2.1   实验动物数量分析   48只SD大鼠全部进入结果分析。
2.2   各组大鼠体质量变化   造模前，3组大鼠体质量比较差异无显著性意义(P > 0.05)；造模后，与空白组比较，模型组与滞动针组大鼠体质量增长缓慢，可能与大鼠情绪、睡眠等问题有关；治疗结束后，模型组大鼠体质量低于空白组(P < 0.01)，滞动针组大鼠体质量高于模型组(P < 0.01)，见图1，说明滞动针可通过“神经-体液-内分泌”缓解肌筋膜疼痛综合征大鼠的疼痛，从而改善大鼠体质量。
2.3   各组大鼠机械缩足阈值比较   
2.3.1   组内比较   空白组造模前、造模结束后及治疗结束后的大鼠机械缩足阈值无明显变化(P > 0.05)；模型组大鼠造模结束后及治疗结束后的机械缩足阈值低于造模前(P < 0.05)，造模结束后及治疗结束后的机械缩足阈值比较差异无显著性意义(P > 0.05)；滞动针组大鼠造模结束后的机械缩足阈值低于造模前(P < 0.05)，治疗结束后的机械缩足阈值高于造模结束后(P < 0.05)，见表1。
2.3.2   组间比较   造模前，空白组、模型组和滞动针组大




鼠机械缩足阈值比较差异无显著性意义(P > 0.05)；造模结束后，模型组和滞动针组大鼠机械缩足阈值低于空白组(P < 0.01)，模型组和滞动针组大鼠机械缩足阈值比较差异无显著性意义(P > 0.05)；治疗结束后，与模型组相比，滞动针组机械缩足阈值明显升高(P < 0.01)，见表1。各组大鼠机械缩足阈值变化趋势，见图2。
2.4   各组大鼠肌肉组织形态学观察结果   
2.4.1   股内侧肌解剖观察   空白组大鼠股内侧肌腹弹性尚佳，颜色呈鲜红色，肌纤维未见粘连现象；模型组大鼠股内侧肌腹可触及挛缩的结节，肌纤维不同程度粘连，颜色呈暗红色；滞动针组大鼠股内侧肌腹平整，可偶见挛缩结节松解变小、硬度降低，紧绷带降低。
2.4.2   苏木精-伊红染色   空白组肌细胞形态大小相同，肌细胞间质紧密，纹理光滑，肌纤维排列整齐，可见典型明暗相间的横纹，未见炎性细胞浸润；模型组肌组织不规则、排列紊乱、断裂，肌纤维粗细不等，呈梭形聚集，肌细胞大小不一、间隙增宽，多处有少量炎性细胞浸润，出现核内移现象，肌细胞内出现圆形挛缩结节；滞动针组部分肌纤维排列整齐、间质减少，少量肌纤维断裂，胞核位于肌膜周边，偶见炎性细胞浸润，见图3。
2.5   各组大鼠血清中P物质、β-内啡肽水平   治疗结束后，模型组大鼠血清P物质水平高于空白组、滞动针组(P < 0.01)，模型组大鼠血清β-内啡肽水平低于空白组、滞动针组(P < 0.01)，见图4A，B。
2.6   各组大鼠中脑导水管周围灰质中P物质、β-内啡肽水平   治疗结束后，模型组大鼠中脑导水管周围灰质中P物质、β-内啡肽水平均低于空白组(P < 0.05，P < 0.01)，模型组大鼠中脑导水管周围灰质中P物质、β-内啡肽水平均低于滞动针组(P < 0.05，P < 0.01)，见图4C，D。
2.7   各组大鼠中脑导水管周围灰质中c-fos、Iba-1、脑源性神经营养因子表达   
2.7.1   中脑导水管周围灰质中c-fos表达比较   c-fos免疫组化阳性染色呈棕黄色或淡黄色颗粒，多在胞核和胞浆表达且多见密集，胞质着色深浅不一。免疫组化染色结果显示，模型组c-fos阳性表达多于空白组(P < 0.001)，滞动针组c-fos阳性表达多于模型组(P < 0.001)，见表2、图5。
2.7.2   中脑导水管周围灰质中Iba-1表达比较   静息状态下，小胶质细胞标志物Iba-1免疫组化阳性染色呈现棕黄




色或褐棕色，形态呈现分支样，数量不一，突起细小。免疫组化染色结果显示，模型组Iba-1阳性表达多于空白组、滞动针组(P < 0.001)，见表2、图6。
2.7.3   中脑导水管周围灰质中脑源性神经营养因子蛋白表达比较   小胶质细胞的活化水平可调节脑源性神经营养因子的表达，而疼痛的转导与中脑导水管周围灰质中脑源性神经营养因子蛋白相关。Western Blot检测结果显示，模型组脑源性神经营养因子蛋白表达高于空白组、滞动针组(P < 0.001)，见表2，图7。

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肌筋膜疼痛综合征是常见于肌肉骨骼疼痛系统的慢性炎性症候群，主要表现是局部疼痛和远处牵涉痛，常见于背部、颈肩部，可引起慢性和持续性局部疼痛、肌肉无力[1-2]。据统计，有30%-93%的慢性肌肉骨骼疼痛患者患有肌筋膜疼痛综合征[3]。现今，肌筋膜疼痛综合征的诊疗标准以及病理生理学尚未统一[4]。引发肌筋膜疼痛综合征的根本原因是肌筋膜中存在疼痛的紧绷带，并且存在高度敏感的病灶点，称为激痛点。目前关于激痛点发生维持机制尚无统一标准，主要包括整体假说、能量危机假说、中枢致敏假说、下行抑制假说等[4-5]，其中整体假说广泛被人们接受。近年来，中枢致敏假说也备受关注，激痛点已被证实与脊髓背角和背根神经节的神经元活性和疼痛递质相关，但对于脊髓以上水平结构和功能的了解较少。研究表明，激痛点致使脊髓及以上水平上下行疼痛通路受损，加剧了疼痛易化放大、减少了内源性疼痛抑制[6]，这无疑丰富了中枢致敏假说。研究发现，肌筋膜疼痛综合征患者中脑导水管周围灰质的脑血流与功能耦合程度均降低，这可能与疼痛程度和病程相关[7]；电针刺激激痛点通过脑干中脑导水管周围灰质介导疼痛信号转导[8]，由此可见，激痛点可能通过激活中脑导水管周围灰质的神经元或疼痛递质以调控大脑痛觉调制系统，加剧中枢致敏的发生与维持状态。激痛点发生维持机制复杂，部分患者治疗效果不佳、复发率较高，甚至严重影响机体功能。因此，迫切需要探寻有效治疗肌筋膜疼痛综合征的方法，以缓解疼痛、纠正异常姿势并恢复整体力学平衡。
基于古代经典手法，滞动针是将“滞针术”与“动针”相结合的创新针法[9]。滞动针因针身特有的凹槽，对肌筋膜炎、肩周炎、关节疼痛及周围性面瘫等疾病疗效显著[10]。相比于肌筋膜疼痛综合征专家共识中所推荐的治疗方法之一——银针导热法[5]，滞动针治疗的优势在于疗效显著、远期效应长、治疗周期短。研究表明，滞动针治疗腰臀部肌筋膜疼痛综合征的总有效率明显高于对照组，并且疗效显著[11]。张卫华教授根据不同滞动针疗法松解了激痛点处挛缩结节，有效减轻了颈肩腰背部肌筋膜炎患者的疼痛[10]。研究表明，滞动针作用于激痛点的作用机制是以“动静并举”为治疗理念，通过机械性牵拉松解粘连、改善局部组织循环、降低筋膜组织张力，实现“以松止痛”的目的，并有效缓解疼痛[12]。肌筋膜疼痛综合征致使激痛点处局部灌注不足和血氧循环障碍，导致能量代谢失衡，恰好滞动针能够有效针对肌筋膜疼痛综合征这一问题精准治疗且疗效最大化。然而，滞动针是如何影响大脑痛觉调制功能，继而使中枢致敏增强以调控肌筋膜疼痛综合征的发展过程尚不清楚。大脑痛觉调制系统中最先启动的关键脑核团是中脑导水管周围灰质，中脑导水管周围灰质减弱疼痛信号可能是源于其下行投射终末所释放的P物质参与中枢内源性镇痛系统，进一步激活中缝大核内神经激肽1的下行投射神经元发挥镇痛作用[13]。P物质和β-内啡肽均参与中枢内源性镇痛系统，调控中枢下行痛觉抑制作用。P物质属于神经递质，过多的神经递质表达可引起小胶质细胞激活[14]，小胶质细胞激活可诱导c-fos神经元的活性和激活脑源性神经营养因子蛋白的表达，在中枢致敏过程中起到关键作用，同时也是肌筋膜疼痛综合征的重要病理环节[15-17]。鉴于此，此次实验选择中脑导水管周围灰质为观察核团，研究中脑导水管周围灰质对疼痛信息的调控，有助于更加清楚了解肌筋膜疼痛综合征维持机制——中枢致敏。为进一步明确滞动针对肌筋膜疼痛综合征的干预疗效及作用机制，此次实验建立了肌筋膜疼痛综合征大鼠模型，通过机械痛阈评估滞动针治疗肌筋膜疼痛综合征的疗效，检测血清和中脑导水管周围灰质中P物质、β-内啡肽表达，并进一步观察中脑导水管周围灰质中小胶质细胞标志物Iba-1、c-fos神经元和脑源性神经营养因子蛋白的表达，探索中枢下行抑制系统调控中枢致敏的作用，为临床治疗肌筋膜疼痛综合征提供有效的干预靶点，为肌筋膜疼痛综合征的发病机制提供实验室依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   随机对照动物实验，组内比较采用重复测量方差分析，组间比较用单因素方差分析。
1.2   时间及地点   实验于2023年4-10月在西安体育学院实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   雄性SD大鼠54只，SPF级，7周龄，体质量220-270 g，购自空军军医大学实验动物研究中心，动物许可证号：SCXK(陕)20199001。大鼠饲养于西安体育学院实验室，饲养温度恒温(22.0±0.5) ℃、50%相对湿度、昼夜循环光照12 h(照明时间为早晨8：00-晚上8：00)，供应充足的饲料和水，定期更换垫料，确保良好的通风条件。动物实验已获得西安体育学院实验动物伦理委员会批准(XAIPE2023049)。实验动物在麻醉下进行所有的操作，并尽一切努力最大限度地减少其痛苦。
1.3.2   主要试剂与仪器   P物质ELISA检测试剂盒(泉州睿信生物科技有限公司，货号：RX302949R)，β-内啡肽 ELISA检测试剂盒(泉州睿信生物科技有限公司，货号：RXJ302908R)，c-fos抗体(Servicebio货号：GB12069)，小胶质细胞标志物Iba-1(Servicebio，货号：GB113502)，兔抗脑源性神经营养因子抗体(Afftity，货号：DF6387)，HRP 标记的山羊抗小鼠IgG (Servicebio，货号：GB23301)，HRP标记的山羊抗兔IgG(Servicebio，货号：GB23303)，免疫组化染色DAB试剂盒(武汉塞维尔生物科技有限公司)，ECL发光液(奥锐精创生物科技有限公司)，BCA法蛋白定量试剂盒和蛋白提取试剂盒(鼎国公司)，RIPA裂解液(鼎国昌盛科技有限公司)，戊巴比妥钠(北京普博斯生物科技有限公司)。
滞动针(九子岭牌，生产许可证：苏药监械生产许20010046号)，动物跑步台(江苏赛昂斯生物科技有限公司)，动物打击器(自制)，组织脱水机(意大利迪佩斯(DIPATH))，石蜡包埋机(武汉俊杰电子有限公司)，组织摊片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)，荧光显微镜(德国Leica)，Von Frey纤维丝测痛仪(中国上海玉研仪器有限公司)。
1.4   方法   
1.4.1   实验分组   大鼠适应性饲养1周后逐一称体质量并记录。适应性平跑15 min后，按照随机数字表法将54只SD大鼠随机分为空白组(n=16)和造模组(n=38)，造模组采用“打击结合离心运动”方式制备左侧股内侧肌筋膜疼痛综合征模型，造模12周后随机挑选6只验证造模成功，将剩余32只造模成功大鼠随机分为模型组(n=16)与滞动针组(n=16)，使用滞动针对滞动针组大鼠左侧股内侧肌筋膜局部激痛点进行干预治疗。
1.4.2   肌筋膜疼痛综合征大鼠模型的建立与验证   造模包括8周建模期和4周恢复期，共计12周。建模期采用钝性打击结合离心跑的方法建立肌筋膜疼痛综合征模型[18]。每周第1天对所有大鼠称质量并记录，腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥钠麻醉后，逐一将大鼠仰卧位置于打击器下方并固定，标记大鼠左侧股内侧肌中段偏上位置为打击点，打击器与股内侧肌接触面积为1 cm×1 cm，打击木棒的质量为1 200 g、直径为1 cm，将木棒置于打击点20 cm处垂直自由下落，击打标记部位1次，动能2.352 J，检查被打击的皮肤骨骼是否完好，无碍后放回笼中喂养；第2天进行离心跑(大鼠跑台坡度为-16°，速度为16 m/min，运动时长为90 min)，为保证运动质量，实验者会通过电刺激、人为驱赶促使大鼠完成预定运动负荷；其余5 d时间正常喂养大鼠，不进行干预。以上措施重复8周。第9-12周为恢复期，正常饲养，定期更换垫料。
采用国际公认的激痛点存在特征的动物模型成功建立标准[19]。由1名对激痛点诊疗经验丰富的医务人员用示指指腹在大鼠左股内侧按压检查，寻找肌紧张结节，确定后标记其位置；将针插入大鼠激痛点处，若诱发大体可见的抽搐反应则该位置可认定为活跃的激痛点。若大鼠左侧股内侧肌出现肌紧张结节、抽搐反应和牵涉痛现象即为造模成功；通过解剖和苏木精-伊红染色观察左股内侧肌肌纤维挛缩结节、纤维增生或肌纤维增厚、炎性浸润等现象[20]，进一步确认造模成功。



1.4.3   滞动针干预治疗   确认造模成功后第1天，腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥钠麻醉滞动针组大鼠，用固定器固定并伸展其四肢，治疗时对造模后标记的激痛点进行再次触诊，确定是否存在肌紧张带或结节；采用体积分数75%医用乙醇对大鼠局部消毒后，施术者左手拇指、示指固定住激痛点，右手持一次性带凹槽无菌滞动针(规格为0.25 mm×25 mm)，针身与大鼠皮肤呈45°斜向膝关节斜刺进针，针刺深度以贯穿整个激痛点结节为佳；进针后单方向捻转针柄，使局部组织纤维和针身缠绕的“滞针”状态，在产生紧滞感后，通过震颤、提拉、摇摆等针法对激痛点结节进行机械的牵拉、松解、提拉、震颤3-5次，引发抽搐反应；出针时将针柄朝相反方向捻转，使针身和局部组织松解至针体明显松开后缓慢出针。出针后用体积分数75%乙醇常规消毒，确保针刺部位无肿胀、皮温高、血液及组织液渗出等感染情况发生。每周一、三进行干预治疗，连续干预4周。
1.5   主要观察指标   
1.5.1   机械缩足阈值测定   造模前后及治疗后，参考YALCIN等[21-22]和BIBER等[23-24]的检测方法，通过Von frey hair机械疼痛测试仪测量大鼠机械缩足阈值。实验大鼠需提前适应环境15 min。将大鼠置于倒置的透明有机玻璃笼中，放置在3 mm厚的玻璃板上，将动物放在高架铁丝网上，用Von frey hair机械疼痛测试仪垂直刺激足底给予刺激，强度逐渐增强，若大鼠出现缩足、舔足等行为则视为阳性反应，从大鼠首次出现阳性反应记录，采用“Up-Down”法记录动物缩足或无缩足的数值，每只大鼠连续测定6次，每次间隔15 s。每只动物重新测量3轮，中间间隔5 min，取平均值进行统计。 
1.5.2   大鼠血清、中脑导水管周围灰质中P物质及β-内啡肽水平   末次治疗后进行机械缩足阈值测定。机械缩足阈值测定完成后，每组随机选取10只大鼠，抽取腹主动脉血200 µL，加入抗凝剂柠檬酸钠混合10-20 min，4 ℃下3 000 r/min离心20 min，分装后于-80 ℃保存，采用ELISA试剂盒检测P物质及β-内啡肽水平；取中脑导水管周围灰质组织1 g，加入9 g PBS(pH=7.2-7.4)，用匀浆器匀浆充分，4 ℃下3 000 r/min离心20 min，分装后于-80 ℃保存，采用ELISA试剂盒检测P物质及β-内啡肽水平。
1.5.3   左侧股内侧肌组织形态学观察   各组大鼠左侧股骨内侧肌组织解剖后观察肌肉的弹性、挛缩结节、紧绷带和颜色等现象，随后将肌肉组织修剪成0.5 cm×0.5 cm，厚度不做修剪，常规脱水、透明、包埋、切片(厚度5 μm)，脱蜡后进行苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察局部组织形态变化。
1.5.4   免疫组化染色检测中脑导水管周围灰质中c-fos、Iba-1表达   干预4周后，每组随机挑选出6只大鼠进行免疫组化染色检测。取大鼠脑组织，参照Sawyer氏脑图谱定位到中脑导水管周围灰质脑区(导水管腹外侧灰质区)[22, 24]，获取含有中脑导水管周围灰质的脑干，进行常规脱水、透明、包埋，冠状面切片(5 μm)，脱蜡；用柠檬酸钠缓冲液进行抗原修复，用PBS清洗3次，每次5 min；滴加破膜剂孵育15 min，用PBS清洗3次，每次5 min；滴加体积分数3% H2O2孵育10 min，用PBS清洗3次，每次5 min；滴加5% BSA封闭液37 ℃烘箱反应20 min，滴加一抗c-fos(1∶1 000)、Iba-1(1∶800)后置于4 ℃冰箱孵育18 h；分别滴加山羊抗小鼠和抗兔IgG-Biotin(1∶200)孵育1 h，用PBS清洗3次，每次5 min；滴加SABC室温孵育1 h，用PBS清洗3次，每次5 min；DAB染色，苏木精复染，封固，光学显微镜下观察。每一标本随机选取3个视野，利用tissue FAXS view 7.0选取400倍视野，采用Image pro-plus 6.0计算各组大鼠c-fos、Iba-1的阳性神经元面积，每个标本的阳性细胞面积为3个视野的平均值。
1.5.5   Western Blot检测大鼠中脑导水管周围灰质脑源性神经营养因子蛋白表达   干预4周后，每组随机挑选出6只大鼠，分离中脑导水管周围灰质组织，在含有RAPI蛋白裂解液的研磨管中研磨10 s，提取总蛋白质，采用BCA法测定蛋白浓度，等量蛋白质通过SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上，随后用5%脱脂牛奶蛋白封闭；加入一抗脑源性神经营养因子、β-actin(稀释比例均为1∶1 000)在4 ℃下过夜孵育膜；取出膜，加入二抗(1∶5 000)室温孵育1 h，ECL化学试剂盒进行曝光显影，使用Image J软件进行定量分析。蛋白表达水平=蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值。
1.6   统计学分析   采用SPSS 25.0软件进行数据计算与分析，用Graphad prism 10.0绘制统计图，计量资料均符合正态分布，采用x±s或均数±标准误表示，组内比较采用重复测量方差分析，组间比较用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经西安体育学院统计学专家审核。

3.1   肌筋膜疼痛综合征模型的复制及探讨   肌筋膜疼痛综合征模型目前已被多次重复验证，可较好地模拟肌筋膜疼痛综合征在人体的表征，其中主要分为3个不同造模方式：①HSIEH等[25]提出通过反复强直性离心收缩形成的一种大鼠咀嚼肌肌筋膜疼痛模型，具体方法是：将大鼠麻醉后，采用电刺激器刺激至大鼠产生最大强直性离心收缩并张开下颚，随后将电极插入大鼠咬肌，每天40 s，每次刺激10次，持续20 min，整个过程持续14 d。②MARGELEF等[26]在小鼠和大鼠上建立了另一种新的肌筋膜疼痛综合征模型，并进行了体内外实验。注射抗胆碱酯酶药物(甲基硫酸新斯的明、吡斯的明和卡巴拉汀)建立模型，通过肌电图超声、针刺抽搐反应的确认、触诊紧绷带和组织学(观察耳长提肌、膈肌和腓肠肌的形态)这3个金标准来确认模型成功建立。③HUANG等[27]
建立慢性肌筋膜疼痛综合征大鼠模型，分为建模期和恢复期，建模期第1天采用自制打击器将一根为2.352 J的打击棒从垂直高度20 cm处垂直下落至打击点，同时第2天进行离心运动(坡度：-16° ，速度：16 m/min， 时间：90 min)，每周重复1次，持续8周；恢复期正常饲养，持续4周。造模结束后观察肌肉的挛缩结节、局部抽搐反应，在光镜下观察肌肉苏木精-伊红染色，发现激痛点处局部膨大的肌纤维，肌细胞梭形，证实了形成较为稳定的激痛点形态，这也是目前较公认的肌筋膜疼痛综合征模型的造模方法[20]。
此次实验采用黄强民团队的造模方式成功复制了肌筋膜疼痛综合征大鼠模型，大鼠左股内侧肌部位可触摸到隆起的圆形挛缩结节及紧张带，针刺后产生局部抽搐反应；组织病理学结果显示大鼠肌纤维排列紊乱，肌细胞异常肥大，肌纤维粗细不等、断裂、溶解，间隙增宽且大小不一，胞核内移，多见炎性细胞浸润；解剖观察可见挛缩结节、肌纤维不同程度的粘连现象，颜色暗红，表明肌筋膜疼痛综合征大鼠模型成功复制。
3.2   滞动针对肌筋膜疼痛综合征大鼠外周疼痛介质的影响   激痛点的维持是由于持续的肌小节收缩致使外周致敏物质释放增加，引起外周伤害性感受器敏化，引发运动终板功能障碍，进一步加固恶性循环[28]。P物质作为一种致敏物质具备较强的致炎效应，能够刺激多种免疫细胞释放大量的炎症因子，与疼痛信息的传递密切相关[29]。P物质传递外周组织伤害信息，引起感觉神经元兴奋致痛觉过敏和伤害信号的初级传入，引发外周致敏[30-31]。研究表明，活跃的激痛点附近P物质水平显著升高，原因可能是：当伤害性感受器被激活后引起P物质的释放增加，这种动态良性调控现象可能导致背角伤害性神经可塑性的改变，从而使神经元活动兴奋性增加和痛觉过敏加重。HSIEH等[32]发现低强度激光亦可降低肌筋膜疼痛综合征大鼠血清中P物质的表达，认为通过诱导内源性阿片肽来抑制细胞内蛋白激酶 B信号通路的活化，抑制P物质的释放。研究表明，滞针法刺激激痛点可以改善血液循环和增强炎症物质的代谢，从而达到有效治疗肌筋膜疼痛综合征的目的[33]。
β-内啡肽是一种内源性阿片肽物质，在疼痛应激状态下，血液中的β-内啡肽水平通过阻断P物质的释放来抑制疼痛[32]。研究表明，浮针治疗组颈背部肌筋膜疼痛综合征患者血清β-内啡肽的表达明显高于对照组，提示浮针能够有效治疗颈肩部肌筋膜疼痛综合征[34]。HSIEH等[35]采用远端针刺治疗肌筋膜疼痛综合征大鼠，认为内源性阿片系统可能参与远端针刺治疗肌筋膜疼痛综合征的相互作用，这可能是肌筋膜疼痛综合征疼痛的潜在镇痛机制。此外，血液中β-内啡肽水平被认为是反映机体痛阈变化的标准。因此，此次实验结合机械缩足阈值双重验证肌筋膜疼痛综合征大鼠疼痛的变化。
滞动针对肌筋膜炎具有明显疗效，与其机械牵拉、松解挛缩结节、疏通局部的机制密切相关，通过“静以求滞、动以求通”的双重特点，并加之“以针代刀和热效应”的特殊作用，增加局部病变组织的氧气、营养供应，改善机体能量代谢，消除炎症递质及致病物质，实现即刻镇痛效果[10, 36]。此次实验结果发现，模型组大鼠外周血清中P物质水平明显升高，并且大鼠的机械缩足阈值降低，说明造模期间肌筋膜疼痛综合征大鼠疼痛敏感，由于外周伤害性刺激诱导了机体产生炎症反应，致使P物质的释放增加，引发痛觉过敏；而大鼠血清β-内啡肽水平降低，这表明在肌筋膜疼痛综合征大鼠中疼痛状态的产生可能与β-内啡肽水平的变化有关。经过4周的滞动针干预后，肌筋膜疼痛综合征大鼠血清中P物质水平降低，而β-内啡肽水平升高，这一变化的可能原因是：滞动针作用于激痛点，通过调控外周炎症因子的表达抑制外周P物质的释放，促使局部组织分泌与合成较多的β-内啡肽，从而激活外周神经末梢上的μ阿片受体，发挥内源性镇痛作用，减轻肌筋膜疼痛综合征大鼠的机械痛敏反应、降低外周敏化程度，从而达到镇痛的目的。
3.3   滞动针对肌筋膜疼痛综合征大鼠中脑导水管周围灰质中胶质细胞和疼痛介质的影响   肌筋膜疼痛综合征发病机制中的“中枢致敏”假说，最初由MENSE[37]提出，随后研究者相继展开了一系列的研究。中枢致敏主要是脊髓背角神经元结构和功能发生变化以及大脑痛觉调制功能减弱所致。近几年，研究者主要集中于探索脊髓背角神经元的变化，而对于大脑痛觉调制系统如何调控肌筋膜疼痛综合征的相关机制尚不清楚。大脑痛觉调制系统关键中继站是中脑导水管周围灰质。研究表明，电刺激通过抑制脊髓水平的上行伤害性信息传递激活中枢下行抑制通路，有效缓解肌筋膜疼痛综合征的症状，发挥镇痛作用[38]。此外，低强度电刺激激痛点可产生短期效应，并激活中脑导水管周围灰质释放内源性阿片肽，这可以解释为激活下行疼痛抑制通路，抑制痛觉传递，以发挥镇痛作用[8]。由此可见，中脑导水管周围灰质结构和功能的变化与肌筋膜疼痛综合征的发展和维持紧密联系。滞动针对肌筋膜炎、关节疼痛、慢性疼痛等疾病疗效显著，但具体机制尚不明确。此次实验通过探讨滞动针对肌筋膜疼痛综合征的中枢镇痛相关机制，以进一步探讨滞动针改善肌筋膜疼痛综合征中枢致敏的作用靶点。
肌筋膜疼痛综合征疼痛信息的转导依赖于神经递质P物质，而P物质在中枢具有双重作用：一方面在脊髓调制痛觉信息的传递，通过神经激肽1进行整合与调节；另一方面在中枢整合疼痛信息，调节下行易化与抑制作用之间的平衡。研究表明，肌筋膜疼痛触发点模型大鼠脊髓P物质比空白组显著增高，说明肌筋膜疼痛综合征模型大鼠痛觉过敏主要促使脊髓背角P物质的释放进行疼痛转导，并与痛阈呈现负相关[39]。筋膜刀调控肌筋膜疼痛综合征大鼠下丘脑中P物质明显增多，有效激活下行疼痛抑制系统[40]。β-内啡肽作为一种内源性镇痛因子在中枢神经细胞中均有丰富表达，如在中脑导水管周围灰质、延髓头端腹内侧区以及脊髓背角自上而下的伤害性传递在下行调控中起主要作用[13]。伤害性刺激可增加中脑导水管周围灰质腹外侧中β-内啡肽的释放，这与应激诱导的镇痛以及外周损伤有关[41-43]。电针可促使大鼠痛经反应降低，促使中脑导水管周围灰质中的β-内啡肽和脑啡肽含量增多，继而调节大脑痛觉调制系统内的阿片肽物质表达，达到镇痛作用[44]。电针可提高尼古丁依赖痛觉过敏大鼠的机械痛阈，上调脊髓和中脑导水管周围灰质中β-内啡肽的表达，提示电针对长期慢性尼古丁引起的痛觉过敏具有积极的镇痛作用[45]。在偏头痛动物模型中发现，针刺治疗偏头痛的机制是：通过调控脑干中脑导水管周围灰质内源性镇痛系统中β-内啡肽的表达来提高痛阈，以改善偏头痛大鼠的疼痛症状，进而抑制痛觉信息的传递[46]。
此外，针刺远端激痛点可产生镇痛效果，其远端取穴针刺镇痛效应是内源性阿片系统起作用，通过从刺激部位到脊髓的完整传入连接介导，调节血清、脊髓、背根神经节和肌肉中脑啡肽和β-内啡肽表达变化[35]。研究表明，内源性镇痛系统的镇痛效应可能与β-内啡肽密切相关，通过激活阿片受体与之结合，从而抑制疼痛的传递[47]。
肌筋膜疼痛综合征所诱导的中枢致敏中许多疼痛递质和胶质细胞均扮演着重要的角色。其中，c-fos是神经元受伤害性刺激后激活的标志物，也是大脑中炎症产生和维持以及神经元活动的标志物[48]。正常情况下，细胞内c-fos mRNA仅少量表达，参与中枢重要活动的信号转导和调控；当机体受到外界刺激时可被诱导表达，引起其表达的细胞信号通路之一是MEK-丝裂原活化蛋白激酶通路，该通路诱导小胶质细胞激活，进一步激活小胶质细胞中c-fos的表达。研究发现，正常条件下中脑导水管周围灰质中c-fos在其背侧表达较多[49]。另外，抑制小胶质细胞NLRP3衍生的炎症小体也可上调c-fos的表达[50]。
小胶质细胞在中枢致敏中最先被激活，原因在于小胶质细胞对伤害性刺激十分敏感，能够较先对伤害性刺激作出反应。研究表明，外周炎症性疼痛刺激可诱导大鼠中脑导水管周围灰质中小胶质细胞在急性期、亚急性期和慢性期增多[51]。病理状态下，中枢下行中脑导水管周围灰质内中的小胶质细胞最先被激活，参与痛觉过敏的发生。小胶质细胞活化后可转化为M1表型，分泌多种致痛物质(如5-羟色胺、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6)以及神经营养因子(如脑源性神经营养因子、神经生长因子)；也可转化为M2表型，诱导白细胞介素10和β-内啡肽的表达，增强下行抑制并调控脊髓以上水平中枢痛觉信息，发挥镇痛作用。由此可见，脊髓和脑中小胶质细胞参与炎症模型大鼠的大脑痛觉调制系统，促进中枢神经元可塑性的变化，最终导致中枢致敏的发生与维持。脑源性神经营养因子在神经元存活和可塑性中起关键的作用。王列[52]研究发现，针刺可以降低肌筋膜疼痛综合征模型大鼠脊髓背角小胶质细胞的活性，诱导脑源性神经营养因子蛋白水平降低。马俊杰[53]研究发现，艾灸可以明显改善肌筋膜疼痛综合征大鼠挛缩结节、提高热痛阈值，其中枢机制可能与抑制脊髓背角小胶质细胞活化、降低脑源性神经营养因子蛋白表达有关。这些研究说明了肌筋膜疼痛综合征的中枢致敏机制在于：激活脊髓和脑内小胶质细胞的活性，诱导信号分子的表达，调控疼痛信号通路的转导。针刺激痛点切断恶性循环的中枢机制则是通过抑制小胶质细胞活性与神经递质之间的相互调节作用，从而降低中枢致敏程度。
综上所述，肌筋膜疼痛综合征的维持机制主要依赖于中枢致敏程度，其关键在于大脑痛觉调制系统中脑导水管周围灰质内的激活水平，继而影响中脑导水管周围灰质内P物质、β-内啡肽、c-fos、小胶质细胞和脑源性神经营养因子的变化，从而增强疼痛的信号转导。此次实验结果发现，4周的滞动针干预治疗后，肌筋膜疼痛综合征大鼠中脑导水管周围灰质中P物质、β-内啡肽表达较高，机械缩足阈值明显升高。课题组考虑到β-内啡肽的释放可能由小胶质细胞转变为M2表型介导，故此次实验进一步观察发现，肌筋膜降低疼痛综合征大鼠中脑导水管周围灰质小胶质细胞标志物Iba-1阳性表达增多，并且多为M2型，证实了小胶质细胞活化后可诱导β-内啡肽的表达。结合整体研究结果猜测，滞动针干预肌筋膜疼痛综合征大鼠的潜在中枢机制是：由于机械刺激激痛点，通过激活“神经-体液-内分泌系统”增强疼痛信号的转导，继而激活以中脑导水管周围灰质为关键核团的中枢下行镇痛系统，进一步抑制小胶质细胞的活性，上调c-fos阳性表达，下调脑源性神经营养因子蛋白表达，充分增强P物质和β-内啡肽的分泌与合成，激活中枢下行镇痛系统，降低中枢致敏程度，从而提高痛阈，达到镇痛效应。这与滞动针的现代医学理论“中枢整合”高度一致，滞动针通过调整激痛点处肌肉张力及协同模式刺激传入良性的本体感觉，改善外周本体感受神经末梢反馈信息的转导，进一步激活中枢神经系统前馈和反馈机制，激发脑神经网络、回路水平上的信息功能调节[54-55]，实现中枢整合、力学调制的整体多功能调节效果。因此，这也在一定程度上说明了滞动针干预激痛点对肌筋膜疼痛综合征具有远期镇痛效应，可良性降低中枢致敏程度。
3.4   滞动针与激痛点的关系   滞动针疗法是以动静结合理论为指导，运用静态滞针、动态施针的治疗方法，疗效显著，远期效应稳固。滞动针作用于激痛点通过旋转针体改变针下组织结构，引发一系列下游反应，从而增强针感、提高疗效[56]。LANGEVIN等[57]对滞动针的针刺手法进行了更深入研究，发现在针刺过程中旋转针体导致周围的致密皮下结缔组织明显增厚，这种现象的潜在意义在于：针刺过程中对胶原纤维和弹性纤维的牵拉可导致细胞外基质的变形，而这种基质变形可传导到结缔组织内的局部细胞中，引发多种下游效应，包括细胞收缩、基因表达、旁分泌或自分泌因子的分泌，以及传入神经对感觉输入可产生强大持久的调节，这较好地解释了滞动针的远期效应。由此可见，滞动针干预发挥中枢镇痛作用机制是减少炎症反应、提高外周血内啡肽水平及痛阈，进一步调控中枢小胶质细胞的活性和神经递质及神经元的兴奋性，从而激活中枢大脑痛觉调制系统，降低中枢致敏程度，发挥镇痛作用。然而，滞动针是如何引发激痛点大脑中具体下游反应、抑制激痛点所致的中枢致敏，从而缓解疼痛，这将是未来的研究方向。
3.5   结论   滞动针干预“激痛点”可抑制肌筋膜疼痛综合征大鼠血清中P物质的释放并上调β-内啡肽的表达，提高痛阈，从而产生镇痛效果，镇痛效果的中枢途径是通过上调中脑导水管周围灰质中P物质、β-内啡肽表达来实现的。滞动针干预调控肌筋膜疼痛综合征大鼠中脑导水管周围灰质中P物质、β-内啡肽的表达，机制可能是：通过抑制中脑导水管周围灰质小胶质细胞的活性、下调脑源性神经营养因子蛋白表达间接促进小胶质细胞向M2表型极化释放β-内啡肽、增加c-fos神经元兴奋性，从而降低中枢致敏程度，有效缓解肌筋膜疼痛综合征。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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滞动针干预肌筋膜疼痛综合征大鼠，可以有效松解肌筋膜内挛缩结节，降低紧绷带，并提高机械痛阈，从而有效缓解疼痛，这为滞动针作为一种治疗手段的有效性提供实验室依据。滞动针治疗后，发现肌筋膜疼痛综合征大鼠中脑导水管周围灰质中c-fos免疫反应性显著增加，血清中P物质的表达降低，而β-内啡肽的表达升高，这些结果表明，滞动针治疗可能通过调节中枢神经系统的活性，影响疼痛传导和调控过程，从而达到镇痛的效果。此次实验发现，滞动针治疗组大鼠中脑导水管周围灰质中小胶质细胞标志物Iba-1的活性减少，脑源性神经营养因子蛋白表达水平降低，这些变化可能与中枢致敏程度的降低以及镇痛效果密切相关。#br#

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