. The mechanical properties of the coatings were evaluated by balloon expansion experiments.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The water contact angles of the coated 316L stainless steel sheets were greater than those of the original 316L stainless steel sheets. The water contact angles of the stainless-steel sheets decreased with increasing resveratrol mass fraction in the coatings. Both the 316L stainless steel sheets and the coated 316L stainless steel sheets exhibited low hemolysis rates (< 5%). In vitro platelet adhesion and activation experiments demonstrated that the resveratrol-eluted coatings effectively inhibited platelet adhesion and activation, with the 30% and 40% resveratrol-eluted coatings exhibiting more significant effects. The resveratrol-eluted coatings inhibited the release of reactive oxygen species from macrophages, exerting antioxidant properties. Resveratrol-eluting coatings promoted the proliferation of human umbilical vein endothelial cells and inhibited the proliferation of human aortic smooth muscle cells and macrophages. The effects were more pronounced with 30% and 40% resveratrol-eluting coatings. Therefore, the 30% resveratrol-eluting coating was selected for subsequent experiments. The resveratrol-eluting coating achieved stable, controlled drug release for at least 30 days. Immunofluorescence staining demonstrated that the resveratrol-eluting coating promoted the transformation of macrophages to an anti-inflammatory phenotype. (2) After balloon expansion, the resveratrol-eluting coating on the stainless-steel stent exhibited no delamination or crack propagation, demonstrating excellent mechanical properties.

Key words: resveratrol, eluting stent, ultrasonic atomization spray, atherosclerosis, biocompatibility, hemocompatibility, antithrombosis, drug release

中图分类号:

李可韵, 杨玉琪, 费莹莹, 黄帅. 白藜芦醇洗脱支架的理化特性和体外生物学效应[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(20): 5243-5256.

Li Keyun, Yang Yuqi, Fei Yingying, Huang Shuai. Physicochemical properties and in vitro biological effects of resveratrol-eluting stents[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(20): 5243-5256.

图/表（结果） 10

2.1 白藜芦醇洗脱涂层的材料学表征结果通过傅里叶变换红外光谱对涂层的化学结构进行分析，结果如图2A所示。聚乳酸-羟基乙酸共聚物的红外谱图显示在3 464 cm-1处出现了明显的氧氢峰，在1 750 cm-1处观察到聚乳酸-羟基乙酸共聚物酯键中羰基的伸缩振动特征峰，同时在1 190 cm-1和1 090 cm-1处出现了C-O-C的伸缩振动。白藜芦醇的红外光谱图显示在3 200-3 400 cm-1处出现了宽而强的酚羟基峰，归因于白藜芦醇中多个酚羟基基团的贡献，在1 600 cm-1和1 515 cm-1处出现了明显的苯环骨架C=C的伸缩振动。在白藜芦醇@聚乳酸-羟基乙酸共聚物中，分别出现了聚乳酸-羟基乙酸共聚物和白藜芦醇分子的特征吸收峰，并且白藜芦醇中宽而强的O-H吸收带减弱并略微位移，表明白藜芦醇与聚乳酸-羟基乙酸共聚物通过酚羟基和酯基之间的相互作用实现了结合，证实了洗脱涂层的成功构建，同时也表明聚乳酸-羟基乙酸共聚物有效实现了对白藜芦醇分子的物理包载，并保持了白藜芦醇结构的完整性。
对涂层的润湿性进行了水接触角测试，结果展示如图2B。与316L不锈钢片材相比，负载0%白藜芦醇洗脱涂层的316L不锈钢片材水接触角显著增大，达到了(76.53±2.59)°，这种变化归因于聚乳酸-羟基乙酸共聚物中富含疏水性基团，使得材料表面对水的润湿性降低，接触角增大。而对于负载白藜芦醇洗脱涂层的316L不锈钢片，随着白藜芦醇装载量的增加，材料表面的水接触角逐步减小，这种现象可能是由于白藜芦醇分子中含有多个羟基(-OH)，这些羟基能够与水分子形成氢键，从而增强了材料表面的亲水性，进一步证明了白藜芦醇@聚乳酸-羟基乙酸共聚物涂层成功制备并具有明确的特性。

2.2 白藜芦醇洗脱涂层的体外血液相容性评价结果溶血率直接反映材料对红细胞的破坏性，是判断材料是否适合与血液长期接触的重要指标。各组样品的溶血实验结果如图3所示。316L不锈钢片材与负载质量分数0%，10%，20%，30%，40%白藜芦醇洗脱涂层316L不锈钢片材的溶血率低于国际标准(溶血率< 5%)，表明白藜芦醇洗脱涂层材料具有良好的血液相容性。其中，白藜芦醇与聚乳酸-羟基乙酸共聚物基质的结合可能进一步降低了材料表面对红细胞的破坏性，使红细胞在接触涂层表面时保持完整性，减少了膜损伤和溶血的发生。
支架植入体内过程中直接与血液接触，这种界面相互作用对血栓形成和支架功能的长期效果具有决定性影响。血小板黏附和活化程度是评价血管植入物血液相容性的重要指标[43]，因此，此次研究通过体外血小板黏附与激活实验评估涂层材料的性能。有研究表明，白藜芦醇能够显著抑制血小板黏附和激活[44-45]。各组样品表面的血小板黏附与激活实验结果如图4显示。扫描电子显微镜观察结果显示，相较于无涂层316L不锈钢片材，负载涂层的316L不锈钢片材表面血小板黏附数量减少，同时保持了血小板的完整形态，未观察到明显的伪足延伸或形态改变，并且随着涂层中白藜芦醇质量分数的增加，血小板黏附数量减少。相较于无涂层316L不锈钢片材组，负载质量分数0%，10%，20%，30%，40%白藜芦醇洗脱涂层316L不锈钢片材组乳酸脱氢酶水平降低，负载质量分数20%，30%，40%白藜芦醇洗脱涂层316L不锈钢片材组P-选择素水平降低，负载质量分数30%，40%白藜芦醇洗脱涂层316L不锈钢片材组乳酸脱氢酶与P-选择素水平均低于负载质量分数0%白藜芦醇洗脱涂层316L不锈钢片材组，差异均有显著性意义，表明白藜芦醇洗脱涂层有效抑制了血小板的黏附与活化。

2.3 白藜芦醇洗脱涂层对巨噬细胞活性氧释放的影响检测结果氧化应激条件下各组样品表面活性氧荧光染色与定量分析结果，如图5所示。倒置荧光显微镜下可见各组样品表面的RAW264.7细胞活性氧荧光强度存在明显差异，负载质量分数0%白藜芦醇洗脱涂层组活性氧荧光强度最高，表明活性氧释放水平较高，可能由于样品表面特性或刺激物(脂多糖)诱导了较强的氧化应激反应；负载质量分数30%白藜芦醇洗脱涂层组活性氧荧光强度最低，表明活性氧释放水平较低，可能由于样品表面具有抗氧化或抗炎特性，抑制了巨噬细胞的氧化应激反应。

2.4 白藜芦醇洗脱涂层的体外细胞相容性评估结果支架植入后，内皮细胞损伤会导致内膜修复延迟，增加血栓形成的风险。研究表明，白藜芦醇能够激活内皮一氧化氮合酶、提高一氧化氮水平，促进血管舒张和内皮修复[37]；此外，白藜芦醇可抑制氧化应激损伤[31]，从而保护内皮细胞功能，增强增殖能力。图6展示了人脐静脉内皮细胞在各组样品表面的增殖检测结果。罗丹明123染色结果显示，相同培养时间下，随着涂层中白藜芦醇质量分数的增加，人脐静脉内皮细胞数量增加。CCK-8检测结果显示，相同培养时间下，负载质量分数20%，30%，40%白藜芦醇洗脱涂层组人脐静脉内皮细胞增殖多于无涂层组，差异有显著性意义；培养24 h，负载质量分数10%，20%，30%，40%白藜芦醇洗脱涂层组人脐静脉内皮细胞增殖多于负载质量分数0%白藜芦醇洗脱涂层组，差异有显著性意义；培养72 h，负载质量分数20%，30%，40%白藜芦醇洗脱涂层组人脐静脉内皮细胞增殖多于负载质量分数0%白藜芦醇洗脱涂层组，差异有显著性意义。表明白藜芦醇能够显著促进内皮细胞的增殖，进而促进血管再生或修复。
支架植入后，平滑肌细胞的异常增殖是支架内再狭窄的主要原因[46-47]。研究表明，白藜芦醇通过阻滞细胞周期(G1或S期)抑制与增殖相关的信号通路(磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B和丝裂原活化蛋白激酶信号通路)，降低促增殖因子的表达(血小板源性生长因子)[48-49]。图7展示了人主动脉平滑肌细胞在各组样品表面的增殖检测结果。罗丹明123染色结果显示，相同培养时间下，随着涂层中白藜芦醇质量分数的增加，人主动脉平滑肌细胞数量呈减少趋势。CCK-8检测结果显示，培养24 h，负载质量分数20%，30%，40%白藜芦醇洗脱涂层组人主动脉平滑肌细胞增殖少于无涂层组、负载质量分数0%白藜芦醇洗脱涂层组，差异有显著性意义；培养72 h，负载质量分数30%，40%白藜芦醇洗脱涂层组人主动脉平滑肌细胞增殖少于无涂层组、负载质量分数0%白藜芦醇洗脱涂层组差异有显著性意义。以上结果表明，白藜芦醇可抑制平滑肌细胞过度增殖，可能有助于防止支架植入后内膜增生和再狭窄的发生。
从上述荧光图和CCK-8实验结果可以看出，316L不锈钢片材与负载聚乳酸-羟基乙酸共聚物涂层的316L不锈钢片材对内皮细胞和平滑肌细胞增殖的影响较为平稳，未产生显著的促进或抑制作用。负载白藜芦醇洗脱涂层的316L不锈钢片材对内皮细胞增殖有促进作用，对平滑肌细胞增殖有抑制作用，推测这种效果主要来源于聚乳酸-羟基乙酸共聚物涂层中白藜芦醇的缓释，而非聚乳酸-羟基乙酸共聚物本身。结果表明，白藜芦醇作为洗脱涂层中的活性成分，发挥了促进内皮细胞增殖和抑制平滑肌细胞增殖的作用，从而提高了涂层的生物相容性和治疗效果。
巨噬细胞在支架植入后的炎症反应中起关键作用，巨噬细胞过度增殖会导致慢性炎症，影响支架的长期稳定性。研究表明，白藜芦醇通过调控巨噬细胞增殖可显著降低炎症水平，改善支架植入后的组织修复环境[50]。图8展示了RAW264.7细胞在各组样品表面的增殖检测结果。罗丹明123染色结果显示，相同培养时间下，随着涂层中白藜芦醇质量分数的增加，RAW264.7细胞数量呈减少趋势。CCK-8检测结果显示，培养24 h，负载质量分数20%，30%，40%白藜芦醇洗脱涂层组RAW264.7细胞增殖少于无涂层组、负载质量分数0%白藜芦醇洗脱涂层组，差异有显著性意义；培养72 h，负载质量分数10%，20%，30%，40%白藜芦醇洗脱涂层组RAW264.7细胞增殖少于无涂层组，负载质量分数20%，30%，40%白藜芦醇洗脱涂层组RAW264.7细胞增殖少于负载质量分数0%白藜芦醇洗脱涂层组，差异均有显著性意义。
对血小板黏附与激活、人脐静脉内皮细胞、人主动脉平滑肌细胞和巨噬细胞增殖实验数据进行归一化处理，并绘制热图，结果如图8显示，发现质量分数30%白藜芦醇洗脱涂层表现出最佳的综合性能，因此，选择质量分数30%白藜芦醇洗脱涂层进行后续实验。

2.5 白藜芦醇洗脱涂层的机械性能测试结果血管支架在体内应用时需要承受体内不同的物理负荷，包括血流的压力、组织的拉伸等，支架需要具有适应这些应力变化的能力，避免因力学性能不足而发生形变或失效。研究表明药物洗脱支架能够达到体内负荷要求[51]。当支架发生形变时，若涂层缺乏足够的延展性，可能会出现开裂或剥离现象，进而导致药物释放不均或失效，甚至损害支架的生物相容性和功能完整性。各组样品的扫描电子显微镜下图像，见图9A-F。316L不锈钢支架表面呈现典型的金属加工形貌，负载0%白藜芦醇洗脱涂层(单纯的聚乳酸-羟基乙酸共聚物涂层)316L不锈钢支架表面形成连续、无裂纹的聚合物薄膜，完全覆盖金属基底，负载质量分数30%白藜芦醇洗脱涂层316L不锈钢支架表面形貌与负载0%白藜芦醇洗脱涂层316L不锈钢支架基本一致，表明药物负载未引起相分离或孔洞缺陷，并且表面均匀一致，未见明显破损或厚度不均的情况。经球囊扩张316L不锈钢支架后，白藜芦醇洗脱涂层未出现涂层剥落、裂缝扩展等问题，能够适应血管支架在应用中的变形要求，见图9G-J。

2.6 白藜芦醇洗脱涂层的药物体外释放行为检测结果白藜芦醇洗脱涂层的药物体外释放见图10。在释放的初始阶段，白藜芦醇洗脱涂层表现出较快的药物释放速率，推测是由于药物分子分布在聚乳酸-羟基乙酸共聚物涂层表面的部分较为松散，容易快速扩散到释放介质中；15 d后，白藜芦醇洗脱涂层的药物释放速率呈现减缓趋势，并能够保持稳定的持续释放状态；至第30天，药物累计释放量达到(36.49±1.22)%。表明该白藜芦醇洗脱涂层能够实现至少30 d的稳定可控药物释放，对于长效药物输送具有重要价值，有助于减少给药频率并提高药物治疗的持续性和有效性。

2.7 白藜芦醇洗脱涂层对巨噬细胞表型的影响实验结果动脉粥样硬化是一种慢性关键特征的复杂病理过程，而巨噬细胞通过其功能可塑性发挥核心调控作用[52-54]，这类免疫细胞表现出的表型可塑性转变(促炎型巨噬细胞与抗炎型巨噬细胞)深刻影响着斑块的形成机制、进展过程及结构稳定性[55-56]，其中促炎型巨噬细胞通过分泌促炎递质(肿瘤坏死因子α、白细胞介素6)和活性氧加剧血管内皮损伤并促进脂质异常沉积，从而驱动易损斑块的形成；抗炎型巨噬细胞能够依赖抗炎因子(白细胞介素10)和促进组织修复的生长因子(转化生长因子β)，在促进斑块区域组织修复、调控脂质代谢平衡以及增强斑块结构稳定性等方面产生保护性效应[57-58]。
氧化应激条件下各组样品表面RAW264.7细胞的表型转化结果，见图11所示。免疫荧光染色结果显示，负载质量分数30%白藜芦醇洗脱涂层组促炎型巨噬细胞标志物CD86表达低于无涂层组、负载质量分数0%白藜芦醇洗脱涂层组(P < 0.000 1)，抗炎型巨噬细胞标志物CD206表达高于无涂层组、负载质量分数0%白藜芦醇洗脱涂层组(P < 0.001)，表明白藜芦醇洗脱涂层能够促进巨噬细胞向抗炎表型转化。因此，白藜芦醇洗脱涂层能够有效调整巨噬细胞的促炎型巨噬细胞/抗炎型巨噬细胞比例，从促进炎症状态向抗炎、修复状态转化。

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引言

冠状动脉粥样硬化性心脏病的核心病理机制是动脉粥样硬化，与脂质异常积累、慢性炎症和血小板激活密切相关[1-3]。目前，经皮冠状动脉介入及其核心器械药物洗脱支架已成为主流治疗手段[4-9]。药物洗脱支架通过支架表面的药物涂层持续释放抗增殖药物，抑制血管平滑肌细胞的过度增生，有效降低了支架内再狭窄的发生率。然而，传统药物洗脱支架存在显著局限性[10]：一方面，雷帕霉素和紫杉醇等抗增殖药物虽能抑制平滑肌细胞增生，但会延迟内皮修复，增加晚期血栓风险[11-12]；另一方面，永久性聚合物涂层可能引发慢性炎症反应[13]。因此，人们对药物洗脱支架的长期安全性提出了担忧[14-15]。
为突破这些限制，可降解材料成为研究的热点。由可生物降解聚合物或金属制成的支架得到越来越多的应用[16-18]，然而，可生物降解聚合物的降解速率和材料性能之间的权衡需要进一步优化[19]，生物可吸收金属支架(如铁基支架)的降解速度较慢，并且会给嵌入式支架附近的MRI成像带来问题[20]。镁合金支架植入后因耐腐蚀性不足而容易发生血栓形成、炎症和快速再狭窄，仍然是临床实践中的主要挑战[21-22]。因此，可生物降解药物洗脱涂层成为心血管疾病应用的首选，旨在解决药物洗脱后残留耐用聚合物的长期影响[23-24]。理想的可生物降解药物洗脱支架在动脉阻塞消退过程中起到机械支撑作用，随后降解而不会对人体造成刺激、炎症或任何不利影响。近年来，在各种候选聚合物中，美国食品药品管理局批准的聚乳酸-羟基乙酸共聚物作为一种常用的生物降解高分子材料[25]，因优异的生物相容性和可控降解特性被广泛应用于药物输送系统和医疗器械[26-27]。
为了实现可生物降解药物洗脱支架的最佳性能，涂层的制备方法同样至关重要。目前，有许多可制备聚合物涂层的技术，例如旋涂、静电纺丝和浸涂涂覆等，其中，旋涂法浪费资源的比例超过90%[28]，静电纺丝中药物受到高压电场、溶剂挥发和静电纺丝过程中固化处理的影响，导致药物稳定性下降[29]，浸涂涂覆涂层只微弱地黏附在基材表面[30-31]，而喷涂具有明显优势，能涂覆支架等三维微结构[32]。超声雾化喷涂技术能够将药物与基底材料均匀结合，形成稳定可控的涂层[33]，并且成本效益高，可避免高温或有机溶剂对药物活性的影响[34]，在平面和非平面上都能实现精确的保形涂层，通过微米级小液滴控制达到一致的可重复性[35]。
传统的抗增殖药物(紫杉醇等)因非选择性抑制细胞增殖的特性，可能导致内皮修复延迟和晚期血栓风险。相比之下，天然药物因多靶点调控特性和良好生物相容性展现出显著优势。在众多候选天然化合物中，白藜芦醇因具有独特的药理特性脱颖而出，它表现出选择性调控作用，既能有效抑制平滑肌细胞增殖[36-38]，又可促进内皮细胞修复[39-40]；具备优异的抗炎、抗氧化作用[41]；相比其他天然化合物(如姜黄素、槲皮素)，白藜芦醇具有更优的稳定性、组织渗透性，为动脉粥样硬化病灶的修复提供了潜在优势，成为药物洗脱支架的理想候选药物。
此次研究利用白藜芦醇的多种功效，以聚乳酸-羟基乙酸共聚物作为药物载体，结合超声雾化喷涂法制备了一种新型药物洗脱涂层支架(图1)，同时表征支架的理化性质与体外特性，以期为药物洗脱支架的优化提供一种新型策略。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计涂层材料制备与表征实验。
1.2 时间及地点实验于2024年6-12月在西南交通大学生命科学与工程学院的实验室内完成。
1.3 材料
1.3.1 材料与细胞 316L不锈钢片材(德博钢铁有限公司)；316L不锈钢支架(Kossel Medtech有限公司)；人脐静脉内皮细胞、人主动脉平滑肌细胞和小鼠巨噬细胞RAW264.7[普诺赛生命科技有限公司(武汉)]。人脐静脉内皮细胞采用含体积分数15%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM/F-12培养基培养。人主动脉平滑肌细胞采用含体积分数15%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的平滑肌细胞专用培养基中培养。RAW264.7细胞采用含体积分数15%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基培养。所有细胞都在37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中进行传代培养。后续实验均选择第3-12代细胞。
1.3.2 药物与试剂聚乳酸-羟基乙酸共聚物(75∶25，Mw=(10.5-12.6)×104，岱罡生物工程有限公司)；白藜芦醇(纯度≥99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；四氢呋喃(科隆化学试剂有限公司)；DMEM/F12培养基(赛默飞世尔科技公司)；RPMI 1640培养基(赛默飞世尔科技公司)；胎牛血清(美国Hyclone公司)；无水乙醇(永华化学股份有限公司)；戊二醛(科隆化学试剂有限公司)；二甲基亚砜(≥99.9%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；乳酸脱氢酶试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；ELISA检测试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司)；荧光探针(美国Med Chem express生物科技公司)；脂多糖(上海碧云天生物技术有限公司)；1%青霉素-链霉素(武汉普诺赛生命科技有限公司)；CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所)；罗丹明123染色试剂(北京索莱宝科技有限公司)；牛血清白蛋白(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；抗CD86抗体、抗CD206抗体、山羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor® 488)和山羊抗小鼠IgG H&L(Alexa Fluor® 555)[艾博抗贸易有限公司(上海)]。
1.3.3 主要仪器傅里叶变换红外吸收光谱仪(ThermoFisher Scientific，Nicolet iN10，美国)；倒置荧光显微镜(Thermo Scientific，EVOS M5000，美国)；扫描电子显微镜(JSM-IT810，日本)；离子溅射仪(舜仪JS-1600，中国)；全波长酶标仪(Bio Tek，美国)；CO2细胞培养箱(Thermo，美国)；PE紫外可见/近红外分光光度计(LAMBDA 1050+，英国)；生物超净台(Thermo，美国)；激光共聚焦显微镜(LSM900 with Airyscan2，Zeiss，Germany)；超声雾化喷涂系统(北京东方金荣超声电器有限公司)；测角仪(Krüss GmbH DSA 100 Mk 2，Hamburg，Germany)。
1.3.4 实验动物成年新西兰大白兔，雄性，12-24月龄，体质量2.0-3.0 kg，购自成都达硕实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK(川)2024-0028。实验已通过西南交通大学医学伦理委员会批准[SWJTU-2403-NSFC(140)]。
1.4 实验方法超声雾化喷涂的主要目的是在复杂三维结构上实现均匀、可控、高效的涂层沉积，而蒸发沉积法主要是在平整、简单的基材上制备涂层。由于白藜芦醇洗脱支架调控动脉粥样硬化的体外实验(水接触角、体外血液相容性、巨噬细胞活性氧释放检测、体外细胞相容性评价、体外药物释放检测与巨噬细胞表型调节实验)需要大量、均匀的薄膜涂层，并且材料的基础性能表征测试在复杂支架上可能非常困难或不准确，因此，此次研究采用蒸发沉积法制备不锈钢片材涂层，以确保实验的高度可重复性，为后续支架涂层提供重要的基础数据和支撑；蒸发沉积法无法在支架表面均匀覆盖，因此采用超声雾化喷涂法在不锈钢支架表面制备涂层，以模拟真实的应用场景，用于评估支架的机械性能。
1.4.1 制备白藜芦醇洗脱涂层将白藜芦醇粉末用二甲基亚砜溶解，以四氢呋喃为溶剂制备溶液，配置白藜芦醇与聚乳酸-羟基乙酸共聚物质量比分别为0%，10%，20%，30%，40%的溶液，其中聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量浓度为2 mg/mL，混合搅拌均匀。
采用蒸发沉积法在316L不锈钢片材表面制备涂层：依次用去离子蒸馏水和无水乙醇超声清洗316L不锈钢片材2次，干燥备用。在干燥片材表面分别均匀滴加50 μL白藜芦醇与聚乳酸-羟基乙酸共聚物质量比分别为0%，10%，20%，30%，40%的溶液，置于25 ℃密闭环境中沉积3 h，室温下晾干3 h，得到质量分数0%，10%，20%，30%，40%白藜芦醇洗脱涂层，转移到真空干燥箱中干燥保存。
采用超声雾化喷涂法在316L不锈钢支架表面制备涂层：使用去离子蒸馏水和无水乙醇超声清洗316L不锈钢支架2次，将支架固定在超声雾化喷涂系统的运动轴上，设置超声功率2 W，以0.75 cm/s的速度喷涂白藜芦醇与聚乳酸-羟基乙酸共聚物质量比分别为0%，30%溶液，共进行40次喷涂循环，喷涂结束后在室温下干燥8 h，得到质量分数0%，30%白藜芦醇洗脱涂层，转移至真空干燥箱中干燥保存。
1.4.2 白藜芦醇洗脱涂层的材料学表征
亲水性检测：在室温条件下，在316L不锈钢片材、负载聚乳酸-羟基乙酸共聚物涂层316L不锈钢片材与负载质量分数0%，10%，20%，30%，40%白藜芦醇洗脱涂层316L不锈钢片材表面分别滴加4 μL去离子蒸馏水，利用测角仪检测水接触角，每组包含4个平行样，每个样品选择表面3个不同位置进行测量。
化学结构检测：将聚乳酸-羟基乙酸共聚物粉末、白藜芦醇粉末以及固化后刮下来的白藜芦醇@聚乳酸-羟基乙酸共聚物涂层粉末制成溴化钾压片，通过傅里叶变换红外光谱仪分析涂层的化学
结构。
机械性能检测：使用球囊扩张实验评估心血管支架上白藜芦醇洗脱涂层的附着性与机械稳定性。将负载质量分数30%白藜芦醇洗脱涂层的316L不锈钢支架固定于球囊扩张导管上，以0.8 MPa压力扩张1 min，通过扫描电子显微镜观察扩张后支架涂层的表面形貌。同时通过扫描电子显微镜观察316L不锈钢支架、负载聚乳酸-羟基乙酸共聚物涂层316L不锈钢支架的表面形貌。
1.4.3 白藜芦醇洗脱涂层的体外血液相容性检测抽取新西兰大白兔颈内静脉血，使用含抗凝剂(如乙二胺四乙酸或柠檬酸钠)的采血管收集全血，1 500×g离心15 min后分2层，收集上层获得富血小板血浆，用于后续血小板黏附与激活实验。操作需在低温下进行，以减少血液活性改变。将采集的全血与生理盐水按体积比5∶4混合，充分振荡混匀，制备稀释血样，备用。
溶血率检测：取9.8 mL的生理盐水和去离子蒸馏水分别加入试管中，作为阴性对照、阳性对照；将316L不锈钢片材与负载质量分数0%，10%，20%，30%，40%白藜芦醇洗脱涂层316L不锈钢片材分别放入含9.8 mL生理盐水的试管中，于37 ℃恒温环境下预热30 min；向每个试管中滴加200 μL稀释血样，置于37 ℃条件下孵育1 h；将所有液体转移至新离心管中3 000 r/min离心5 min，吸取200 μL上清液加入96孔板中，使用紫外分光光度计在540 nm波长下测定各组吸光度值，计算溶血率。溶血率< 5%为符合ISO 10993-4标准。
溶血率(%)=(实验组吸光度值-阴性对照组吸光度值)/(阳性对照组吸光度值-阴性对照组吸光度值)×100%
血小板黏附实验：316L不锈钢片材与负载质量分数0%，10%，20%，30%，40%白藜芦醇洗脱涂层316L不锈钢片材表面分别滴加300 μL的富血小板血浆，置于37 ℃恒温培养箱中孵育40 min，以模拟体内血小板黏附环境；孵育完成后，使用生理盐水轻柔冲洗样品3次，以清除未黏附在样品表面的血小板；浸入2.5%戊二醛固定液中室温固定10 h以稳定血小板形态，依次通过体积分数50%，75%，90%和100%乙醇溶液脱水，每个浓度下浸泡30 min，置于通风干燥箱内风干，使用扫描电子显微镜观察样品表面的血小板黏附形态和数量。
血小板激活实验：将316L不锈钢片材与负载质量分数0%，10%，20%，30%，40%白藜芦醇洗脱涂层316L不锈钢片材分别浸入富血小板血浆中，置于37 ℃恒温培养箱内孵育1 h；用生理盐水缓慢清洗样品以去除未黏附的血小板，在样品表面滴加100 µL的10%Triton X-100溶液，使用超声处理5 min以破碎血小板，将处理后的液体转移至离心管中1 500 r/min离心15 min，收集上清液，使用乳酸脱氢酶ELISA试剂盒、P-选择素ELISA试剂盒检测乳酸脱氢酶与P-选择素浓度。
1.4.4 白藜芦醇洗脱涂层对巨噬细胞活性氧释放的影响将RAW264.7细胞分别接种于316L不锈钢片材与负载质量分数0%，10%，20%，30%，40%白藜芦醇洗脱涂层316L不锈钢片材表面，细胞数量为3×104，加入100 ng/mL脂多糖诱导氧化应激反应[42]，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中。孵育24 h后移除旧培养基，用PBS洗涤后加入10 μmol/L DCFH-DA荧光探避光孵育30 min；移除探针溶液，用PBS洗涤且更换新培养基，使用倒置荧光显微镜观察样品并采集图像，使用Image J软件定量分析荧光强度。
1.4.5 白藜芦醇洗脱涂层的体外细胞相容性评价 316L不锈钢片材与负载质量分数0%，10%，20%，30%，40%白藜芦醇洗脱涂层316L不锈钢片材经过紫外线杀菌处理30 min，备用。
将人脐静脉内皮细胞(或人主动脉平滑肌细胞)分别接种于上述6组样品表面，细胞数量为2×104，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中；将RAW264.7细胞分别接种于上述6组样品表面，细胞数量为5×104，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中。培养24，72 h后，CCK-8试剂盒检测450 nm波长下的吸光度值；40 g/L多聚甲醛固定液固定后使用罗丹明123染色，通过倒置荧光显微镜观察细胞分布和形态。
将血小板黏附与激活实验以及人脐静脉内皮细胞、人主动脉平滑肌细胞和RAW264.7细胞的CCK-8检测实验数据进行归一化处理，绘制热图，筛选出综合性能最优的涂层进行后续实验。
1.4.6 白藜芦醇洗脱涂层的体外药物释放检测将负载质量分数30%白藜芦醇洗脱涂层的316L不锈钢片材浸入PBS中，置于37 ℃恒温箱中，每隔3 d更换PBS。于设定时间点(0，1，3，7，15，21，30 d)抽取一定体积的PBS(同时补充等体积的PBS)，用紫外可见分光光度计测量洗脱液在280 nm处的吸光度值，计算药物累计释放量。
1.4.7 白藜芦醇洗脱涂层对巨噬细胞表型的影响将 RAW264.7细胞分别接种于316L不锈钢片材、与负载质量分数0%，30%白藜芦醇洗脱涂层316L不锈钢片表面，细胞数量为2×104，加入100 ng/mL脂多糖诱导氧化应激反应(建立动脉粥样硬化模型)，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中。培养48 h后移除培养基，用生理盐水洗涤3次，40 g/L多聚甲醛固定细胞2 min，用PBS清洗3次；在样品表面加入400 μL 0.1%Triton X-100透化5 min，用PBS清洗，滴加1.5%牛血清白蛋白封闭1 h；分别加入CD86和CD206抗体(1∶750稀释)于4 ℃过夜孵育，用PBS清洗，加入Alexa Fluor® 488和Alexa Fluor® 555二抗(1∶200稀释)室温孵育1 h；用DAPI染液避光孵育5-10 min，用PBS洗涤，通过激光共聚焦显微镜观察样品并采集图像，使用Image J软件定量分析荧光强度。
1.5 主要观察指标白藜芦醇洗脱涂层的水接触角、血液相容性、抗氧化特性、药物释放动力学、机械性能以及对人脐静脉内皮细胞、人主动脉平滑肌细胞、巨噬细胞生长行为与巨噬细胞表型的影响。
1.6 统计学分析应用Oringin、Graph pad软件进行统计学分析，实验结果以x±s表示，对数据进行单因素方差分析。P < 0.05 为差异有显著性意义。该文统计学方法已经西南交通大学统计学专家审核。

讨论

近年来，针对心血管支架晚期血栓和再狭窄问题的研究取得了显著进展。药物洗脱涂层的主要目的是引发抗增殖反应，从而降低支架内再狭窄的风险[59]。第一代的药物洗脱支架通过释放抗增殖药物(如紫杉醇和雷帕霉素)不仅抑制了平滑肌细胞的增殖，同时也抑制了血管内皮细胞的生长，引发慢性炎症和晚期血栓问题[60]。基于此，第二代药物洗脱支架采用新型抗增殖药物佐他莫司、依维莫司等和耐用聚合物涂层[61]，支架性能有所提升。然而，前两代药物洗脱支架后期存在晚期血栓形成、极晚期支架内血栓形成、延迟愈合和炎症的问题，主要与支架中的永久性聚合物有关，这种聚合物不会随着时间的推移而侵蚀，即使聚合物中所含的药物全部被洗脱出来，它仍会留在那里成为引发炎症反应的原因，重新激活再狭窄过程。为解决上述问题，研究者将目光转向可生物降解聚合物，如聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物等，这些聚合物在水解条件下会降解，并且具有生物相容性[62]。同时无聚合物药物洗脱支架概念被提出，但该支架的开发仍然存在重大的制造和工程挑战[13，63]。聚合物涂层制备技术如浸涂法和旋涂法，虽然工艺简单，但在药物均匀分布性和支架表面涂抹力方面存在不足。超声雾化喷涂法通过高频振动将药液转化为微米级液滴，实现药物与基底材料的均匀结合，形成稳定可控的涂层。相较于传统方法，超声雾化喷涂法具有以下优势：避免高温或有机溶剂的使用，最大程度保护药物活性；适用于复杂曲面结构，可在平面和非平面基底上实现高精度的保形涂覆；液滴尺寸均一性好，工艺重复性优异。
已有研究将天然活性成分引入支架设计，这些化合物不仅具有抗氧化和抗炎作用[64]，还能兼顾抗增殖与促进内皮化的双重功效[65]，无论是通过负载还是共价固定都是非常有前途的天然化合物。白藜芦醇属于富含酚类结构的天然化合物，因抗氧化、抗炎、抗菌和抗癌特性而越来越受到重视，在生物医学应用中具有价值[66]。
此次研究基于超声雾化喷涂法[67]，利用聚乳酸-羟基乙酸共聚物作为载药载体，成功制备了以白藜芦醇为活性成分的心血管支架，系统评估了支架的理化性质及在体外动脉粥样硬化模型中的应用潜力，结果证实高质量分数白藜芦醇洗脱涂层显著抑制血小板的黏附与激活，并且所有涂层均未引起溶血反应，进一步验证了涂层优异的生物安全性。
在生物学功能评估中，与传统药物涂层相比，白藜芦醇洗脱涂层展现出显著的多效性优势。实验结果表明，白藜芦醇不仅具有强效的抗氧化和抗炎作用，还能够促进内皮细胞的修复，抑制平滑肌细胞的过度增殖和巨噬细胞的炎症反应，有效避免了传统药物涂层可能引发的内皮功能障碍。通过对所有实验数据进行归一化处理发现，当支架表面涂层中白藜芦醇装载质量分数较低时(如10%或20%)，支架的的抗氧化、抑制血小板黏附以及促进内皮细胞增殖等作用未能充分发挥，并且药物释放量不足，可能影响支架在病变部位的长期治疗效果；相反，当白藜芦醇装载质量分数为30%时，涂层表现出最佳的综合性能，包括抗氧化、生物活性。因此，选择质量分数30%白藜芦醇洗脱涂层进行后续实验。
将质量分数30%白藜芦醇洗脱涂层制备在316L不锈钢支架上，通过扫描电子显微镜对涂层形貌进行微观观察，结果表明负载白藜芦醇洗脱涂层支架具有良好的机械稳定性，支架撑开后涂层未出现破裂现象，证明了涂层的机械可靠性。此外，利用紫外分光光度仪对质量分数30%白藜芦醇洗脱涂层的药物释放行为进行了长期动态评估，明确了涂层在体内的持续释放特性，为临床应用提供了可靠的理论依据。最后，通过巨噬细胞表型转换实验进一步验证了白藜芦醇洗脱涂层在调节巨噬细胞行为中的积极作用，为涂层的抗炎机制提供了实验支持。
综上所述，此次研究开发的质量分数30%白藜芦醇洗脱涂层支架在促进内皮化、抑制平滑肌细胞增殖、调节巨噬细胞行为以及抑制血小板黏附及活化等方面表现出优异的综合性能。质量分数30%白藜芦醇洗脱涂层独特的生物活性成分、稳定的药物释放特性以及良好的机械性能和血液相容性，为动脉粥样硬化病变的治疗提供了新的策略和工具。未来将进一步开展动物实验将有助于验证该涂层的安全性和有效性，推动它在心血管疾病治疗中的实际应用。此外，基于白藜芦醇的多效性机制，未来还可探索其在其他血管疾病治疗中的潜在应用，为心血管医学领域带来更多创新性突破。
然而，该研究仍存在一定的局限性：虽然白藜芦醇释放行为在外部削弱了表现出的可控性，但其内部复杂环境影响的具体释放动力学仍需进一步验证；此外，还需要通过大规模动物实验进一步支持白藜芦醇洗脱涂层支架的治疗效果；此次研究的另一焦点是对涂层长期稳定性和生物降解行为的探讨尚不全面，这对于临床来说至关重要。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程