基于TMT技术的激素性股骨头坏死硬化带修复模式探索及临床验证

doi:10.12307/2024.301

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (14): 2191-2196.doi: 10.12307/2024.301

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基于TMT技术的激素性股骨头坏死硬化带修复模式探索及临床验证

庄至坤1，何敏聪2，3，林天烨2，3，吴荣凯1，郭金花1，吴昭克1，魏秋实2，3

1泉州市正骨医院关节科，福建省泉州市 362000；2广东省中医骨伤研究院，广东省广州市 510000；3广州中医药大学第三附属医院关节科，广东省广州市 510000

收稿日期:2023-02-22 接受日期:2023-04-14 出版日期:2024-05-18 发布日期:2023-07-28
通讯作者: 魏秋实，博士，副主任医师，博士生导师，广东省中医骨伤研究院，广东省广州市 510000；广州中医药大学第三附属医院关节科，广东省广州市 510000 吴昭克，主任医师，硕士生导师，泉州市正骨医院关节科，福建省泉州市 362000
作者简介:庄至坤，男，1982年生，汉族，福建省泉州市人，副主任医师，主要从事骨关节疾病的基础与临床研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(82274544)，项目负责人：魏秋实；泉州市科技计划项目(2022NS011)，项目负责人：庄至坤

Exploration and clinical validation of the repair mode of the sclerotic zone of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head based on Tandem Mass Tags technology

Zhuang Zhikun1, He Mincong2, 3, Lin Tianye2, 3, Wu Rongkai1, Guo Jinhua1, Wu Zhaoke1, Wei Qiushi2, 3

1Department of Joint Diseases, Quanzhou Orthopedic-Traumatological Hospital, Quanzhou 362000, Fujian Province, China; 2Guangdong Research Institute for Orthopedics & Traumatology of Chinese Medicine, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China; 3Department of Joint Diseases, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China

Received:2023-02-22 Accepted:2023-04-14 Online:2024-05-18 Published:2023-07-28
Contact: Wei Qiushi, MD, Associate chief physician, Doctoral supervisor, Guangdong Research Institute for Orthopedics & Traumatology of Chinese Medicine, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China; Department of Joint Diseases, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China Wu Zhaoke, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Joint Diseases, Quanzhou Orthopedic-Traumatological Hospital, Quanzhou 362000, Fujian Province, China
About author:Zhuang Zhikun, Associate chief physician, Department of Joint Diseases, Quanzhou Orthopedic-Traumatological Hospital, Quanzhou 362000, Fujian Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82274544 (to WQS); Quanzhou Science and Technology Program, No. 2022NS011 (to ZZK)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

串联质谱标签(Tandem Mass Tags，TMT)技术：定量蛋白质组学通过对质谱进行化学标记，从而鉴定和定量蛋白质、核酸等生物大分子；相较于以往常用的凝胶与抗体定量等蛋白组学，TMT的灵敏度、通量和可重复性等优势成为了目前蛋白组学研究中的热门方法。
过氧化物酶体增殖物活化受体γ协同刺激因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α，PGC-1α)：作为一种多功能的转录共调节因子，具有信号诱导的特异性，能够灵敏应答于各种环境刺激和营养信号的改变，并通过选择性地结合不同转录因子，协同控制包括葡萄糖稳态、脂质代谢平衡和生物时钟稳态在内的多种生理进程。

背景：股骨头内硬化带是激素性股骨头坏死疾病发展过程中重要的影像学特征并与预后相关。过氧化物酶体增殖物活化受体γ协同刺激因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α，PGC-1α)被证明具有成骨、促血管形成、抗线粒体凋亡等生物活性，与激素性股骨头坏死的骨修复可能存在紧密关联。

目的：筛选激素性股骨头坏死硬化带区与正常区的差异蛋白，筛选出硬化带的关键蛋白，并验证关键蛋白在激素性股骨头坏死股骨头标本中的差异表达；探索激素性股骨头坏死硬化带修复模式。
方法：取激素性股骨头坏死行人工全髋关节置换术取出的股骨头标本，通过串联质谱标签技术筛选硬化带区与正常区的差异表达基因，并进行GO与KEGG信号通路分析，构建关键靶点的蛋白互作网络、筛选关键基因。观察关键蛋白在激素性股骨头坏死硬化带中的表达，通过Western blotting、免疫组化验证关键蛋白在硬化带中的表达。

结果与结论：①通过串联质谱标签定量蛋白质谱检测发现：相比于正常区骨组织，股骨头硬化带骨组织中具有显著差异表达(Log2FC > 1.20、Log2FC < 0.84和 P < 0.05)的蛋白质有609个，其中发生上调的蛋白质290个，发生下调的蛋白质319个；②通过GO与KEGG通路富集分析，发现在前10位的富集通路中，Wnt信号通路与生命周期调控通路与骨修复关系密切；在生命周期调控通道中，PGC-1α是重要的蛋白之一；③与激素性股骨头坏死标本正常区相比，Western blotting验证了PGC-1α、NRF-1在硬化带中低表达，Cleaved Caspase-3在硬化带中高表达；④光镜下免疫组化结果显示，股骨头组织标本中硬化区及正常区的PGC-1α、NRF1及Cleaved Caspase-3阳性染色分布，可以发现骨小梁、成骨细胞和骨髓均有表达存在；硬化带区Cleaved Caspase-3表达更为明显；⑤结论：激素性股骨头坏死硬化带中存在包含Wnt等成骨相关通路活跃、以PGC-1α低表达为特征的氧化凋亡活跃等生物学行为；PGC-1α在激素性股骨头坏死硬化带中低表达可能与氧化凋亡活跃相关。

https://orcid.org/0000-0002-1444-8346(庄至坤)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 串联质谱标签, 激素性股骨头坏死, PGC-1α, 线粒体氧化凋亡, 骨修复

Abstract: BACKGROUND: The sclerotic zone in the femoral head is an important imaging feature in the progression of steroid-induced femoral head necrosis, which is associated with disease prognosis. Peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α (PGC-1α) has been shown to possess biological activities such as osteogenesis, angiogenesis and anti-mitochondrial apoptosis, which may be closely related to bone repair of steroid-induced femoral head necrosis.
OBJECTIVE: To screen for the differential proteins in the sclerotic zone of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head versus the normal zone, to screen for hub proteins in the sclerotic zone, and to verify the differential expression of hub proteins in the femoral head specimens following steroid-induced femoral head necrosis, and to to explore the repair pattern of the sclerotic zone following steroid-induced femoral head necrosis.
METHODS: Femoral head samples were collected from patients with steroid-induced osteonecrosis of the femoral head receiving total hip arthroplasty. The differentially expressed genes in the sclerotic zone and the normal zone were screened by Tandem Mass Tags and analyzed by GO and KEGG signaling pathways to construct a protein-protein interaction network and screen hub genes. In addition, the expression of hub genes in the sclerotic zone was verified by immunohistochemistry and western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: Quantitative protein profiling by Tandem Mass Tags revealed that 609 proteins were significantly differentially expressed (Log2FC > 1.20, Log2FC < 0.84 and P < 0.05) in the sclerotic zone of the femoral head compared with the normal zone, of which 290 proteins were upregulated and 319 proteins were downregulated. The GO and KEGG pathway enrichment analyses revealed that among the top 10 enriched pathways, Wnt signaling pathway and life-cycle regulatory pathway were closely related to bone repair; in the life-cycle regulatory pathway, PGC-1α was one of the important proteins. In addition, western blot results verified the low expression of PGC-1α and NRF1 in the sclerotic zone and high expression of Cleaved Caspase-3 in the sclerotic zone compared with the normal zone of steroid-induced femoral head necrosis specimens. Light microscopic immunohistochemical results showed the distribution of PGC-1α, NRF1 and Cleaved Caspase-3 positive expression in the sclerotic and normal zones in the femoral head tissue specimens, indicating the presence of their expression in bone trabeculae, osteoblasts and bone marrow. In contrast, the brown area of the sclerotic zone of femoral head necrosis stained darker and showed more obvious expression of Cleaved Caspase-3. To conclude, in the sclerotic zone of steroid-induced femoral head necrosis, biological behaviors including activation of osteogenesis-related pathways such as Wnt and oxidative apoptosis characterized by low expression of PGC-1 are observed. Low expression of PGC-1α in the sclerotic zone of steroid-induced femoral head necrosis may be associated with the activation of oxidative apoptosis.

Key words: Tandem Mass Tags, steroid-induced osteonecrosis of the femoral head, peroxisome proliferative activated receptor γ coactivator 1α, mitochondrial oxidative apoptosis, bone repair

中图分类号:

庄至坤, 何敏聪, 林天烨, 吴荣凯, 郭金花, 吴昭克, 魏秋实. 基于TMT技术的激素性股骨头坏死硬化带修复模式探索及临床验证[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(14): 2191-2196.

Zhuang Zhikun, He Mincong, Lin Tianye, Wu Rongkai, Guo Jinhua, Wu Zhaoke, Wei Qiushi. Exploration and clinical validation of the repair mode of the sclerotic zone of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head based on Tandem Mass Tags technology[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(14): 2191-2196.

图/表（结果） 9

2.1 病理学观察结果
2.1.1 标本大体观察可见股骨头内部结构分为坏死区、硬化带区和正常区；均可见软骨下骨分离，骨小梁连续性中断，骨小梁吸收区域有囊变被肉芽组织替代；坏死区为淡黄色致密组织，硬化区为灰白色坚硬组织，硬化带区下方为正常区。坏死区与硬化带区之间有死骨吸收、肉芽组织形成与血管新生的痕迹，坏死区被软骨与硬化区包绕，硬化带区与正常区紧密连接，见图1。

2.1.2 苏木精-伊红染色可见坏死区骨质结构紊乱、骨陷窝空虚、骨小梁结构与连续性破坏；硬化区骨质连续，但不规则，可见骨髓细胞、骨陷窝内填充骨细胞；正常区脱钙后骨质较少，可见骨髓细胞，骨陷窝内填充骨细胞，见图2。

2.2 TMT蛋白质组学分析结果
2.2.1 TMT蛋白质谱差异表达分析相较于正常区骨组织，股骨头硬化带骨组织中具有显著差异表达(Log2FC > 1.20、Log2FC < 0.84和 P < 0.05)的蛋白质有609个，其中发生上调的蛋白质290个，发生下调的蛋白质319个。火山图与热图见图3。

2.2.2 差异蛋白质的GO与KEGG功能富集分析通过对股骨头硬化带区与正常区骨组织差异表达蛋白质进行GO富集，得到GO富集柱状图，见图4。将股骨头硬化带与正常骨组织差异蛋白进行KEGG富集通路分析，找出差异蛋白中有显著性富集的通路，见图5。通过富集通路中，发现硬化带生物活动呈现复杂的多功能、多途径生物过程。在前10位的富集通路中，Wnt信号通路是经典的成骨通路，生命周期调控通路与细胞氧化凋亡息息相关；因此推测在股骨头硬化带的生物途径中成骨表现活跃、氧化凋亡活跃是非常重要的生物学途径。随后，进一步做了Wnt信号通路图与生命周期调控通路图，见图6，7。研究发现，在与氧化凋亡的生命周期调控通道中，PGC-1α作为重要的调控蛋白，发挥着积极的作用。结合文献报道PGC-1α具有成骨、促血管形成、抗线粒体凋亡等生物活性[14]，与激素性股骨头坏死的骨修复可能存在紧密关联；因此决定在激素性股骨头坏死的股骨头标本中进一步验证。

2.3 PGC-1α、NRF-1、Cleaved Caspase-3在激素性股骨头坏死临床样本中的表达与验证结果
2.3.1 Western blotting分析股骨头硬化区与正常区的蛋白免疫印迹条带灰度值结果发现，激素性股骨头坏死硬化带区PGC-1α/NRF-1表达均低于正常骨质区(P < 0.05)，Cleaved Caspase-3表达高于正常骨区(P < 0.05)，见图8。

2.3.2 免疫组化分析组织标本中硬化区及正常区PGC-1α、NRF-1及Cleaved Caspase-3的阳性染色分布可见骨小梁、成骨细胞和骨髓均有表达。相较而言，硬化带区股骨头坏死棕色区域染色较深，Cleaved Caspase-3表达更为明显，见图9。

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引言

材料方法

1.1 设计 TMT技术筛选差异表达基因。计数资料采用χ2检验，组间比较采用独立样本t检验。
1.2 时间及地点试验于2021年3-9月在广州中医药大学完成。
1.3 对象股骨头标本来自于广州中医药大学第三附属医院收治的因激素性股骨头坏死接受人工全髋关节置换手术的患者。该研究经广州中医药大学第三附属医院伦理委员会审批(审批号：AF/SC-08/02.1)。
纳入标准：①临床诊断为激素性股骨头坏死，且国际骨循环学会ARCO分期为Ⅲb期的患者[13]；②行单侧人工全髋关节置换术者；③患者对治疗过程完全知情同意，并签署了知情同意书。
排除标准：①存在心脑血管疾病、神经系统疾病、严重肝肾功能损害者；②存在如感染、肿瘤、全身免疫性疾病等可能影响骨组织分子检测结果的因素者。
1.4 主要仪器与试剂组织切片机(LEICA)；石蜡包埋机(SAKURA)；荧光PCR仪(ABI)；EASY-nLCTM 1200色谱系统、微量紫外光度计、Q ExactiveTM HF-X 质谱仪、Multiskcan FC酶标仪(Thermo Scientific)；低温高速离心机(SCIIOGEX)；MP Fastprep-24匀浆仪(MP Biomedicals)；超声破碎仪(JY92-II)；电子天平(Metler Toled AL104)；电子万能试验机(JZL-D10KN，160602)；TMT® Mass Tagging Kits and Reagents(Thermo Fisher)；Bradford 蛋白定量试剂盒(Bio-Rad)；BCA蛋白定量试剂盒(弗德生物)等。
1.5 方法
1.5.1 病理学观察
(1)大体标本观察：取激素性股骨头坏死患者骨标本的不同区域(坏死区、硬化带区、正常区)骨组织切片进行大体观察，描述其病理结构特点、骨小梁、囊性变、肉芽组织与硬化带情况。
(2)苏木精-伊红染色：取上述骨组织，置于40 g/L多聚甲醛溶液固定24 h，EDTA 微波脱钙，经乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，5 μm厚切片，常规苏木精-伊红染色，光镜下观察股骨头不同区域内骨小梁、骨细胞、髓腔脂肪细胞的变化。
1.5.2 蛋白质组学分析
(1)TMT定量蛋白质分析：分别取股骨头标本硬化带区与正常区骨组织，加入4倍体积蛋白裂解液进行超声裂解，提取总蛋白；使用Bradford蛋白质定量试剂盒并配置BSA标准蛋白液进行蛋白质检；提取120 μg蛋白样品用TMT标记试剂标记，分离馏分、液质检测，最后生成质谱检测原始数据。
(2)蛋白质的质谱数据分析：使用Proteome DiscovererTM Software分析质谱检测出来的原始数据；计算样本量间的差异性(R语言中t. test 函数)，将蛋白质在样品间差异倍数(Fold Change，FC)转化为 Log2。根据 Log2FC > 1.20、Log2FC < 0.84和 P < 0.05筛选差异蛋白，并对股骨头内硬化带与正常区组织选出的差异蛋白进行质取交集，将二者具有显著差异的蛋白质进行表达模式聚类分析。
(3)生物信息学分析：应用R语言(https://www.r-project.org/)软件中clusterProfilerGO.R包及Perl语言对差异蛋白进行基因本体论(gene ontology，GO)功能富集分析，描述其中包括细胞成分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)和生物学过程(biological process，BP)基因产物的功能。并应用clusterProfilerKEGG.R包进行京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析关键差异蛋白涉及的相关代谢通路，同时利用pathview包绘制相应的信号通路图。
1.5.3 关键蛋白在临床样本中的表达与验证
(1)Western blotting检测关键蛋白在临床标本中的表达：股骨头标本硬化带区与正常区分别钳取骨组织，按每1 mg骨组织加3.5 μL裂解液、PMSF、Cocktail蛋白酶抑制剂；研磨、匀浆，冰上裂解30 min后将液体转移至1.5 mL d Ep管中，低温高速12 000 r/min离心30 min；取上清液，按BCA法配制蛋白标准溶液，用酶标仪测吸光度，然后推算出各蛋白浓度，计算蛋白浓度标准化体积；取蛋白样品各100 μg，加入上样缓冲溶液后，100 ℃水浴变性5 min，4 ℃冷却10 min后
SDS-PAGE凝胶电泳，电转移至PVDF膜。应用脱脂奶粉封闭液封闭，37 ℃温箱内孵2 h，取出PVDF膜后分别加入相关抗体37 ℃温箱内孵2 h，取出PVDF膜后分别加入过氧化物酶体增殖物活化受体γ协同刺激因子1α(peroxisome proliferator- activated receptor gamma coactivator 1α，PGC-1α)、NRF-1多克隆抗体(Abcam，1∶1 000)、cleaved caspase 3单克隆抗体(1∶1 000)，兔抗β-actin多克隆抗体(1∶2 000)进行封膜，4 ℃孵育过夜。次日应用TBST缓冲液洗涤3次，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔及抗小鼠二抗(1∶5 000，TBST稀释)，37 ℃温箱孵育1 h；TBST漂洗后予以增强化学发光液于凝胶成像仪中曝光显影；最后，用Image J软件分析各组不同区域目标条带灰度值，同时计算关键蛋白相对于内参蛋白的表达量。
(2)免疫组化检测关键蛋白在临床标本中的表达：取股骨头标本中硬化带与正常区骨组织5 μm厚的石蜡切片，在60 ℃恒温箱中烤30 min；二甲苯中脱蜡；乙醇梯度水化；柠檬酸钠缓冲液(0.01 mol/L)高压修复；冷却完成后PBS洗涤3次，每次5 min；加入体积分数3% H2O2除去内源性过氧化物酶，阻断非特异性抗原结合；加入一抗，4 ℃孵育过夜，用TBST在室温下脱色摇床上漂洗3次，加入生物素化二抗30 min；滴加二氨基联苯胺 (DAB) 溶液显色，苏木精复染；经脱水、干燥后封固，在光学显微镜下检测关键蛋白的表达。
1.6 主要观察指标 ①股骨头病理学观察；②股骨头硬化带区与正常区骨组织TMT蛋白质学分析结果；③PGC-1α、NRF-1、Cleaved Caspase-3在激素性股骨头坏死临床样本中的表达与验证结果。
1.7 统计学分析采用 SPSS 21.0 统计软件进行分析。计量资料数据采用x±s表示，计数资料采用χ2检验，组间比较采用独立样本t检验；P < 0.05为差异有显著性意义。文章的统计学方法已经广州中医药大学统计学专家审核。

讨论

激素性股骨头坏死疾病发生后一般遵循“坏死-修复-塌陷-骨性关节炎”的病理过程[15]，在其发展过程中，硬化带的出现和变化是非常重要的影像学特征。研究表明，硬化带是由于新骨沉积、骨小梁变粗且间隙变小所致，骨矿物质密度增加，为股骨头内骨修复的表现；影像学上表现为X射线片或CT上坏死区与正常区组织交界处不规则斑点状或条带状密度增高影[8]。大体标本硬化带区在CT上表现为高密度硬化带，呈不规则棕褐色带样，包绕坏死骨；镜下表现为沉积增厚的骨小梁[16]。相关研究表明，硬化带与正常骨组织只是表现为形态结构的差异[17]，其修复反应过程中形成的硬化带受到各种细胞因子、力学刺激及修复微环境的影响；一方面可以作为延缓股骨头塌陷的保护因素，另一方面在修复的交接地带形成过厚的硬化带也可能干扰甚至阻碍坏死灶的修复。某种程度上说，硬化带是骨坏死修复的一个重要体现，研究硬化带的生物学特点，有助于进一步认识硬化带的修复模式，为激素性股骨头坏死的治疗提供思路。
既往研究中采用TMT技术对股骨头坏死进行研究的文献报道不多，主要以股骨头坏死血清蛋白质组学为主[18]，较少涉及股骨头标本组织。此次研究通过TMT蛋白质谱技术对激素性股骨头坏死患者的股骨头硬化带区与正常区进行差异蛋白分析，最终筛选出在激素性股骨头坏死的修复过程中具有潜在重要作用的蛋白质与信号通路；通过GO与KEGG富集通路分析，发现硬化带生物活性是多功能、多途径的复杂生物过程。在排名前10的富集通路中，Wnt信号通路具有促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的作用，是转导途径中最经典的成骨通路[19-20]。Wnt通路活跃侧面验证了硬化带具有骨修复的生物活性；同时发现与细胞氧化凋亡息息相关的生命周期调控通道在硬化带中也可能起重要的作用，因此推测在股骨头硬化带的生物途径中除了成骨表现活跃、同时细胞氧化凋亡也十分活跃。
PGC-1α作为一种多功能的转录共调节因子，具有信号诱导的特异性，能够灵敏应答于各种环境刺激和营养信号的改变，并通过选择性地结合不同转录因子，协同控制包括葡萄糖稳态、脂质代谢平衡和生物时钟稳态在内的多种生理进程[21-22]。随着研究的深入，证实PGC-1α在多种细胞系中能强烈诱导ERRα mRNA表达，可有效加强骨髓间充质干细胞的促血管化能力，同时具有促进Wnt/β-catenin 通路上成骨特异靶基因表达的作用[23-24]。PGC-1α作为生命周期调控通道中重要的调控蛋白，可能在激素性股骨头坏死的骨修复中发挥着重要的作用。研究表明，PGC-1α信号通路包括PGC-1α、NRF1和NRF2；其中，NRF-1编码一种蛋白质，具有转录因子与同源二聚性的功能，能激活调节细胞生长的关键代谢基因的表达，参与线粒体DNA的转录和复制；PGC-1α信号通路的生理功能主要表现在线粒体的生物合成，能量代谢以及氧化应激方面[25-26]。PGC-1α过表达可以通过促进线粒体生物合成，抑制活性氧的生成、维护线粒体功能完整从而抑制细胞凋亡[27-28]。
Caspase是细胞凋亡的核心成分，caspase-3作为细胞凋亡途径的共同下游通路，是各种凋亡刺激因子中的关键蛋白酶和直接介导凋亡的效应分亡[29]。此次研究通过TMT测序，并进一步在激素性股骨头坏死标本中通过Western blotting与免疫组化试验研究发现，硬化带中PGC-1α表达明显低于正常骨；NRF-1表达与PGC-1α呈现正相关，说明PGC-1α通道介导的线粒体凋亡在硬化带中表现活跃。同时，试验发现硬化带中Cleaved Caspase-3表达明显高于正常骨，也说明硬化带中凋亡活跃。因此，作者认为硬化带在修复过程中，可能存在着线粒体凋亡活跃的生物学行为。
综上，在这项研究中，发现激素性股骨头坏死硬化带中存在包含Wnt等成骨相关通路活跃、以PGC-1α低表达为特征的氧化凋亡活跃等生物学行为。PGC-1α在激素性股骨头坏死硬化带中低表达可能与氧化凋亡活跃相关。结合既往研究表明，PGC-1α具有成骨、促血管形成、抗线粒体凋亡等生物活性，与激素性股骨头坏死的骨修复可能存在紧密关联[14，30]。
过表达PGC-1α有望通过抗线粒体凋亡、抑制骨细胞凋亡，从而促进骨修复，可能是激素性股骨头坏死修复的重要靶点。此次研究的不足之处：研究标本量较少，仅针对激素性股骨头坏死硬化骨的修复模式进行初步探索，后续需要在大样本组织学、血清学标本中进一步验证。虽然此次研究发现了在硬化带里线粒体凋亡活跃这一生物学行为，但对于具体上游机制尚不明确。结合文献报道研究，推测其可能是激素性股骨头坏死发生与发展过程中局部应力集中产生，也可能是局部死骨吸收释放相关蛋白。以上推测均有待进一步深入研究，该结论尚未在动物实验中进一步验证。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

基于TMT技术的激素性股骨头坏死硬化带修复模式探索及临床验证

Exploration and clinical validation of the repair mode of the sclerotic zone of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head based on Tandem Mass Tags technology

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