银质针导热治疗肌筋膜疼痛综合征大鼠骨骼肌线粒体和SIRT3表达的变化

doi:10.12307/2024.300

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (14): 2202-2208.doi: 10.12307/2024.300

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

银质针导热治疗肌筋膜疼痛综合征大鼠骨骼肌线粒体和SIRT3表达的变化

王玥1，张玉函1，王家益1，黄媛馨2，沃春新2，王彩霞1，周沛然3，王林2

1贵州医科大学，贵州省贵阳市 550004；贵州医科大学附属医院，2疼痛科，3电生理中心，贵州省贵阳市 550004

收稿日期:2023-02-24 接受日期:2023-04-12 出版日期:2024-05-18 发布日期:2023-07-28
通讯作者: 王林，硕士，教授，主任医师，博士生导师，硕士生导师，贵州医科大学附属医院疼痛科，贵州省贵阳市 550004
作者简介:王玥，女，1995年生，贵州省遵义市人，汉族，贵州医科大学在读硕士，主要从事慢性疼痛与治疗研究。张玉函，女，2000年生，贵州省六盘水市人，汉族，贵州医科大学在读本科生。
基金资助:
国家自然科学基金项目(82060811)，项目负责人：王林；贵州省科技计划项目(黔科合基础-ZK［2021］)，项目负责人：黄媛馨；2022年国家级大学生创新创业训练计划项目(202210660129)，项目负责人：张玉函

Effects of silver needle-thermal conduction therapy on skeletal muscle mitochondria and silent information regulator homolog 3 expression in a rat model of myofascial pain syndrome

Wang Yue1, Zhang Yuhan1, Wang Jiayi1, Huang Yuanxin2, Wo Chunxin2, Wang Caixia1, Zhou Peiran3, Wang Lin2

1Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 2Department of Pain, 3Neuroelectrophysiology Center, Union Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China

Received:2023-02-24 Accepted:2023-04-12 Online:2024-05-18 Published:2023-07-28
Contact: Wang Lin, Master, Professor, Chief physician, Doctoral/Master’s supervisor, Department of Pain, Union Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Wang Yue, Master candidate, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China Zhang Yuhan, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82060811 (to WL); Guizhou Provincial Science and Technology Program, No. ZK[2021] (to HYX); 2022 National Student Innovation and Entrepreneurship Training Program Project, No. 202210660129 (to ZYH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

沉默信息调节因子同源蛋白3(Silent information regulator homolog3，SIRT3)：是端粒保护蛋白，Sirtuins家族中的重要成员，SIRT3在整个线粒体Sirtuins中具有最高的脱乙酰酶活性，特异性的定位于线粒体基质中，参与线粒体能量代谢及蛋白乙酰化的调节，与线粒体新陈代谢、细胞免疫和炎症调节、细胞存活和凋亡以及昼夜节律调控等重要生物学特性密切相关，通过对活性氧簇的抑制、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活化来保护线粒体，防止DNA受损和氧化性应激而导致的细胞死亡。在代谢能力强、高耗氧量和高线粒体细胞内表达增高；对缓解慢性疼痛有一定作用。
Sirtuins：Sirtuins家族包含7个成员(SIRT1-SIRT7)，是第Ⅲ类NAD+依赖性脱乙酰化酶，控制着哺乳动物的多种细胞功能和机体特性，包括线粒体代谢、细胞减数分裂、炎症、自噬、凋亡等。可被NAD+、NADH、烟酰胺等细胞中的代谢辅因子或中间产物活化或抑制，并通过对包括组蛋白或转录因子在内的底物蛋白翻译后修饰，调节一系列细胞功能，参与细胞代谢以及在应激下细胞存活与死亡的平衡调节，有研究发现其抗炎作用可能有助于延长寿命。

背景：临床研究发现银质针导热治疗对肌筋膜疼痛综合征患者具有良好镇痛作用，但其具体机制仍不清楚。

目的：观察银质针导热治疗对肌筋膜疼痛综合征大鼠线粒体超微结构和沉默信息调节因子同源蛋白3变化的影响。
方法：26只大鼠随机取20只予以打击结合运动疲劳的方法复制肌筋膜疼痛综合征大鼠模型，造模成功的16只大鼠随机分为模型组和银质针导热组，每组各8只；银质针导热组给予银质针导热处理；剩余6只为正常对照。分别于造模前1 d、造模完成后第1天、银质针导热处理后第14天检测大鼠机械刺激缩足阈值、热缩足潜伏期；银质针导热处理后第14天检测大鼠股内侧肌肌电图电活动，取大鼠右侧股内侧肌分别进行苏木精-伊红染色观察局部形态、透射电镜观察线粒体超微结构、Western blot检测沉默信息调节因子同源蛋白3表达。

结果与结论：①痛阈值：与正常组和造模前相比，模型组、银质针导热组造模后机械刺激缩足阈值和热缩足潜伏期显著缩短(P < 0.01)；经银质针导热处理后，与模型组相比，银质针导热组机械刺激缩足阈值和热缩足潜伏期显著延长(P < 0.01)；②肌电图：模型组大鼠右侧股内侧出现自发电活动，银质针导热组自发电活动较模型组减少，时限较模型组延长(P < 0.01)，波幅较模型组降低(P < 0.05)；③苏木精-伊红染色：正常组大鼠肌纤维排列紧密规则，模型组大鼠肌纤维萎缩、变性，排列紊乱，银质针导热组大鼠肌肉结构紊乱改善；④骨骼肌线粒体微观结构：透射电镜显示正常组肌组织线粒体结构正常；模型组肌组织线粒体肿胀，嵴断裂或消失；银质针导热组肌组织线粒体肿胀明显缓解或趋于正常；⑤沉默信息调节因子同源蛋白3表达：模型组较正常组明显下调，银质针导热组较模型组明显上调(P < 0.05)；⑥结果表明：肌筋膜疼痛综合征大鼠局部肌肉线粒体出现异常，沉默信息调节因子同源蛋白3的表达下调，提示存在能量代谢障碍；银质针导热处理后线粒体变化恢复，接近正常，且沉默信息调节因子同源蛋白3的表达上调接近正常组，推测银质针导热疗法可能通过促进线粒体修复而改善能量代谢障碍发挥治疗作用。

https://orcid.org/0000-0003-0017-605X(王玥)；https://orcid.org/0009-0001-6441-7644(张玉函)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 肌筋膜疼痛综合征, 银质针导热治疗, 肌肉线粒体, SIRT3, 肌筋膜激痛点

Abstract: BACKGROUND: Clinical studies have found good analgesic effects of silver needle-thermal conduction therapy in patients with myofascial pain syndrome, but the exact mechanism remains unclear.
OBJECTIVE: To observe the effect of silver needle-thermal conduction therapy on silent information regulator homolog 3 (SIRT3) changes and mitochondrial ultrastructure in a rat model of myofascial pain syndrome.
METHODS: Twenty rats were randomly selected from 26 Sprague-Dawley rats and were subjected to percussion combined with motor fatigue for replicating the rat model of myofascial pain syndrome. Sixteen rats that were successfully modeled were randomly divided into model group and silver needle-thermal conduction therapy group (treatment group), with eight rats in each group. The remaining rats were used as controls (normal group). The treatment group was treated with silver needle-thermal conduction therapy. Mechanical withdrawal threshold and thermal withdrawal latency of rats were measured at 1 day before modeling, 1 day after modeling and 14 days after treatment. Electromyographic activities of the right medial femoral muscle were measured at 14 days after treatment. The right medial femoral muscle tissue was taken for hematoxylin-eosin staining to observe the local morphology and for transmission electron microscopy to observe the mitochondrial ultrastructure. Western blot assay was performed to detect SIRT3 expression.
RESULTS AND CONCLUSION: Pain threshold: The mechanical withdrawal threshold and thermal withdrawal latency of the model and treatment groups were significantly decreased compared with those in the normal group and before modeling (P < 0.01). After treatment, the mechanical withdrawal threshold and thermal withdrawal latency of rats were significantly higher in the treatment group compared with the model group (P < 0.01). Electromyography: The rats in the model group showed spontaneous electrical activity in the right medial femur, while the rats in the treatment group showed reduced spontaneous electrical activity, longer time frame (P < 0.01) and lower wave amplitude (P < 0.05) compared with the model group. Hematoxylin-eosin staining: In the normal group, rat muscle fibers arranged closely and regularly. In the model group, the muscle fibers of rats were atrophied, degenerated, and disordered in arrangement. In the treatment group, rat muscle structure disorder improved. Mitochondrial microstructure: Under the transmission electron microscope, mitochondrial structure in the normal group was normal; mitochondrial swelling with broken or disappeared cristae appeared in the model group; mitochondrial swelling in the treatment group was obviously relieved or tended to be normal. SIRT3 expression: SIRT3 expression was significantly downregulated in the model group compared with the normal group, but was significantly upregulated in the treatment group compared with the model group (P < 0.05). To conclude, abnormalities in local muscle mitochondria and downregulation of SIRT3 expression suggest the presence of impaired energy metabolism in the rat model of myofascial pain syndrome. Mitochondrial changes recover and are close to normal after the silver needle-thermal conduction therapy, and the expression of SIRT3 is also upregulated close to the normal group, indicating the silver needle-thermal conduction therapy may play a therapeutic role by promoting mitochondrial repair and improving energy metabolism disorder.

Key words: myofascial pain syndrome, silver needle-thermal conduction therapy, muscle mitochondria, SIRT3, myofascial trigger point

中图分类号:

王玥, 张玉函, 王家益, 黄媛馨, 沃春新, 王彩霞, 周沛然, 王林. 银质针导热治疗肌筋膜疼痛综合征大鼠骨骼肌线粒体和SIRT3表达的变化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(14): 2202-2208.

Wang Yue, Zhang Yuhan, Wang Jiayi, Huang Yuanxin, Wo Chunxin, Wang Caixia, Zhou Peiran, Wang Lin. Effects of silver needle-thermal conduction therapy on skeletal muscle mitochondria and silent information regulator homolog 3 expression in a rat model of myofascial pain syndrome[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(14): 2202-2208.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析实验选用26只SD大鼠中，因麻醉、击打、斗殴致死4只，造模恢复期完成后用于验证造模成功4只，最终进入结果分析18只。
2.2 大鼠痛阈值见表1。

2.2.1 组内比较正常组机械刺激缩足阈值和热缩足潜伏期在T0、T1和T2时无明显变化。模型组在T1、T2时机械刺激缩足阈值和热缩足潜伏期较T0时明显缩短(P < 0.01)，T1、T2时比较无明显变化。银质针导热组T1时机械刺激缩足阈值和热缩足潜伏期较T0时明显缩短(P < 0.01)，T2时机械刺激缩足阈值和热缩足潜伏期较T1时明显延长(P < 0.05)。
2.2.2 组间比较 T0时各组大鼠的平均机械刺激缩足阈值和热缩足潜伏期差异均无显著性意义(P > 0.05)；T1时模型组、银质针导热组机械刺激缩足阈值和热缩足潜伏期较正常组缩短(P < 0.01)，模型组、银质针导热组间无明显差异(P > 0.05)；T2(银质针导热治疗后第14天)时银质针导热组机械刺激缩足阈值和热缩足潜伏期较模型组延长(P < 0.01)。
2.3 肌电图分析当肌电图电极插入紧张带时，在模型组大鼠中观察到局部抽搐反应和自发电位，这表明在右侧股内侧肌损伤的部位存在肌筋膜激痛点；在正常组大鼠中没有发现局部抽搐反应和自发电位；在银质针导热治疗组大鼠中自发电位较模型组明显减少，见图1。随后记录静息状态下探测过程中出现的异常电位的时限和波幅，结果表明，银质针导热组时限较模型组延长(P < 0.01)。银质针导热组波幅较模型组降低(P < 0.05)，见表2。

2.4 苏木精-伊红染色法观察肌肉形态股内侧肌横截面苏木精-伊红染色显示正常组大鼠肌细胞为较规则的圆形或多边形结构，大小均匀，排列紧密且规则。模型组大鼠肌纤维萎缩、变性，可见大小不等的椭圆形、圆形肌细胞，细胞间隙不规则增宽，并出现部分核内移现象；银质针导热组大鼠肌肉结构紊乱改善，可见肌细胞形态接近正常，见图2。

2.5 透射电镜观察肌肉线粒体透射电镜显示正常组大鼠肌组织线粒体呈椭圆形，结构正常；模型组大鼠肌组织线粒体肿胀，嵴断裂或消失，板层减少，伴有局部灶性溶解，呈空泡样改变；银质针导热组大鼠肌组织线粒体肿胀明显缓解或趋于正常，板层体明显增多，见图3。

2.6 大鼠肌肉组织中SIRT3的表达模型组骨骼肌内SIRT3表达较正常组明显下调(P < 0.05)，银质针导热组骨骼肌内SIRT3表达较模型组明显上调(P < 0.05)，银质针导热组与正常组比较，SIRT3表达差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4。

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引言

肌筋膜疼痛综合征是一种影响每个年龄段的区域性疼痛疾病[1]，85%的疼痛门诊患者都与肌筋膜疼痛激痛点相关，95%的慢性疼痛与此关联[2]。此病症会导致感觉系统、运动系统及自主神经系统出现相应的症状[3]，这些自主神经障碍症状包括出汗异常、头晕、视力模糊、耳鸣、麻木、刺痛等，此外还可能存在工作耐受性降低、肌肉疲劳、虚弱和其他功能性疾病，甚至出现肌肉无力、情绪受损和生活质量下降[4]。由于对肌筋膜疼痛综合征认识不足，临床上无统一的诊断标准，发病机制也尚不完全清楚，导致肌筋膜疼痛综合征患者易被漏诊而发展为顽固慢性疼痛。由Simons和Travell在1981年首先提出的“能量代谢危机学说”仍是目前肌筋膜疼痛综合征的主流学说[5]，此学说指出肌筋膜疼痛综合征患者会出现ATP减少的能量代谢危机，而线粒体是机体内产生ATP、提供能量的主要场所，肌筋膜疼痛综合征发生时线粒体会出现什么变化？对调控线粒体能量代谢和细胞器稳态的沉默信息调节因子同源蛋白3(silent information regulator homolog3，SIRT3)有何影响尚不清楚，目前未见相关报道。
由于诱发肌筋膜疼痛综合征的致病机制仍有争议，导致针对这部分患者的治疗效果不佳。临床研究证实银质针导热治疗对于肌筋膜疼痛综合征患者具有良好疗效[6-7]，课题组前期的研究也发现银质针导热治疗对肌筋膜疼痛综合征大鼠有良好的远期疗效[8]，比较银质针导热疗法后1，7，14 d痛阈值和苏木精-伊红染色病理结果，发现银质针导热疗法后热缩足潜伏期随时间而呈延长趋势，肌纤维形态恢复随时间而趋于正常规则，银质针导热疗法第14天，大鼠痛阈值较前明显延长，肌纤维形态较规则；但其具体机制尚不完全清楚。因此课题拟通过观察银质针导热疗法14 d后对肌筋膜疼痛综合征大鼠骨骼肌线粒体变化及局部SIRT3表达变化的影响，进一步探索银质针导热疗法的可能机制，为银质针导热疗法的推广应用提供依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计采用随机对照动物实验，多组对比使用单因方差分析，组内两两对比使用Tukey或Games-Howell多重比较试验。
1.2 时间及地点实验于2021年4月到2022年12月在贵州医科大学药学院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物选择SPF健康成年雄性SD大鼠共26只，体质量为200-250 g，所有大鼠都由贵州医科大学动物实验中心提供，许可证号：SYXK(黔)：2018-0001。大鼠饲养于50%相对湿度、恒温(22.0±0.5) ℃、昼夜循环光照12 h(照明时间为早晨7：00至晚上7：00)通风良好的清洁级动物房中，供应充足的词料和水，勤换垫料。
实验方法、技术已经获得贵州医科大学实验动物伦理委员会批准(批准号：2101477)。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 主要试剂与仪器 RIPA裂解液、BCA蛋白浓度检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；GAPDH抗体(60004-1-Ig)、SIRT3抗体(10099-1-AP)、山羊抗鼠IgG(SA00001-1)(中国，Proteintech)；戊巴比妥钠(国药集团化学试剂有限公司)；2.5%戊二醛、1%四氧化锇、10%明胶、苏木精-伊红染色液、二甲苯(Solarbio，北京，中国)；自制打击器(由贵州医科大学疼痛教研室提供)；W132812四通道大鼠跑台(北京东西仪科技有限公司)；SN:ME098肌电图仪(上海海神医疗电子有限公司)；Electric Von Frey电子测痛仪(美国，IITC Life Science Inc)；PL-200型热刺痛仪(成都泰盟软件有限公司)；YRX160256银质针导热巡检仪(上海曙新科技开发有限公司)；透射电子显微镜(Talos F200X S/TEM，Thermo Fisher Scientific，Czech Republic)。
1.4 实验方法
1.4.1 分组及实验流程随机从26只实验大鼠中抽取6只大鼠设置为正常组，不作干预。其余20只大鼠基于打击和运动疲劳建立慢性肌肉筋膜疼痛综合征模型，剔除造模期间因麻醉、击打、斗殴致死及不配合大鼠共4只，造模成功后随机选取8只作为模型组，余下8只进行银质针导热处理。银质针导热处理结束后第14天处死所有大鼠。
1.4.2 慢性肌筋膜疼痛综合征大鼠模型的建立采用黄强民肌筋膜疼痛综合征大鼠模型的制作方法复制模型[9-11]，该模型的建立过程分为干预期8周和恢复期4周。造模前3 d，将大鼠在跑步机上进行适应性运动。在干预期，每周的第1天用1%戊巴比妥钠溶液3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，待麻醉见效后，再把老鼠固定在打击器的下方，将击打器上的木棍从20 cm的高度、以2.352 J的动能落在右侧股内侧肌上；第2，3天，在-16°的电动跑台上进行速度为16 m/min的下坡跑，连续90 min，并通过声和电驱赶老鼠以保证效果；其余4 d休息。每周干预1次，共干预了8周。在恢复期中对大鼠正常喂养并观察4周。恢复期结束第2天从造模后的大鼠随机选取4只大鼠触摸其股内侧肌是否有质硬膨大结节或紧张带，并取材进行苏木精-伊红染色检测，以验证造模成功。

1.4.3 银质针导热治疗在造模恢复期完成后第1天，用1%戊巴比妥钠溶液3 mL/kg对银质针导热组的大鼠予以腹腔麻醉。首先由有丰富触诊经验的临床医师触诊到大鼠右侧股内侧肌内的肌紧张带或质硬膨大结节，这个区域被标记为银针导热的治疗区域。局部消毒后，在大鼠右侧股内侧肌肌紧张带处刺入银质针(针长10 cm，直径0.5 mm)，针尖触及股骨表面。使用银质针导热巡检仪对针头进行加热(温度设定为110 ℃，测温仪测得皮肤进针点的最高温度为43 ℃，加热时间为15 min)。拔针后予碘伏消毒，无菌包扎，再放回各自饲养笼进行正常喂养。

1.4.4 痛阈值测定于造模前1天(T0)、造模完成后第1天(T1)和银质针导热治疗后第14天(T2)检测痛阈值。
(1)机械刺激缩足阈值：将大鼠置入底部为铁丝网格的透明测试箱中，先于箱内适应15-30 min，当大鼠舔毛和探索行为完全停止后，用Electric Von Frey电子测痛仪的压力探针穿过网格刺激大鼠右后爪足底中心部位，慢慢向上用力，当大鼠出现除奔跑、跳跃以外的明显缩足后，立刻移动探针，此时以传感器自动记录的刺激强度(g)作为机械刺激缩足阈值，每个部位反复测量5次，每次间歇5 min，取差距最小的3次数值的均值作为该大鼠的机械刺激缩足阈值。
(2)热缩足潜伏期：使用PL-200 热刺痛仪，使大鼠于仪器玻璃板上适应15-30 min，将热刺激的照射强度设置为50%，将强光的自动切断时限设置为20 s，以防足部组织灼伤。热辐射光源照射大鼠的右后爪足底中央区域，测试仪自动记录从照射至发生缩足反应的时间(s)为热缩足潜伏期，连续检测3次，每次间歇5 min，并以其平均值为该大鼠的热缩足潜伏期。
1.4.5 检测肌电图银质针导热治疗后第14天，检测各组大鼠肌电图。模型组大鼠腹腔麻醉后约5 min将处于麻醉状态的大鼠于仰卧位固定，用拇指和食指的指腹轻轻按压右侧股内侧肌，寻找紧张带及质硬膨大结节位置；在肌紧张带内插入一根肌电图仪的探测电极，如引起局部抽搐反应，则暂定此结节位置为可能的激痛点，将参考电极插入到旁开2.0-3.0 mm处。随后检测激痛点所在区域在安静状态下是否出现异常自发电位，若出现则表明激痛点的存在，而肌电针插入肌紧张结节外的任何部位以及正常组大鼠肌肉对照部位均无异常电位发生，证明造模成功；随后记录安静状态下探测过程中出现的异常电位的时限和波幅。最后对病灶区肌肉取材，结合病理切片，若显示有圆形或椭圆形肌细胞的出现，肌纤维结构紊乱，则进一步证明模型复建成功。
1.4.6 组织形态学观察
(1)透射电镜观察骨骼肌线粒体：痛阈检测完成后，将大鼠用1%戊巴比妥钠溶液 10 mL/kg静脉注射麻醉安乐死。切除右侧股内侧肌。将组织分成3份，一份切成1 mm3的小片，用2.5%戊二醛在4 ℃下固定过夜，用PBS冲洗3次，每次15 min。样品在室温下用1%四氧化锇固定2 h，再用PBS冲洗3次，每次15 min。然后用浓度递增的乙醇溶液和丙酮对样品进行脱水。环氧树脂浸泡包埋后，置于烘箱内聚合，用徕卡UC6超薄切片机切片，将切片用3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色。最后，在 110 kV 的条件下，通过透射电子显微镜对样品进行观察和拍照。
(2)苏木精-伊红染色法观察肌肉形态：右侧股骨内侧肌标本的另一部分用于苏木精-伊红染色。将组织在40 g/L多聚甲醛中固定24 h，然后用浓度递增的乙醇脱水及二甲苯透明。石蜡包埋后切成5 μm的切片，在免疫染色之前，将切片在二甲苯中脱蜡，通过浓度递减的乙醇进行再水化，用苏木精-伊红染色液染色，通过浓度递增的乙醇和二甲苯脱水、透明。在光学显微镜下以100倍放大倍数观察肌纤维的形态和排列。
1.4.7 Western blot 测定大鼠肌组织SIRT3表达将取下的3组大鼠右侧股内侧肌组织放置于-80 ℃冰箱，检测时称取并剪碎组织，加入RIPA裂解液匀浆后于冰上裂解30 min，离心，取上清液，采用BCA法蛋白定量，蛋白样品于100 ℃水浴加热30 min变性后，经SDS-PAGE电泳分离，转移至PVDF膜。洗去PVDF膜上转膜液后加入封闭液封闭1 h，洗膜后加入SIRT3一抗(1∶3 000)和GAPDH一抗(1∶50 000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后加入山羊抗鼠-HRP二抗(1∶1 000)，室温孵育60 min，洗膜后进行电化学发光法显影，采集图像，采用Image J软件处理系统分析蛋白条带灰度值，并以内参GAPDH条带灰度值为对照计算SIRT3表达水平。
1.5 主要观察指标各组大鼠肌电图、痛阈值、肌肉病理形态学变化、肌肉线粒体微观结构及SIRT3的蛋白相对表达量。
1.6 统计学分析所有的统计分析都用SPSS 25.0版软件计算与分析，用 Graphpad Prism 9.0 绘制统计图，连续数据用x±s表示，采用Shapiro-Wilk检验和Levene/Welch检验，分别评估连续数据的正态性和方差齐性。肌电图数据用独立样本t检验比较组间数据差异；其余数据用单因素方差分析比较组间数据差异，Tukey或Games-Howell多重比较检验进行两两比较，P < 0.05为差异有显著性意义。该文章的统计学已通过贵州医科大学统计学专家审核。

讨论

肌筋膜疼痛综合征是一种由存在于肌肉或筋膜内的肌筋膜激痛点所导致最常见的引起慢性肌肉疼痛的疾病，是引起腰背痛、颈肩痛等软组织疼痛的常见原因，其疼痛特征是局部疼痛和/或牵涉痛[12-13]。研究发现肌筋膜疼痛影响了高达85%的普通人群[12]。此次研究采用广为接受的黄强民肌筋膜疼痛综合征大鼠模型的制作方法进行肌筋膜疼痛综合征大鼠造模[9-11]，研究中出现模型组大鼠机械刺激缩足阈值和热缩足潜伏期的缩短，击打部位出现了紧张带或质硬膨大结节，肌电图出现了自发电活动，组织病理学可见右侧股内侧肌出现组织结构排列紊乱，肌纤维萎缩、变性，结合这些情况，证实肌筋膜疼痛综合征大鼠模型制备成功。
尽管通过动物模型研究对肌筋膜疼痛综合征的组织病理学特性方面取得了重大进展，但关于肌筋膜疼痛综合征的病因和确切发病机制的认识仍然有限[14]。肌筋膜疼痛综合征的诊断采用主观的临床标准，包括对自述疼痛的测量、排除其他疾病以及对激痛点的临床触诊，暂无广泛接受的客观参考标准，这不利于精确地进行临床诊断、治疗管理和推进高质量科学依据的发展[15]。最近，越来越多的研究表明，肌筋膜激痛点是由慢性超负荷、过度拉伸或受影响肌肉的直接创伤引起的[16]。目前被普遍认可的由Simons和Travell提出的“能量代谢危机学说”指出：肌肉持续地超负荷、过度拉伸或受损促使细胞内钙超载，从而引发了钙超载-肌肉收缩-局部循环障碍-能量代谢危机(ATP减少)-游离钙不能清除-肌肉持续收缩的恶性循环，导致肌筋膜疼痛综合征的发生[5]。而线粒体是骨骼肌内的能量生成单元，是负责通过呼吸和氧化磷酸化产生ATP 、提供能量的主要细胞器。线粒体生物生成持续受到抑制和线粒体功能受损可使ATP的生成维持在相对较低的水平，从而产生持续的能量危机。BRANDÃO等[17]也指出在肌筋膜疼痛综合征的病理过程中，缺乏ATP会导致肌肉挛缩，由此产生的毛细血管受压会导致缺氧环境，并可能损害线粒体功能，从而形成恶性循环。此次研究显示，肌筋膜疼痛综合征模型组大鼠股内侧肌组织肌纤维萎缩、变性，可见大小不等的椭圆形、圆形肌细胞，细胞间隙不规则增宽，并出现部分核内移现象；透射电镜观察发现骨骼肌线粒体肿胀，嵴断裂或消失，板层减少，伴有局部灶性溶解，呈空泡样改变，证实肌筋膜疼痛综合征发生时，骨骼肌线粒体出现损伤。然而线粒体损伤过程中有哪些分子参与了其发生发展尚不清楚。有研究认为肌筋膜疼痛综合征大鼠的线粒体生物合成被持续抑制，刺激或增强线粒体的生物合成可能为未来治疗肌筋膜疼痛综合征提供一个新的策略[18]；但肌筋膜疼痛综合征中，线粒体通过什么途径导致其功能受损和生物合成受抑制，目前未见相关报道。
SIRT3是Sirtuins家族中的重要成员，SIRT3在整个线粒体Sirtuins家族中具有最高的脱乙酰酶活性，特异性的定位于线粒体基质中，其去乙酰化酶活性主要取决于烟酰胺腺嘌呤核苷酸(NAD+)[19]，参与线粒体能量代谢及蛋白乙酰化的调节，与线粒体新陈代谢、细胞免疫和炎症调节、细胞存活和凋亡以及昼夜节律调控等重要生物学特性密切相关，通过对活性氧簇的抑制、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活化来保护线粒体。既往多项研究发现，SIRT3通过其去乙酰化作用，能够调控线粒体中多种代谢酶的活性，进而调控细胞线粒体的代谢和功能，如活性氧的产生和清除、电子运输链(ETC)通量、线粒体膜电位维持和线粒体动力学，从而在调节和维持体内ATP水平方面起着重要作用[20]。SIRT3调节三羧酸(TCA)循环中的乙酰辅酶的能量代谢，乙酰-CoA合成酶2是三羧酸循环的发生器，是第一个被确认的SIRT3的底物蛋白，SIRT3通过去乙酰化赖氨酸直接调节此代谢酶[21-22]。三羧酸的中间物异柠檬酸脱氢酶 2(IDH2)和琥珀酸脱氢酶(SDH)也被发现被SIRT3去乙酰化而激活[23]。SIRT3缺失的动物表现出线粒体电子传递链复合体Ⅰ活性和基础ATP水平下降，而SIRT3的增加则恢复了复合体Ⅰ的活性和ATP水平。复合体Ⅰ的一个附属亚单位，NDUFA9，被确定为受SIRT3去乙酰化的调节，SIRT3的增强可以减少复合体Ⅰ缺陷患者细胞内的活性氧水平，增加体内ATP的生成[24-26]。SIRT3在代谢能力强、高耗氧量和高线粒体细胞内表达增高，如心脏、骨骼肌等[20]。有研究发现SIRT3缺失小鼠的心肌表现出基础ATP含量较野生型大鼠减少50%以上[24]。已知SIRT3参与调节线粒体蛋白的乙酰化情况，而蛋白乙酰化也是线粒体动力学中最关键的修饰调控因素，所以SIRT3可能直接影响肌肉的代谢和应激反应[27-28]。有研究中发现肌筋膜疼痛综合征大鼠的SIRT3在调节骨骼肌线粒体氧化应激和生物生成方面起作用[18]。此次研究发现肌筋膜疼痛综合征大鼠股内侧肌的SIRT3表达比正常组显著下调，提示局部肌肉线粒体能量代谢功能受到削弱，可能是肌筋膜疼痛综合征能量代谢危机的环节之一。
目前临床治疗肌筋膜疼痛的方法多种多样，但是远期疗效不佳，且长期的药物治疗所造成的后遗症较多[29]，临床研究表明银质针在缓解腰背部肌筋膜疼痛综合征的疼痛中效果显著[30-31]。银质针导热疗法是现代针刺疗法中常用于治疗肌筋膜疼痛综合征的一个独特分支，目前较为普遍认可的银质针导热疗法由王福根教授在宣蜇人教授密集型银质针疗法基础上改进而来[32]。银质针导热疗法在治疗肌筋膜疼痛综合征等引起的疼痛时，疗效较佳，尤以长期疗效显著[6]。WANG等[33]发现银质针导热疗法治疗肌筋膜疼痛综合征的治疗效果优于单纯应用银质针治疗。在临床中发现银质针导热治疗肌筋膜疼痛综合征有良好疗效，但目前相关的动物研究极少，于是此次研究进行了肌筋膜疼痛综合征大鼠模型复制，旨在探讨其产生良好治疗效果的生物机制，为银质针导热治疗肌筋膜疼痛综合征奠定生物学依据。李丽辉等[34]通过向肌筋膜疼痛综合征大鼠局部肌肉注射引起原发性痛，经测量血清前列腺素F2ɑ观察到，前列腺素F2ɑ能使肌筋膜疼痛综合征大鼠局部肌肉电活动波幅明显升高。此次研究中使用银质针针刺肌筋膜疼痛综合征大鼠病变肌组织并对银质针加以导热进行治疗，发现治疗后肌筋膜疼痛综合征大鼠痛阈值延长、肌电图中自发电活动减少，电位波幅降低，苏木精-伊红染色病理切片可见大鼠右侧股内侧肌肌组织结构紊乱改善，证实银质针导热疗法可以促进肌筋膜疼痛综合征大鼠受损肌组织修复以及产生镇痛作用；同时发现经银质针导热治疗后，骨骼肌线粒体肿胀程度显著减轻，板层体明显增多，结构恢复接近正常，肌内SIRT3表达较模型组显著上调并恢复至正常水平，推测银质针导热疗法可能通过促进骨骼肌线粒体修复，改善能量代谢障碍发挥治疗作用。然而此次研究仅观察了银质针导热疗法对肌筋膜疼痛综合征大鼠线粒体结构及SIRT3的影响，尚未对线粒体能量代谢行进一步的研究，且样本量不大，相关机制有待今后进一步证实。
综上所述，肌筋膜疼痛综合征激痛点的产生可能与骨骼肌线粒体受损及SIRT3表达下调有关，而银质针导热治疗可能通过促进SIRT3表达上调，从而修复受损的骨骼肌线粒体，提高大鼠痛阈值而起到镇痛作用，这为银质针导热治疗肌筋膜疼痛综合征提供了理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

银质针导热治疗肌筋膜疼痛综合征大鼠骨骼肌线粒体和SIRT3表达的变化

Effects of silver needle-thermal conduction therapy on skeletal muscle mitochondria and silent information regulator homolog 3 expression in a rat model of myofascial pain syndrome

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