发育性颈椎管狭窄人群血清差异蛋白质组学分析

doi:10.12307/2024.823

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (34): 5432-5439.doi: 10.12307/2024.823

• 脊柱组织构建 spinal tissue construction • 上一篇下一篇

发育性颈椎管狭窄人群血清差异蛋白质组学分析

卜献忠1，2，钟远鸣2，卜保献3，李记天1，3，汪利合1，李慧英1，杨汉立2，许伟2

1河南中医药大学第一附属医院，河南省郑州市 450000；2广西中医药大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530023；3河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院)，河南省洛阳市 471002

收稿日期:2023-11-25 接受日期:2024-01-05 出版日期:2024-12-08 发布日期:2024-03-14
通讯作者: 钟远鸣，硕士，主任医师，教授，博士生导师，博士后导师，广西中医药大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530023 李记天，博士，主任医师，博士生导师，博士后导师，河南中医药大学第一附属医院，河南省郑州市 450000；河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院)，河南省洛阳市 471002
作者简介:卜献忠，男，1989年生，河南省开封市人，汉族，2023年广西中医药大学毕业，博士，博士后，主治医师，主要从事脊柱脊髓损伤、脊柱相关疾病的基础与临床研究。卜保献，男，1970年生，河南省开封市人，汉族，郑州大学毕业，博士，主任医师，教授，硕士生导师，主要从事脊柱脊髓疾病的诊治研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81760874，82260942)，项目负责人：钟远鸣；广西中医药重点学科建设项目(GZXK-Z-20-21)，项目负责人：钟远鸣；广西重点研发计划(桂科AB29159018)，项目负责人：钟远鸣，河南省中医药科学研究专项课题(20-21ZY2083)，项目负责人：卜保献；洛阳市2022-2024年度中医重点学科-中西医结合医学(脊柱外科)，项目负责人：卜保献；河南省中医药科学研究专项课题(2023ZXZX1003)，项目认责人：卜献忠

Serum differential proteomic analysis of developmental cervical canal stenosis

Bu Xianzhong1, 2, Zhong Yuanming2, Bu Baoxian3, Li Jitian1, 3, Wang Lihe1, Li Huiying1, Yang Hanli2, Xu Wei2

1First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China; 2First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 3Luoyang Orthopedic Hospital, Luoyang 471002, Henan Province, China

Received:2023-11-25 Accepted:2024-01-05 Online:2024-12-08 Published:2024-03-14
Contact: Zhong Yuanming, Master, Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China Li Jitian, MD, Chief physician, Doctoral supervisor, First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China; Luoyang Orthopedic Hospital, Luoyang 471002, Henan Province, China
About author:Bu Xianzhong, MD, Attending physician, First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China; First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China Bu Baoxian, MD, Chief physician, Professor, Master’s supervisor, Luoyang Orthopedic Hospital, Luoyang 471002, Henan Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, Nos. 81760874 and 82260942 (both to ZYM); Guangxi Key Discipline Construction Project of Traditional Chinese Medicine, No. GZXK-Z-20-21 (to ZYM); Guangxi Key R&D Program Project, No. Guike AB29159018 (to ZYM); Special Project for Scientific Research of Traditional Chinese Medicine in Henan Province, No. 20-21ZY2083 (to BBX); Key Discipline of Traditional Chinese Medicine in Luoyang City from 2022 to 2024 - Integrated Traditional Chinese and Western Medicine (Spinal Surgery) (to BBX); Special Project for Scientific Research of Traditional Chinese Medicine in Henan Province, No. 2023ZXZX1003 (to BXZ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

串联质谱标签蛋白质学技术：定量蛋白质组学是一种运用质谱进行化学标记来鉴定和定量蛋白质、核酸等生物大分子的技术，且相较于其他的凝胶与抗体定量等蛋白组学，串联质谱标签的高灵敏度、通量和可重复性等优势已成为了当前蛋白组学研究中的前沿方法。
发育性颈椎管狭窄：通常是由儿童颈椎后部附着结构的发育不良引起的，其侧位X射线片上表现出短椎弓根和扁平椎板，以及椎板与侧质量线后缘的重叠。

背景：正常健康人与发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)人群之间的血清特异性生物学标志物尚未完全明确。

目的：寻找并鉴定气虚血瘀证发育性颈椎管狭窄的潜在生物学标志物。
方法：分别采集发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)人群血清9例、健康正常人群血清8例，采用同位素相对标记与绝对定量技术串联质谱标签联合液相色谱-串联质谱筛选2组人群血清的差异蛋白及鉴定，使用Western Blot法对肌球蛋白轻链3(MYL3)差异蛋白进行验证。

结果与结论：①串联质谱标签技术：共鉴定出61个差异蛋白(P < 0.05)，其中与健康正常人群组比，补体成分C1q受体、载脂蛋白A4、C-C基序趋化因子配体18等14种差异蛋白明显上调，而肌球蛋白轻链3、线粒体翻译延伸因子、核仁磷酸蛋白1等47种差异蛋白明显下调；②基因富集分析：这些差异蛋白可能参与染色体组织、线粒体膜组织、肌肉系统过程的调节等分子功能；③蛋白相互作用网络分析：健康正常人群与发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)人群之间的共同差异蛋白中补体C1q受体、载脂蛋白A4、C-C基序趋化因子配体18、肌球蛋白轻链3、线粒体翻译延伸因子、核仁磷酸蛋白1等38种位于功能网络节点，且与颈椎骨能量代谢、骨细胞产生、破骨细胞的形成等系统关系密切；④运用Western Blot法对主要差异蛋白肌球蛋白轻链3进行验证：其验证结果与蛋白组学结果相一致；⑤结论：通过绝对定量技术联合液相色谱-串联质谱技术发现健康正常人群与发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)人群之间的血清差异表达蛋白，并初步推测肌球蛋白轻链3可能是发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)人群的特异性血清标志物。

https://orcid.org/0000-0002-2559-6766(卜献忠)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 发育性颈椎管狭窄, 气虚血瘀证, 串联质谱标签, 血清蛋白标志物, 蛋白组学

Abstract: BACKGROUND: Serum-specific biomarkers between normal healthy individuals and populations with developmental cervical canal stenosis (Qi deficiency and blood stasis syndrome) have not been fully defined.
OBJECTIVE: To screen and identify the potential biomarkers of developmental cervical canal stenosis with Qi deficiency and blood stasis.
METHODS: Serum samples were collected from nine patients with developmental cervical canal stenosis with Qi deficiency and blood stasis and eight healthy people. Differentially expressed proteins in serum were screened and identified using isotope relative labeling and absolute quantification combined with liquid chromatography tandem mass spectrometry. Western blot was used to verify some significant differentially expressed proteins.
RESULTS AND CONCLUSION: A total of 61 differentially expressed proteins (P < 0.05) were identified using tandem mass spectrometry techniques. Compared with the healthy normal population group, 14 differentially expressed proteins such as complement component C1q receptor, apolipoprotein A4, and C-C motif chemokine ligand 18 were significantly upregulated, while 47 differentially expressed proteins such as myosin light chain 3, mitochondrial translation elongation factor, and nucleolar phosphoprotein 1 were significantly downregulated. The results of gene ontology enrichment analysis indicated that these differentially expressed proteins might participate in molecular functions such as regulation of chromosomal tissue, mitochondrial membrane tissue, and muscle system processes. Protein-protein interaction network analysis showed that 38 common differential proteins, including complement component C1q receptor, apolipoprotein A4, C-C motif chemokine ligand 18, myosin light chain 3, mitochondrial translation elongation factor, and nucleolar phosphoprotein 1, were located at functional network nodes between healthy normal individuals and those with developmental cervical canal stenosis (Qi deficiency and blood stasis syndrome), and were closely related to the local energy metabolism of the cervical spine, the production of cervical vertebral osteocytes, and the formation of osteoclasts. The main differentially expressed protein myosin light chain 3 was validated using western blot assay, and the validation results were consistent with the proteomic results. To conclude, the preliminary discovery of differentially expressed proteins in serum between healthy normal individuals and those with developmental cervical canal stenosis (Qi deficiency and blood stasis syndrome) through absolute quantitative technology combined with liquid chromatography tandem mass spectrometry technology suggests that myosin light chain 3 may be a specific serum marker for developmental cervical canal stenosis (Qi deficiency and blood stasis syndrome).

Key words: developmental cervical canal stenosis, Qi deficiency and blood stasis syndrome, tandem mass spectrometry, serum protein marker, proteomics

中图分类号:

卜献忠, 钟远鸣, 卜保献, 李记天, 汪利合, 李慧英, 杨汉立, 许伟. 发育性颈椎管狭窄人群血清差异蛋白质组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(34): 5432-5439.

Bu Xianzhong, Zhong Yuanming, Bu Baoxian, Li Jitian, Wang Lihe, Li Huiying, Yang Hanli, Xu Wei. Serum differential proteomic analysis of developmental cervical canal stenosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(34): 5432-5439.

图/表（结果） 6

2.1 一般资料两组病例在性别、年龄方面比较，P > 0.05，其结果均有可比性。
2.2 差异表达蛋白质统计此项研究检测出肽段共19 886个，独有肽段共1 067个，可鉴定蛋白质共1 067个，可量化蛋白质共1 027个。发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)组与正常健康组比较，共筛选出差异蛋白质61个，其中有14个上调，有47个下调( 上下调阈值> 1.3 倍，P < 0. 05)，见图1，表1。

2.3 差异蛋白质的GO功能富集分析 GO 注释中生物进程(biological proce-sses，BP)分析，与正常健康组相比，发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)组的差异表达蛋白主要涉及含核碱的化合物转运、心脏收缩、心肌收缩、核酸转运、横纹肌收缩、核质运输、染色体组织、核运输、线粒体膜组织、单价无机阳离子转运、基因表达调控，表观遗传学、染色体组织的调节、肌肉系统过程的调节、肌肉收缩的调节等生物过程；GO 注释中细胞成分(cellular components，CC)分析，与正常健康组相比，发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)组的差异蛋白主要分布在非膜结合细胞器、细胞内非膜结合细胞器、线粒体内膜蛋白复合物、催化络合物、催化步骤2剪接体、剪接体复合体、细胞器内膜、线粒体内膜等细胞成分。GO 注释中分子功能(molecular function，MF)分析，与正常健康组相比，发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)组的差异表达蛋白分子功能主要涉及有机环状化合物结合、杂环化合物结合、RNA结合、核酸结合、肌肉的结构成分、活性跨膜转运体活性、核苷三磷酸酶活性、焦磷酸酶活性等分子功能，见图2。

2.4 KEGG 通路富集分析通过发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)组与正常健康组的差异表达蛋白富集分析，富集到KEGG 信号通路共20条，主要涉及多种疾病神经变性途径、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化、脊髓小脑共济失调、肥厚型心肌病、糖尿病心肌病、扩张型心肌病、酗酒、cGMP-PKG信号通路、cAMP信号通路、坏死、亨廷顿病、心肌细胞中的肾上腺素能信号、突触囊泡周期、碳水化合物消化和吸收、氧化磷酸化、拼接体、心肌收缩、内分泌和其他因素-调节性钙再吸收等信号通路，见图3。

2.5 差异蛋白质的PPI网络分析通过 PPI 网络可研究发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)组与正常健康组的差异蛋白之间相互关系，并从蛋白互作网络分析发现共同差异蛋白中H4C1、MYL3、MYL2、TPM1、TUFM、H2BC18、H2AC20、NPM1、OLA1等38种位于功能网络节点，这些差异蛋白互作网络涉及到核苷三磷酸酶活性、焦磷酸酶活性、核酸结合、肌肉的结构成分等生物过程，见图4。

2.6 Western Blot验证结果与正常健康组相比，发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)组血清中MYL3蛋白表达量显著下调(P < 0.05)，见图5。

参考文献

[1] HINCK VC, SACHDEV NS. Developmental stenosis of the cervical spinal canal. Brain. 1966;89(1):27-36.
[2] KASAI Y, PAHOLPAK P, WISANUYOTIN T, et al. Incidence and Skeletal Features of Developmental Cervical and Lumbar Spinal Stenosis. Asian Spine J. 2023;17(2):240-246.
[3] ZHANG JT, WANG LF, LIU YJ, et al. Relationship between developmental canal stenosis and surgical results of anterior decompression and fusion in patients with cervical spondylotic myelopathy. BMC Musculoskelet Disord. 2015;16:267.
[4] 张耀,黄开, 沈忆新,等.脊髓型颈椎病患者颈脊髓与椎管匹配关系和脊髓致压因素的动态变化分析[J].中国脊柱脊髓杂志,2021, 31(10):886-894.
[5] 严小明,连福明,林智勤.脊髓型颈椎病与发育性颈椎管狭窄的关系[J].中外医疗,2017,36(21):32-35.
[6] 胡学军,蔡光先,刘柏炎,等.蛋白质组学在中医“证”实质研究中的应用[J].中华中医药杂志,2008,23(2):87-91.
[7] YANG L, HOU A, ZHANG X, et al. TMT-based proteomics analysis to screen potential biomarkers of Achyranthis Bidentatae Radix for osteoporosis in rats. Biomed Chromatogr. 2022;36(4):e5339.
[8] 刘雄,曾平,秦刚,何凯毅,等.系统性红斑狼疮合并激素性股骨头坏死中医证型的血清差异蛋白质组学研究[J].中华中医药学刊, 2018,36(11):2662-2666.
[9] LIU S, KANG Y, ZHANG C, et al. Isobaric Tagging for Relative and Absolute Protein Quantification (iTRAQ)-Based Quantitative Proteomics Analysis of Differentially Expressed Proteins 1 Week After Spinal Cord Injury in a Rat Model. Med Sci Monit. 2020;26:e924266.
[10] NOTANI N, MIYAZAKI M, KANEZAKI S,et al. Comparison of morphology between patients with and without developmental spinal canal stenosis to inform the feasibility of C1 lateral mass screw insertion in the atlas. J Orthop Sci. 2017;22(2):207-212.
[11] 钟远鸣,许伟,李智斐,等.运用脊髓伤方治疗脊髓型颈椎病的临床研究[J].辽宁中医杂志,2018,45(10):2133-2136.
[12] HORNE PH, LAMPE LP, NGUYEN JT, et al. A Novel Radiographic Indicator of Developmental Cervical Stenosis. J Bone Joint Surg Am. 2016;98(14): 1206-1214
[13] 国家中医药管理局.中医病证诊断疗效标准 2012 版(中华人民共和国中医药行业标准)[S].中国医药科技出版社,北京:2012.
[14] 刘瑞莉,吴磊,袁玮,等.MYL3基因在肉牛肌肉生长过程中的功能研究[J].华北农学报,2019,34(2):221-228.
[15] 王顺,吴钢.肌球蛋白调节性轻链磷酸化在心脏疾病中的研究进展[J].心血管病学进展,2016,37(6):629-632.
[16] PARK JW, LEE JH, KIM SW, et al. Muscle differentiation induced up-regulation of calcium-related gene expression in quail myoblasts. Asian-Australas J Anim Sci. 2018;31(9):1507-1515.
[17] WILSON RJ, LYONS SP, KOVES TR, et al. Disruption of STIM1-mediated Ca sensing and energy metabolism in adult skeletal muscle compromises exercise tolerance, proteostasis, and lean mass. Mol Metab. 2022;57:101429.
[18] GARI MA, ALKAFF M, ALSEHLI HS, et al. Identification of novel genetic variations affecting osteoarthritis patients. BMC Med Genet. 2016;17(Suppl 1):68.
[19] 卜献忠,卜保献,许伟,等.急性期神经根型颈椎病患者的血清差异蛋白组学分析[J].中国组织工程研究,2024,28(4):535-541.
[20] QU J, KO CW, TSO P, et al. Apolipoprotein A-IV: A Multifunctional Protein Involved in Protection against Atherosclerosis and Diabetes. Cells. 2019;8(4):319.
[21] GARI MA, ALKAFF M, ALSEHLI HS, et al. Identification of novel genetic variations affecting osteoarthritis patients. BMC Med Genet. 2016; 17(Suppl 1): 68.
[22] OKAMOTO H, CUJEC TP, YAMANAKA H,et al. Molecular aspects of rheumatoid arthritis: role of transcription factors.FEBS J. 2008;275(18): 4463-4470.
[23] PENG R, DONG Y, KANG H, et al. Identification of Genes with Altered Methylation in Osteoclast Differentiation and Its Roles in Osteoporosis. DNA Cell Biol. 2022;41(6):575-589.
[24] CHOI M, PARK S, YI JK, et al. Overexpression of hepatic serum amyloid A1 in mice increases IL-17-producing innate immune cells and decreases bone density. J Biol Chem. 2021;296:100595.
[25] YANG B, LI S, CHEN Z, et al. Amyloid β peptide promotes bone formation by regulating Wnt/β-catenin signaling and the OPG/RANKL/RANK system. FASEB J. 2020;34(3):3583-3593.
[26] SONG J, BAEK IJ, CHUN CH, et al. Dysregulation of the NUDT7-PGAM1 axis is responsible for chondrocyte death during osteoarthritis pathogenesis. Nat Commun. 2018;9(1):3427.
[27] KOTADIYA P, MCMICHAEL BK, LEE BS. High molecular weight tropomyosins regulate osteoclast cytoskeletal morphology. Bone. 2008;43(5):951-960.
[28] YAO B, GAO H, LIU J, et al. Identification of potential therapeutic targets of deer antler extract on bone regulation based on serum proteomic analysis. Mol Biol Rep. 2019;46(5):4861-4872.
[29] SHAO H, GE M, ZHANG J, et al. Osteoclasts differential-related prognostic biomarker for osteosarcoma based on single cell, bulk cell and gene expression datasets. BMC Cancer. 2022;22(1):288.
[30] KOPYLOVA GV, SHCHEPKIN DV, BOROVKOV DI, et al. Effect of Cardiomyopathic Mutations in Tropomyosin on Calcium Regulation of the Actin-Myosin Interaction in Skeletal Muscle. Bull Exp Biol Med. 2016;162(1):42-44.
[31] HE K, GUO X, LIU Y, et al. TUFM downregulation induces epithelial-mesenchymal transition and invasion in lung cancer cells via a mechanism involving AMPK-GSK3βsignaling. Cell Mol Life Sci. 2016; 73(10):2105-2121.
[32] 程韶,舒冰,赵永见,等.氧化应激对骨重建的影响[J].中国骨质疏松杂志,2019,25(10):1478-1482.
[33] 皮闻森,刘家明,黄山虎,等.Aurora-B介导NPM1蛋白磷酸化促进骨肉瘤细胞恶性表型的体外研究[J].天津医药,2019,47(1):5-9+113.
[34] HINCK VC, GORDY PD, STORINO HE. Developmental stenosis of the cervical spinal canal. radiological considerations. Neurology. 1964;14: 864-868.
[35] WANG S, YANG G, ZHU C, et al. Morphological analysis for subaxial cervical pedicle screw insertion in developmental and non-developmental canal stenosis. BMC Musculoskelet Disord. 2019;20(1): 205.
[36] 邵林,潘海涛,王新婷,等. 发育性颈椎椎管狭窄症[J].中国骨伤, 1995,8(5):37-38.
[37] 来佳辉,罗建平,张新胜,等.ACDF治疗单节段脊髓型颈椎病合并发育性颈椎管狭窄临床疗效分析[J].中国脊柱脊髓杂志,2021, 31(7):605-612.
[38] 李缘缘,高碧珍.基于组学技术探讨微观指标在中医证研究中的价值[J]. 中华中医药杂志,2022,37(10):5564-5567.
[39] 王苗苗,王玲,王富强,等. 强直性脊柱炎寒湿痹阻证血清蛋质组学研究 [J]. 中国中医骨伤科杂志,2015,23(12): 9-11.
[40] 卜献忠,卜保献,许伟,等.发育性颈椎管狭窄与脊髓型颈椎病血清差异蛋白组学分析[J].中国组织工程研究,2024,28(11):1704-1711.

引言

发育性颈椎管狭窄(developmental cervical canal stenosis，DCCS)是指因某些因素诱发颈椎椎弓发育过短，椎管矢状径较正常狭窄，属于先天性椎管狭小[1]，在早期或无外伤因素作用下一般没有特殊临床症状。最新文献报道，在大众健康人群中发育性颈椎管狭窄的患病率大约20.1%[2]。有研究表明，在脊髓型颈椎病患者中约41.0% 患有发育性颈椎管狭窄[3]。由于发育性颈椎管狭窄人群的先天椎管狭小，进而增加了颈脊髓组织在动态因素的作用下发生损伤的风险，是脊髓型颈椎病的重要致病因素之一[4]，也是其早期发病阶段[5]。因此，明确发育性颈椎管狭窄的形成机制，对于日后指导其早期诊断及预防颈髓损伤具有重要的现实意义。
蛋白质是执行机体各种功能的最基本单位，其不同的表达变化可及时反映出人体生理或病理情况。蛋白质组学研究具有特异性、整体性、动态性、阶段性等特点，被后世誉为“后基因组学”[6]。随着蛋白质组学研究的不断深入，其在研究骨科疾病的早期诊断、中医证型、分子机制等方面亦取了重大突破，并为揭示不同疾病中医证候的生物学内涵及中医辨证论治提供客观的物质基础[7-9]。串联质谱标签(tandem mass tags，TMT)技术是 Thermo Scientific 公司研发的一种基于体外等重同位素标记的相对与绝对定量技术，也是定量蛋白质组学广泛运用的高通量筛选技术。发育性颈椎管狭窄形成的病因病机较为复杂，诸多研究者也分别从影像学诊断、解剖学特征等方面对其展开了相关研究[2，10]。课题组前期研究筛选出了发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)(DCCS-Q)人群向脊髓型颈椎病(气虚血瘀证)患者转化的差异蛋白质[11]，因发育性颈椎管狭窄可能是脊髓型颈椎病的早期阶段[5]，故认为在发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)形成过程中也存在某种特异性差异蛋白标记物。然而，目前关于气虚血瘀证发育性颈椎管狭窄形成机制及早期分子学诊断的相关研究尚未见文献报道。因此，此次研究拟采用串联质谱标签联合液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS)技术，以发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)患者为研究对象，从蛋白质组学层面上对患者外周血样本中的差异分子进行筛选及鉴定，并运用免疫印迹法(Western Blot)进行验证，以期筛选出发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)人群的特异性血清生物标志物，为确立发育性颈椎管狭窄的中医证型及寻找一种早期分子生物学诊断方法提供新思路。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计回顾性病例研究，采用串联质谱标签联合液相色谱-串联质谱技术进行蛋白组学筛选与分析。
1.2 时间及地点实验于 2019 年1月到 2021年8月在广西中医药大学第一附属医院中心分子生物实验室完成。
1.3 对象收集 2019 年1月到 2021年8月在广西中医药大学第一附属医院脊柱骨伤科门诊或住院确诊为发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)人群，同时在健康体检中心或“治未病”中心收集正常健康人群(没有症候偏颇)。
根据相关诊断标准[12-13]，收集发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)人群9例，其中男4例，女5例，平均年龄为(40±8)岁；在健康体检中心及“治未病”中心收集正常健康人群8例，其中男4例，女4例，平均年龄(41±4)岁。两组在性别与年龄方面均具可比性 (P > 0.05)。该临床研究严格按照《赫尔辛基宣言》和广西中医药大学第一附属医院对研究的相关伦理要求实施(审批时间：2018-01-04)。涉及试验的患病个人及其家属为自愿行为，并均对研究过程全部知情同意，在充分了解研究方案的基础上签署了“知情同意书”。
纳入标准：①年龄20-60岁；②发育性颈椎管狭窄的标准诊断严格参照胥少汀主编的《实用骨科学》标准[12]；③气虚血瘀证中医证型的诊断标准必须严格符合《中医病证诊断疗效标准》标准[13]，即少气懒言、声音低微、呼吸气短、神疲乏力，局部疼痛如针刺，痛点固定不移而拒按，皮下有青紫色肿块，唇甲青紫，肌肤甲错，或有头晕目眩、自汗，活动后诸症加剧；舌质淡嫩，或见瘀斑点，脉虚或细涩；④参与者近期无各种骨关节炎症感染；⑤愿意参与该项研究的对象均签订知情同意书。
排除标准：①合并肝肾疾病、心脑血管、呼吸系统或精神病等患者；②合并血液病、糖尿病、自身免疫性疾病、肿瘤等患者；③患有各类型关节炎的患者；④合并各类型颈椎病者。
1.4 材料
1.4.1 试剂串联质谱标签标记试剂盒(Thermo Fisher Scientific，批号：A44520)、BCA试剂盒(碧云天，批号：P6651)、二硫苏糖醇(Sigma-Aldrich，批号：D0632)、乙晴(Thermo Fisher Scientific，批号：400060)、胰蛋白酶(Trypsin，批号：AD20357)、甲酸(Sigma-Aldrich，批号：F0507)、Albumin bovina血清白蛋白(Solarbio，批号：A8020-500)、兔一抗肌球蛋白轻链(myosin light chain，MYL)3(Affinity，批号：DF4717)、小鼠二抗(Pierce，批号：31430)、化学发光 HRP 底物(Millipore，批号：WBKLS0500)。
1.4.2 仪器全波长酶标仪(BIOTEX公司，型号：EPOCH)、通用电泳仪(美国伯乐公司，型号：PowerPac Universal)、自动化固相萃取仪(北京谷美特公司，ASPEC XL)、高速台式离心机(安亭公司，型号：TGL-16B)、垂直电泳槽(美国伯乐公司，Mnin-Protean Tetra Cell)、液相色普仪(北京普源精电公司，L-3000)、超高效液相色谱仪(Thermo公司，型号NanoLC 1000)、凝胶成像系统(美国伯乐公司，型号：GelDoc XR+)。
1.5 方法
1.5.1 样本的收集及储存试验参与者在早晨(8：00-10：00) 于医院采血中心采集空腹静脉血约5 mL，4 ℃ 静置1.0-1.5 h，3 000×g条件下离心15 min，获取上清液，分装后置于液氮10 min，再转移于-80 ℃冰箱，低温冻存以备用。
1.5.2 血清蛋白提取取出冻存的血清样本及在0 ℃冰中溶解，在4 ℃，18 000×g条件下离心10 min，收集上清液。先抽取10 µL上清液稀释10倍，在从其中抽取5 µL液体，根据BCA试剂盒说明书测定血清样本的蛋白浓度。先抽吸600 µL蛋白原液分2次置入高丰度柱内，在震荡仪上涡旋及混匀2 min。在根据高丰度蛋白去除试剂盒Pierce™ Top 14(Thermo Scientific)说明书进行去除高丰度蛋白处理。
1.5.3 胰酶酶解先从2组样品各抽取600 μL蛋白原液完成酶解，再置入适量的标准蛋白及裂解液将其调配为等体积，然后注入3 μL 1 mol/L DTT液体，使其终浓度为5 mmol/L，最后在56 ℃、30 min恒温水浴箱内完成还原反应。再向上述液体中置入12 μL 11 mol/L IAA液体，在25 ℃暗室条件下孵育15 min完成烷基化。已烷基化的液体在20 ℃，12 000×g条件下，离心15-20 min及在25 ℃室温 8 mol/L 尿素置换3次，buffer置换3次，再将胰蛋白酶(蛋白酶∶蛋白=1∶50)注入置换后的液体中，酶解12 h。在20 ℃，12 000×g条件下，离心10 min，回收肽段。
1.5.4 串联质谱标签标记先将已酶解的肽段经Strata X C18(Phenomenex)进行除盐，真空干燥，再运用0.5 mmol/L buffer溶液溶解上述肽段，按说明书制备TMTpro-12标记溶液(肽段：ACN=300 μg∶10 μL)。然后，抽取10 μLTMTpro-12标记溶液置入25 μg肽段溶液内，将其浓度配制为0.7 μg/μL，在震荡仪上混匀，在室温25 ℃下孵育2 h；将再肽段混合，经除盐、干燥，最终收集完成TMTpro-12标记的样本。
1.5.5 HPLC分级已标记的肽段需进行高pH反相HPLC分级，色谱柱Agilent 300Extend C18参数为：5 μm粒径，4.6 mm 内径，250 mm长；肽段分级梯度为8%-32% ACN pH 9。将250 μg肽段溶液置入330 μL buffer A溶液内(98%纯水+2%ACN)，补足1 mL及混匀，并在室温下18 000×g，离心5 min；然后，将上述1 mL肽段溶液置入高效液相色谱仪内及封闭入口环进行HPLC分级，最终肽段分为9个组。
1.5.6 液相色谱-质谱联用分析先采用液相色谱流动相A水溶液(0.1%NA和2% ACN)溶解已完成分级的肽段，在将上述肽段进行EASY-nLC 1200超高效液相系统分离。液相梯度参数设置为：7%-23% 流动相A水溶液(0.1%NA和90% ACN)，0-36 min；23%-32% B溶液36-52 min；32%-80% B溶液52-56 min；80% B溶液56-60 min，流速参数设置为500 nL/min。上述肽段先经超高效液相系统分离，并在NSI离子源中完成电离，最后Q Exactive™ HF-X质谱完成相关分析。
1.5.7 质谱数据搜库先采用MaxQuant方法分析MS/MS 相关数据，并在SwissProt人类数据库和反向诱饵数据库中完成搜索，再参照伪发现率< 0.01 标准进行数据筛选，从而获取较高高度可信的定性分析结果。
1.5.8 免疫印迹实验验证(Western Blot) 从2组蛋白样本中分别随机选取4个样本进行Western Blot验证。取适量蛋白样品加入4×Sample buffer稀释，再注入适量蛋白裂解缓冲液，将样品质量浓度均调制为2 mg/mL，然后在90 ℃水浴锅内10 min变性。装配电泳设备，依次上样10 µL蛋白溶液，电泳条件设置为80 V恒压30 min，120 V恒压电泳至溴酚蓝出现。转膜条件：电转槽4 ℃200 mA恒流电转1 h。5%脱脂牛奶封闭2 h。先加入一抗体(Anti-MYL3 Rabbit为1∶500，Anti-Albumin Mouse 1∶2 000)4 ℃冰箱中孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10 min。加入二抗(Goat anti-Mouse IgG，(H+L)或Goat anti-Rat IgG，(H+L)1∶10 000)室温孵育1 h。TBST洗膜3次，每次10 min。加入 HRP底物化学发光(HRP 底物1∶5 000)孵育2 min，适当控制曝光时间捕获信号，运用image-pro-plus计算条带的灰度值。
1.6 主要观察指标 ①差异表达蛋白质统计结果；②差异蛋白质的基因本体(Gene Ontology，GO)功能富集分析；③京都基因以及基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome，KEGG)通路富集分析；④差异蛋白质的蛋白质-蛋白质相互作用网络(protein protein interaction network，PPI)网络分析；⑤Western Blot验证结果。
1.7 生物信息学分析和统计学分析采用SPSS 22.0软件对此研究相关数据进行统计分析，计量资料则以x±s表示，两组间两两比较时满足方差齐性时采用 LSD-t 检验，不满足方差齐性时采用 Durmetts-t检验；P < 0.05则差异有显著性意义。差异表达蛋白阈值> 1.3倍则为上调，反之，阈值< 0.83则下调，Wilcoxon 检验(P < 0.05)；采用UniProt GOA数据库进行GO注释、KEGG富集途径分析，并在STRING数据库中构建PPI，其置信分数> 0.7。该文章的统计学方法已经广西中医药大学第一附属医院生物统计学专家审核及确认。

讨论

3.1 研究意义此次研究较早采用串联质谱标签联合液相色谱-串联质谱技术筛选发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)组与正常人群组之间的血清差异表达蛋白，共筛选出61个，其中有14个上调，有47个下调，同时还采用Western Blot技术验证了MYL3差异蛋白，这些差异蛋白极其可能是发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)人群的特异性血清生物标志物。在GO 注释方面，发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)组与正常组的差异蛋白主要涉及了核苷三磷酸酶活性、焦磷酸酶活性、核酸结合、肌肉的结构成分等生物过程，在KEGG通路注释方面气虚血瘀证组与正常组的差异蛋白主要富集到心肌收缩、酒精中毒、心肌细胞中的肾上腺素能信号传导、扩张型心肌病、肥厚型心肌病共5条KEGG 信号/代谢通路。由此揭示了发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)人群的病理机制有可能是通过上述生物过程、信号通路径发挥调控作用的。此次研究首次采用了串联质谱标签联合液相色谱-串联质谱技术，从微观角度进行发育性颈椎管狭窄中医“证”实质的实验研究，将对阐明发育性颈椎管狭窄人群“证”的特异物质基础及中医辨证诊断的客观性标准提供理论依据[6]。
MYL2、MYL3是肌球蛋白轻链家族的成员，被确定为家族性肥厚型心肌病的病因，其结合钙离子能够促进骨骼细胞分化、肌肉生长发育以及调节心脏的收缩与运动[14-15]。研究表明，肌肉分化过程中可诱导成肌细胞钙相关基因表达上调，如肌钙集蛋白、肌钙蛋白C1[16]，同时横纹肌的收缩由ATP提供能量，并受钙离子的调控[15，17]。研究表明，钙离子能够调控骨修复阶段中间充质干细胞、成骨细胞和破骨细胞的增殖分化，促进成骨细胞产生，抑制破骨细胞的形成[18]。前期研究发现，MYL3在急性期神经根型颈椎病患者血清中异常表达，推测其可能与神经根细胞炎症反应、机械压力系统有关[19]。与正常组比，发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)组中MYL2、MYL3表达下调，同时MYL3蛋白组学结果与Western Blot验证结果一致，显示发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)人群的发病过程中MYL2、MYL3可能促进了颈椎周围肌肉细胞的异常分化，同时为颈椎骨组织的异常发育提供了营养供应。基于此，推测MYL2、MYL3可能间接地参与了机体颈椎骨组织能量代谢、骨细胞产生、破骨细胞的形成等病理过程，它们可能是发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)人群的特异性血清生物标志物。
APOA4是一种脂质结合蛋白，主要在小肠中合成，可促进糖脂代谢、抑制血小板聚集和血栓形成，APOA4对白细胞和血小板黏附的抑制作用可能与P-选择素(SELP)的下调有关[20]。在骨关节炎中观察到SELP可刺激损伤部位的白细胞黏附，诱发炎症反应[21]，而炎症刺激可以抑制成骨细胞分化。在类风湿性关节炎中CCL18侵入软骨和骨骼结构，导致受累关节的破坏和功能受损，被认为是类风湿性关节炎病理学中的重要分子[22]。CCL18在破骨细胞分化过程中表达增加，其变化与破骨细胞分化和骨质疏松表型高度相关[23]。与正常健康人组比，发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)组中APOA4、CCL18表达上调，说明APOA4、CCL18能够通过调节机体能量代谢、凝血功能、破骨细胞分化等病理反应，进而参与正常健康人向发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)人群转化的过程，它们可能是气虚血瘀证发育性颈椎管狭窄人群的特异性血清生物标志物，但相关机制需进一步研究。
HNRNPA1属于HNRNP家族，主要定位于细胞核参与RNA转录、外显子剪接、pre-RNA的成熟和降解等核酸代谢的过程，HNRNPA1在核-胞质运输或动态相分离过程中的功能障碍会导致异常的淀粉样蛋白聚集。淀粉样蛋白可通过刺激炎症反应促进股骨远端的成骨细胞分化，抑制破骨细胞分化，降低骨密度，导致骨质流失[24-25]。PGAM1是糖酵解通路中的重要酶，可调控糖酵解通路速率以及机体细胞对糖的消化、吸收及能量合成。NUDT7是维持软骨稳态的调节因子之一，其通过调节PGAM1表达可影响糖酵解途径，在骨关节炎软骨细胞中过表达PGAM1可诱导脂质积累、白细胞介素1表达上调和软骨细胞凋亡，最终促进软骨细胞死亡[26]。此次研究结果发现：与正常组比，发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)组中HNRNPA1、PGAM1表达下调，提示炎症反应参与了发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)人群疾病的形成过程。由此可推测，HNRNPA1、PGAM1可能是发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)人群的特异性蛋白标记物，但相关生物学机制需进一步探讨。
TPM1是原肌球蛋白家族的3种亚型之一，TPM1、TPM2和TPM4及其相互作用的调控因子可通过调节肌动蛋白细胞骨架动力学，在形态发生、细胞增殖、葡萄糖代谢等方面发挥关键作用，这些不同的TPM亚型通过调控破骨细胞活性可控制骨形成和骨重塑[27-28]。破骨细胞分化在骨肉瘤患者预后中的发挥重要作用，TPM1被鉴定为显著的生存预测破骨细胞分化相关基因[29]。TPM1可稳定细丝，促进肌动蛋白与肌凝蛋白的相互作用，其中心区域内的改变被认为会影响细丝的激活，其与肌钙蛋白复合物可调控钙离子的释
放[30]，钙离子能够调控成骨细胞和破骨细胞的增殖分化[18]。与正常组相比，发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)组中TPM1表达明显下调，提示发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)人群中可能存在钙离子应激性反应改变。因此，作者所在的课题组认为TPM1可能是发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)人群的血清标记物。
TUFM是线粒体DNA翻译表达的关键因子，敲低TUFM时可降低线粒体呼吸链活性，增加糖酵解功能和活性氧的产生[31]。有研究表明，活性氧诱导的氧化应激反应可导致骨重建稳态的改变，致死骨吸收增加、抑制骨质矿化和骨形成[32]。NPM1蛋白是核仁磷酸蛋白，主要参与核糖体蛋白组装、染色质重塑以及DNA 转录、复制等生理过程。NPM1失活会影响中心体复制和NPM1稳定性，在胚胎发育中期NPM1突变可导致造血功能缺陷、器官发育缺陷和妊娠中期的胚胎致死[33]。由此认为，TUFM、NPM1可能发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)的特异性血清标记物，但其在该证型中的作用机制仍需进一步研究阐明。
3.2 以往研究的不足及此次研究的局限性 Hinck在1964年首次提出发育性颈椎管狭窄这一概念[34]，发育性颈椎管狭窄通常是由儿童颈椎后部附着结构的发育不良引起的，其侧位X射线片上通常表现出短椎弓根、扁平椎板，以及椎板与侧质量线后缘的重叠[35]，但其具体畸形发育的机制尚不清楚。目前，关于发育性颈椎管狭窄的研究首先集中在影像学诊断方面上，例如：X射线条件下通过Murone 法、比值法、C5的LM/CD比值、目测椎管小关节重叠率、椎板矢状径测量等，CT条件下通过椎管及脊髓矢状径、寰椎正中矢状内径、平均骨性椎管面积等，MRI条件下通过脊髓缓冲空间、脊髓占位率、发育性颈椎管狭窄的三角模型等方法对发育性颈椎管狭窄进行诊断，但这些方法在诊断发育性颈椎管狭窄人群中各有利弊，在某些情况下临床诊断仍存在困难；另外，从影像学阐述发育性颈椎管狭窄与脊髓型颈椎病的相关性[5]。其次，集中在发育性颈椎管狭窄的治疗方面，对早期发育性颈椎管狭窄患者中医学主要采用中医药、理疗按摩等手段可以控制或延缓其退变的发生，但禁用重手法推拿、按摩或牵引，以免压迫脊髓及加重病变[36]，而西医学则主要采用脱水、激素等治疗仅能短期缓解一些症状，对发育性颈椎管狭窄晚期的患者主要采用手术减压或扩大椎管手段治疗[37]。虽然关于发育性颈椎管狭窄在影像学、中西治疗方面均取得了一些成绩，但关于其形成的分子生物学机制尚不清楚，这可能一定程度上影响其治疗效果。沈自尹院士首次提出“微观辨证”这一概念，目前“微观辨证”已被认为是运用现代科学技术研究生物体内的微观指标变化，最终达到运用微观指标认识和辨别“证”的过程[38]。在脊柱相关疾病方面，中医“证”蛋白质组学研究尚处于起步阶段。王苗苗等[39]采用蛋白组学技术成功筛选出强直性脊柱炎湿热痹阻证、寒湿痹阻证的血清差异蛋白质，为进一步研究中医证候实质提供了依据。目前，关于发育性颈椎管狭窄的中医证型尚未有学者明确提出，课题组前期也仅是参照《中医病证诊断疗效标准》标准对其进行简单分型[13]，正确地运用微观指标认识和辨别中医不同“证”的客观差异，以寻找其微观物质变化基础，为丰富发育性颈椎管狭窄中医症候及阐述中医辨证防治理论打下了科学的理论基础。课题组前期研究从蛋白质组学角度，揭示了发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)人群向脊髓型颈椎病(气虚血瘀证)患者转化的可能分子作用机制[40]。然而，当今尚未有相关研究从分子层面揭示发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)人群发生的分子作用机制，更尚未见从蛋白组学角度筛选其人群的特异性血清生物标志物以及揭示其形成的作用机制。
综上所述，此次研究以发育性颈椎管狭窄的中医客观辨证为研究突破点，应用串联质谱标签联合液相色谱-串联质谱蛋白质组学检测技术，初步寻找并鉴定出与发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)人群相关的61种差异表达蛋白，如MYL3、MYL2、TPM1、TUFM、H2BC18、H2AC20、NPM1、OLA1等，这些差异蛋白主要涉及发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)形成过程中相关的颈椎骨组织能量代谢、骨细胞产生、破骨细胞的形成及胚胎发育异常等生物过程，并初步明确MYL3是发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)人群的特异性血清标记物，这将为发育性颈椎管狭窄的中医客观辨证提供参考，并为进一步阐明发育性颈椎管狭窄中医证候的物质基础及及后期精准靶点延缓发育性颈椎管狭窄恶性进展提供了理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

发育性颈椎管狭窄人群血清差异蛋白质组学分析

Serum differential proteomic analysis of developmental cervical canal stenosis

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[1]	庄至坤, 何敏聪, 林天烨, 吴荣凯, 郭金花, 吴昭克, 魏秋实. 基于TMT技术的激素性股骨头坏死硬化带修复模式探索及临床验证[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(14): 2191-2196.
[2]	卜献忠, 卜保献, 许伟, 李智斐, 杨汉立, 王微微, 周劲衍, 钟远鸣. 发育性颈椎管狭窄与脊髓型颈椎病血清差异蛋白组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(11): 1704-1711.
[3]	王梦抒, 张宇, 郑周杭, 陈龙, 尤冬春, 郭伟锋, 胡飞, 陈欢, 刘幸明, 吴荣海, 张寅. 气虚血瘀型腰椎管狭窄症患者增生肥厚与正常黄韧带之间的蛋白质表达差异[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(35): 5589-5595.
[4]	马笃军, 朱厚均, 刘乐诗, 彭力平, 赵静, 廖州伟. 牛膝醇提物诱导兔骨髓间充质干细胞软骨分化的蛋白组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(24): 3795-3802.
[5]	许雯珊, 江萍利, 刘雨露, 丁妍怡, 余燕, 杨敏光, 柳维林, 陈立典. 丹酚酸A对缺血性脑卒中模型大鼠海马区蛋白影响的串联质谱标签蛋白组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(23): 3714-3720.
[6]	单政铭, 陶述春, 胡春梅, 张治元, 丁一楠, 何梦铖, 唐秋莎. 人脐带间充质干细胞来源外泌体的提取、鉴定和蛋白组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(19): 3036-3042.
[7]	李生强, 谢冰颖, 陈娟, 谢丽华, 黄景文, 葛继荣. 绝经后骨质疏松症关联长链非编码RNA uc431+相互作用蛋白质组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1641-1646.
[8]	时刚，张开伟. 骨质疏松症和膝关节骨关节炎共病的蛋白组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(36): 5753-5759.