制备近红外光响应性仿生纳米探针及在乳腺癌光热诊疗中的应用

doi:10.12307/2023.983

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (5): 669-675.doi: 10.12307/2023.983

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制备近红外光响应性仿生纳米探针及在乳腺癌光热诊疗中的应用

李文兰1，王文渊1，任文秀2，张玉佩1，杨小燕1，王志刚3，夏纪筑1

西南医科大学附属医院，1超声医学科，2放射科，四川省泸州市 646000；3超声分子影像重庆市重点实验室，重庆市 400010

收稿日期:2022-11-21 接受日期:2023-01-29 出版日期:2024-02-18 发布日期:2023-08-16
通讯作者: 夏纪筑，博士，主任医师，教授，西南医科大学附属医院超声医学科，四川省泸州市 646000
作者简介:李文兰，女，1995年生，四川省泸州市人，西南医科大学附属医院在读硕士，执业医师，主要从事分子影像学研究。
基金资助:
国家自然科学基金青年基金(81501481)，项目负责人：夏纪筑；四川省教育厅科研资助课题 (17ZA0438)，项目负责人：夏纪筑

Preparation of a near-infrared photoresponsive biomimetic nanoprobe and its application in photothermal detection and treatment of breast cancer

Li Wenlan1, Wang Wenyuan1, Ren Wenxiu2, Zhang Yupei1, Yang Xiaoyan1, Wang Zhigang3, Xia Jizhu1

1Department of Ultrasound, 2Department of Radiology, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 3Chongqing Key Laboratory of Ultrasound Molecular Imaging, Chongqing 400010, China

Received:2022-11-21 Accepted:2023-01-29 Online:2024-02-18 Published:2023-08-16
Contact: Xia Jizhu, MD, Chief physician, Professor, Department of Ultrasound, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
About author:Li Wenlan, Master candidate, Physician, Department of Ultrasound, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China for Youth, No. 81501481 (to XJZ); Scientific Research Project of Sichuan Provincial Department of Education, No. 17ZA0438 (to XJZ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

细胞膜仿生技术：通过将不同细胞膜包被于纳米粒表面赋予纳米粒新的生物学功能。纳米粒被细胞膜仿生修饰后，获得了细胞膜表面丰富的蛋白质并保留了纳米粒的高载药能力，延长了体内循环时间，使纳米粒具有逃避免疫系统、跨越各种生理屏障的能力。

A-D-A结构有机小分子材料：基于受体-供体-受体结构的有机小分子，具有优异的分子内电荷转移能力，在近红外区域具有强吸收峰，是一种理想的光热材料。

背景：光热疗法是一种新兴的肿瘤治疗手段，利用光热剂将光能转化为热能来实现肿瘤的无创消融。光热疗法与纳米技术的兴起为乳腺癌的治疗开辟了新视角。

目的：制备一种乳腺癌细胞膜修饰的新型近红外仿生纳米探针，探究其体外近红外荧光/超声显像效果，观察其体外对同源肿瘤细胞的靶向能力和光热治疗效果。
方法：以具有A-D-A结构的有机小分子ITIC-4CI作为光热剂、聚乳酸/羟基乙酸共聚物为纳米载体、小鼠乳腺癌细胞4T1细胞膜为纳米颗粒表面修饰剂，并核心负载全氟己烷，采用双步乳化法与超声法制备新型近红外仿生纳米探针(4T1m/ITIC-4CI/PFH)，对纳米探针进行基本表征，并验证其对同源肿瘤细胞的靶向性；探究纳米探针的光热性能及光热稳定性，观察激光照射下纳米探针的近红外荧光/超声成像效果；采用CCK-8法和钙黄绿素/碘化丙啶染色法评估纳米探针的光热治疗效果。

结果与结论：①制备的纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH尺寸均一、稳定性好，平均粒径为(92.7±2.3) nm，与乳腺癌4T1细胞膜具有相似的蛋白图谱；体外细胞摄取实验证实，该纳米探针可靶向同源乳腺癌4T1细胞；②纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH具有红移吸收光谱和延伸到近红外Ⅱ区的尾部发射，在激光辐照下可发出明亮的近红外Ⅱ区荧光信号；③经激光照射，纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH可相变为微气泡，增强超声显像；CCK-8和钙黄绿色/碘化丙啶染色结果显示，纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH对乳腺癌4T1细胞具有明显的光热杀伤效果；④结果表明，纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH具有靶向同源肿瘤的能力，并可增强近红外Ⅱ区波段荧光/超声显像和光热疗法疗效。

https://orcid.org/0000-0002-9852-9505(李文兰)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 癌细胞膜, 近红外荧光成像, 双模态成像, 光热治疗, A-D-A结构, 纳米探针, 纳米技术

Abstract: BACKGROUND: Photothermal therapy is a novel tumor treatment strategy that uses photothermal agents to transform light energy into heat energy to accomplish non-invasive tumor ablation. The rise of photothermal therapy and nanotechnology has provided a new perspective on breast cancer treatment.
OBJECTIVE: To prepare a new type of near-infrared biomimetic nanoprobe that has been modified by breast cancer cell membrane, to investigate the effect of near-infrared fluorescence/ultrasound imaging in vitro, and to observe its targeting ability and photothermal therapy effect on homologous tumor cells in vitro.
METHODS: Organic small molecule ITIC-4CI with A-D-A structure was used as photothermal agents; polylactic acid/glycolic acid copolymer as nanocarrier; 4T1 cell membrane of mouse breast cancer cells as a surface modifier of nanoparticles; perfluorohexane (PFH) was loaded. A novel near-infrared biomimetic nanoprobe (4T1m/ITIC-4CI/PFH) was prepared by the double emulsion evaporation method and sonication method. The basic characterization of the nanoprobe and the homologous targeting ability were detected. The photothermal properties and photothermal stability of the probe were investigated, and the near-infrared fluorescence/ultrasound imaging effect of the probe under laser irradiation was observed. The CCK-8 assay and calcein/propidium iodide staining were used to assess the efficacy of photothermal therapy.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The prepared 4T1m/ITIC-4CI/PFH nanoprobes had uniform size, high stability, and an average particle size of (92.7±2.3) nm. The probe’s protein composition was identical to that of the 4T1 cell membrane. The nanoprobe’s ability to target homologous 4T1 cells was validated by an in vitro cell uptake assay. (2) The nanoprobe had a red-shift absorption spectrum and tail emission extending to the near-infrared-II, which emitted a bright near-infrared-II fluorescence signal under laser irradiation. (3) After laser irradiation, the nanoprobe 4T1m/ITIC-4CI/PFH could be turned into microbubbles and enhanced ultrasound imaging. The results of CCK-8 assay and calcein/propidium iodide staining showed that the nanoprobe 4T1m/ITIC-4CI/PFH had an obvious photothermal killing effect on 4T1 cells. (4) The results show that the nanoprobe 4T1m/ITIC-4CI/PFH has the ability to target homologous tumors and enhance near-infrared-II fluorescence imaging/ultrasound imaging and photothermal therapy effects.

Key words: cancer cell membrane, near-infrared fluorescence imaging, dual mude imaging, photothermal therapy, A-D-A structure, nanoprobe, nanotechnology

中图分类号:

李文兰, 王文渊, 任文秀, 张玉佩, 杨小燕, 王志刚, 夏纪筑. 制备近红外光响应性仿生纳米探针及在乳腺癌光热诊疗中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(5): 669-675.

Li Wenlan, Wang Wenyuan, Ren Wenxiu, Zhang Yupei, Yang Xiaoyan, Wang Zhigang, Xia Jizhu. Preparation of a near-infrared photoresponsive biomimetic nanoprobe and its application in photothermal detection and treatment of breast cancer[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(5): 669-675.

图/表（结果） 7

2.1 纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH的表征结果透射电镜下可见，纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH呈球形，大小均一，分散性好，表面包覆的细胞膜清晰可见，说明细胞膜修饰成功，见图1A-C。激光粒度分析仪检测显示，经癌细胞膜包被后的纳米探针平均粒径为(92.7±2.3) nm，见图1D；表面电位为(-20.19±4.2) mV，见图1E。于4 ℃和血清中存放7 d后，纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH粒径未见明显变化，见图1F。纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH的平均包封率为(67.81±1.42)%，平均载药量为(4.49±0.13)%。凝胶电泳检测结果显示纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH和4T1细胞膜具有相似的蛋白图谱，见图1G。

2.2 纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH的吸收和发射光谱紫外-可见光吸收光谱检测结果显示，空白的聚乳酸/羟基乙酸共聚物纳米粒溶液在500-900 nm无明显吸收峰，ITIC-4CI二氯甲烷溶液在500-900 nm的最大吸收峰位于690 nm附近，而4T1m/ITIC-4CI/PFH水溶液最大吸收峰位于745 nm附近，吸收光谱发生红移，见图2A。荧光光谱检测显示，4T1m/ITIC-4CI/PFH水溶液发射光谱荧光峰中心位于876 nm附近，托尾可延伸至近红外Ⅱ区，说明其具有近红外Ⅱ区荧光成像的潜力，见图2B。

2.3 纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH的同源靶向能力如图3A所示，DiI标记的纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH和ITIC-4CI/PFH分别与4T1细胞孵育不同时间，孵育3 h后可见4T1细胞对4T1m/ITIC-4CI/PFH有明显摄取。然后，将纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH分别与4T1细胞、MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞、A549细胞共孵育3 h，荧光显微镜下观察到4T1细胞荧光强度最高，证实了4T1m/ITIC-4CI/PFH可以特异性结合4T1细胞，具有同源靶向能力，见图3B。

2.4 纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH的光热性能及光热稳定性在激光(1 W/cm2)照射下，溶液温度随纳米探针质量浓度的增加而升高，呈浓度依赖性，见图4A。固定纳米探针质量浓度(0.5 mg/mL)后，溶液温度随着激光功率密度的增加而升高，红外热像仪记录了不同功率照射时的热成像图，见图4B、C。光热稳定性检测结果显示，4T1m/ITIC-4CI/PFH在660 nm激光连续加热/冷却循环5次后仍保持良好的光热转换能力，表明4T1m/ITIC-4CI/PFH具有优异的光热稳定性，见图4D。

2.5 纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH的体外近红外荧光成像/超声成像在880 nm激光照射下，不同质量浓度(0，0.03，0.06，0.125，0.5，1 mg/mL)的4T1m/ITIC-4CI/PFH溶液发出明显的近红外Ⅱ区荧光信号，随着纳米探针质量浓度的增加，荧光信号更明显，见图5A、D。在体外超声成像中，经激光辐照后，二维模式和超声增强模式下都可见纳米探针明显的信号增强，超声信号强度的变化呈纳米探针质量浓度依赖性，见图5B、C。激光照射前后，光镜下观察到纳米探针发生相变，形成不同大小微气泡，见图5E。

2.6 纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH的体外细胞毒性实验如图6A、B所示，无激光照射时，不同质量浓度的纳米粒与MCF-10A细胞、4T1细胞共孵育24 h后，在较高治疗浓度下(1.25 mg/mL)细胞存活率仍保持在90%以上，说明该纳米粒具有良好的生物相容性。

2.7 纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH的体外光热治疗效果钙黄绿色/碘化丙啶活死染色结果显示，单激光组和4T1m/ITIC-4CI/PFH组均未见明显红色荧光，ITIC-4CI/PFH+激光组细胞可见较少红色荧光，4T1m/ITIC-4CI +激光组可见部分红色荧光，4T1m/ITIC-4CI/PFH+激光组可见明显红色荧光，细胞杀伤效果最显著，见图7A。4T1细胞与不同组分的纳米粒共孵育4 h后，4T1m/ITIC-4CI/PFH+激光组表现出明显的细胞杀伤效果，见图7B。

参考文献

[1] SUNG H, FERLAY J, SIEGEL RL, et al. Global cancer statistics 2020: globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249.
[2] LIU M, ANDERSON R, LAN X, et al. Recent advances in the development of nanoparticles for multimodality imaging and therapy of cancer. Med Res Rev. 2020;40(3):909-930.
[3] YAN D, WANG M, WU Q, et al. Multimodal imaging‐guided photothermal immunotherapy based on a versatile nir‐ii aggregation‐induced emission luminogen. Angew Chem Int Ed Engl. 2022;61(27):e202202614.
[4] LIU Y, BHATTARAI P, DAI Z, et al. Photothermal therapy and photoacoustic imaging via nanotheranostics in fighting cancer. Chem Soc Rev. 2019;48(7):2053-2108.
[5] CHANG T, QIU Q, JI A, et al. Organic single molecule based nano-platform for nir-ii imaging and chemo-photothermal synergistic treatment of tumor. Biomaterials. 2022;287:121670.
[6] JI Y, JONES C, BAEK Y, et al. Near-infrared fluorescence imaging in immunotherapy. Adv Drug Deliv Rev. 2020;167:121-134.
[7] LI L, DONG X, LI J, et al. A short review on nir-ii organic small molecule dyes. Dyes Pigments 2020;183:108756.
[8] LI JB, LIU HW, FU T, et al. Recent progress in small-molecule near-ir probes for bioimaging. Spec. Issue Part Two Big Quest Chem. 2019; 1(2):224-234.
[9] 孙阳,王志刚.多功能超声造影剂分子显像与治疗研究进展[J].中国超声医学工程学会,2012,28(1):84-86.
[10] CUI T, YAN Z, QIN H, et al. A sequential target‐responsive nanocarrier with enhanced tumor penetration and neighboring effect in vivo. Small. 2019;15(42):1903323.
[11] DOAN VHM, NGUYEN VT, MONDAL S, et al. Fluorescence/photoacoustic imaging-guided nanomaterials for highly efficient cancer theragnostic agent. Sci Rep. 2021;11(1):15943.
[12] PATIL Y, MISRA R. Rational molecular design towards nir absorption: efficient diketopyrrolopyrrole derivatives for organic solar cells and photothermal therapy. J Mater Chem C. 2019;7(42):13020-13031.
[13] JIA S, LI Z, SHAO J, et al. Acceptor regulation of acceptor–donor–acceptor type conjugated oligomer for photothermal combating of resistant bacteria. ACS Appl Polym Mater. 2022;4(8):5275-5280.
[14] LI B, GAN Y, YANG K, et al. Acceptor-donor-acceptor structured phototheranostics for near-infrared ii fluorescent and photoacoustic imaging-guided photodynamic and photothermal synergistic therapy. Sci Chin Mater. 2022;66:385-396.
[15] WAN Y, LU G, WEI WC, et al. Stable organic photosensitizer nanoparticles with absorption peak beyond 800 nanometers and high reactive oxygen species yield for multimodality phototheranostics. ACS Nano. 2020;14(8):9917-9928.
[16] ZHANG Y, SHI M, YAN Z, et al. Ultrastable near-infrared nonlinear organic chromophore nanoparticles with intramolecular charge transfer for dually photoinduced tumor ablation. Adv Healthc Mater. 2020;9(20):2001042.
[17] HE Z, ZHAO L, ZHANG Q, et al. An acceptor–donor–acceptor structured small molecule for effective nir triggered dual phototherapy of cancer. Adv Funct Mater. 2020;30(16):1910301.
[18] JUNG HS, VERWILST P, SHARMA A, et al. Organic molecule-based photothermal agents: an expanding photothermal therapy universe. Chem Soc Rev. 2018;47(7):2280-2297.
[19] LI S, DENG Q, ZHANG Y, et al. Rational design of conjugated small molecules for superior photothermal theranostics in the nir-ii biowindow. Adv Mater. 2020;32(33):2001146.
[20] LI L, HAN X, WANG M, et al. Recent advances in the development of near-infrared organic photothermal agents. Chem Eng J. 2021;417:128844.
[21] LI H, KIM Y, JUNG H, et al. Near-infrared (nir) fluorescence-emitting small organic molecules for cancer imaging and therapy. Chem Soc Rev. 2022;51(21):8957-9008.
[22] ZHEN X, CHENG P, PU K. Recent advances in cell membrane–camouflaged nanoparticles for cancer phototherapy. Small. 2019;15(1):1804105.
[23] FANG RH, HU CMJ, LUK BT, et al. Cancer cell membrane-coated nanoparticles for anticancer vaccination and drug delivery. Nano Lett. 2014;14(4):2181-2188.
[24] WANG Q, XIA B, XU J, et al. Biocompatible small organic molecule phototheranostics for nir-ii fluorescence/photoacoustic imaging and simultaneous photodynamic/photothermal combination therapy. Mater Chem Front. 2019;3(4):650-655.
[25] OZERSKAYA AV, ZAMAY TN, KOLOVSKAYA OS, et al. 11C-radiolabeled aptamer for imaging of tumors and metastases using positron emission tomography- computed tomography. Mol Ther Nucleic Acids. 2021;26:1159-1172.
[26] ZIMMER WD, BERQUIST TH, MCLEOD RA, et al. Bone tumors: magnetic resonance imaging versus computed tomography. Radiology. 1985; 155(3):709-718.
[27] WANG G, SONG L, HOU X, et al. Surface-modified gvs as nanosized contrast agents for molecular ultrasound imaging of tumor. Biomaterials. 2020;236:119803.
[28] ZHANG L, LIU Y, HUANG H, et al. Multifunctional nanotheranostics for near infrared optical imaging-guided treatment of brain tumors. Adv Drug Deliv Rev. 2022;190:114536.
[29] PATHAK V, NOLTE T, RAMA E, et al. Molecular magnetic resonance imaging of alpha-v-beta-3 integrin expression in tumors with ultrasound microbubbles. Biomaterials. 2021;275:120896.
[30] 甘甜,王文渊,晏殊瑾,等.携载LXR激动剂近红外光响应性纳米粒的光热协同免疫效应[J].中国组织工程研究,2023,27(12):1863-1869.
[31] ZHANG C, LIU J, GUO H, et al. Theranostic nanomedicine carrying l-menthol and near-infrared dye for multimodal imaging-guided photothermal therapy of cancer. Adv Healthc Mater. 2019;8(16):1900409.
[32] LI S, DENG Q, ZHANG Y, et al. Rational design of conjugated small molecules for superior photothermal theranostics in the nir-ii biowindow. Adv Mater. 2020;32(33):2001146.
[33] CAI Y, WEI Z, SONG C, et al. Novel acceptor–donor–acceptor structured small molecule-based nanoparticles for highly efficient photothermal therapy. Chem Commun. 2019;55(61):8967-8970.
[34] WAN X, LI C, ZHANG M, et al. Acceptor–donor–acceptor type molecules for high performance organic photovoltaics – chemistry and mechanism. Chem Soc Rev. 2020;49(9):2828-2842.
[35] 黄建波,杨林,阳锐,等.岩藻多糖修饰的相变型造影剂体外超声显像及靶向肝癌的实验研究[J].四川大学学报(医学版),2022, 53(5):752-757.
[36] PEI X, PAN X, XU X, et al. 4T1 cell membrane fragment reunited pamam polymer units disguised as tumor cell clusters for tumor homotypic targeting and anti-metastasis treatment. Biomater. Sci. 2021;9(4):1325-1333.
[37] LI H, LIU Y, HUANG B, et al. Highly efficient gsh-responsive “off–on” nir-ii fluorescent fenton nanocatalyst for multimodal imaging-guided photothermal/chemodynamic synergistic cancer therapy. Anal Chem. 2022;94(29):10470-10478.
[38] ZHU L, ZHONG Y, WU S, et al. Cell membrane camouflaged biomimetic nanoparticles: focusing on tumor theranostics. Mater Today Bio. 2022; 14:100228.
[39] 王红卫,卓忠雄,赵延新,等.超声辐照瘤内注射微泡空化效应的病理学研究[J].中国超声医学杂志,2007(4):256-258.
[40] 周裕卿,彭玉兰,杨林,等.全氟化碳纳米粒在超声分子成像和治疗中的应用[J].中国医学影像学杂志,2022,30(5):514-517.

引言

乳腺癌成为女性最常见的恶性肿瘤[1]，严重威胁着女性的生命健康。分子成像介导光热治疗近年来受到极大关注[2–4]。其中，近红外荧光成像在生物组织中的光散射少、组织背景小，具有较好的组织穿透能力[5-8]，在肿瘤生物成像方面具有广阔的应用前景。超声分子成像具有更好的软组织结构分辨率和纵侧向探测深度[9]，将其与近红外荧光成像结合可以获得具有高肿瘤敏感性和空间分辨率的互补信号，为肿瘤的早期精准诊疗提供更丰富的信息。
光热剂的光热性能及生物相容性是实现肿瘤高效光热诊疗的关键因素[10-11]。近年来，基于A-D-A结构的有机小分子，因其在近红外区域具有强吸收峰被开发用于肿瘤的光学成像与光热治疗[5，12]。A-D-A结构的有机小分子，可以通过调节给体和受体单元的结构有效调控最高占据分子轨道和最低未占据分子轨道之间的能量差，从而提高非辐射跃迁效率、增强光热转换能力[13-16]。此外，这种推-拉电子结构的分子可以诱导高效的分子内电荷转移，使其具有可延伸到近红外区域的宽吸收，且荧光量子产率低，从而可最大限度地将光能转化为热能用于光热疗法[17]。
与无机光热剂相比，有机光热剂具有明确的化学结构、良好的重复性和生物降解性，因此在临床转化方面具有很好的应用前景[18-20]。然而，非靶向的近红外分子探针对肿瘤的选择性低，可能对正常组织造成损伤，产生严重的不良反应[21]。近年来，细胞膜仿生技术成为改善光热剂生物相容性和肿瘤靶向性的重要策略[22]。肿瘤细胞膜上特定的蛋白质分子，不仅可以使纳米探针靶向同源肿瘤细胞，还可以使其逃避肝脾巨噬系统吞噬，从而提高肿瘤精准诊疗疗效[23]。因此，将具有A-D-A结构的有机小分子作为光热剂，通过自组装制备成近红外响应性仿生纳米探针，有望实现经近红外荧光/超声成像导航下的乳腺癌靶向光热治疗。
基于以上背景，此次研究通过双步乳化法将有机小分子ITIC-4CI负载于聚合物纳米载体聚乳酸/羟基乙酸共聚物中，采用乳腺癌细胞4T1细胞膜(4T1m)对纳米颗粒进行表面修饰，同时核心负载相变材料全氟己烷(Perfluorohexane，PFH)，构建了一种乳腺癌细胞膜仿生纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH，在体外细胞水平验证其体外近红外荧光/超声成像效果，并探究其对同源肿瘤细胞的靶向能力和光热治疗疗效。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。
1.2 时间及地点实验于2021年12月至2022年8月在代谢性血管疾病四川省重点实验室和西南医科大学附属医院肿瘤放射生物实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 主要试剂有机小分子ITIC-4CI(深圳睿迅光电材料科技有限公司)；聚乙二醇修饰的乳酸/羟基乙酸共聚物(聚合比50∶50，西安瑞禧生物科技有限公司)；聚乙烯醇(美国Sigma-Aldrich公司)；PFH(北京百灵威科技有限公司)；细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒(上海碧云天生物技术公司)；CCK-8细胞增殖检测试剂盒 (APExBIO，美国)。
1.3.2 主要仪器纳米激光粒度仪(90 Plus Zeta，Nano Brook)；透射电镜(Talos F200X，美国)；紫外-可见-近红外分光光度计(岛津UV-3600Plus，日本)；荧光分光光度计(岛津FS5，日本)；超声波细胞破碎仪(宁波新芝生物科技有限公司)；高速冷冻离心机(Eppendorf，德国)；热成像仪(FLUCK，美国)；超声诊断仪(ACUSON Sequoia，德国)；近红外Ⅱ区荧光显微成像系统(苏州影睿光学科技有限公司)。
1.3.3 实验细胞乳腺上皮细胞MCF-10A，乳腺癌细胞4T1、MCF-7、MDA-MB-231，非小细胞肺癌细胞A549，均由西南医科大学附属医院放射分子影像实验室提供。
1.4 实验方法
1.4.1 纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH的制备
ITIC-4CI/PFH的制备：取1 mg有机小分子ITIC-4Cl溶于1 mL二氯甲烷中备用，再利用双步乳化法制备ITIC-4CI/PFH纳米粒。具体步骤如下：称取40 mg聚乳酸/羟基乙酸共聚物，加入2 mL的二氯甲烷，常温振荡至完全溶解；加入
1 mg/mL的ITIC-4Cl二氯甲烷溶液，混匀；随后加入200 µL的PFH，振荡数秒混匀。在冰浴条件下第一次超声乳化(125 W，3 min，5 s，5 s)；将第一次乳化液转移至4 mL 4%聚乙烯醇溶液中，在相同条件下完成第二次超声乳化，然后将乳化液转移至10 mL的2%异丙醇溶液中，低温磁力搅拌2.0-3.0 h，使二氯甲烷挥发完全；收集上述溶液，低温离心(12 000 r/min离心10 min)，取沉淀，重复离心洗涤3次，最后得到无膜纳米粒ITIC-4CI/PFH。所有步骤均在避光条件下进行，在聚乳酸/羟基乙酸共聚物二氯甲烷溶液中加入DiI，可制备荧光标记的聚乳酸/羟基乙酸共聚物纳米粒。按照上述步骤制备无PFH的4T1m/ITIC-4CI纳米粒，将纳米粒置于4 ℃避光保存。
癌细胞膜提取和4T1m/ITIC-4CI/PFH纳米探针的制备：收集处于对数生长期的4T1细胞，用预冷的PBS清洗培养皿3次后，用细胞刮刀收集细胞，4 ℃下600×g 离心5 min，取沉淀，加入含有膜蛋白提取试剂A和蛋白酶抑制剂PMSF(浓度为1×10-3 mol/L)的低渗裂解缓冲液，轻轻吹打细胞，置于冰上15 min。将细胞悬液置于液氮和室温中，反复冻融，4 ℃下700×g离心10 min，取上清；4 ℃下14 000×g离心30 min，所得沉淀即为癌细胞膜，置于-80 ℃保存。将上述制备的ITIC-4CI/PFH与细胞膜按质量比1∶1混合，冰浴超声(100 W，3 min)后，12 000 r/min离心10 min，取沉淀，得到仿生纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH。采用同样的方法制备4T1m/ITIC-4CI，4 ℃保存备用。
1.4.2 纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH的表征采用透射电镜分别观察4T1细胞膜、ITIC-4CI/PFH、4T1m/ITIC-4CI/PFH的形貌，激光粒度分析仪检测4T1m/ITIC-4CI/PFH的粒径、分布及Zeta电位。
将纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH避光存放在4 ℃冰箱和含体积分数10%血清的培养基中，于7 d内检测纳米探针的粒径，评价其稳定性。
采用紫外分光光度计检测游离ITIC-4Cl、聚乳酸/羟基乙酸共聚物纳米粒和4T1m/ITIC-4CI/PFH的吸收光谱。
配置不同质量浓度的ITIC-4CI标准工作液(12.5，6.25，3.125，1.56，0.78，0 µg/mL)，用紫外分光光度计测定ITIC-4CI最大吸收波长处的吸光度值，绘制标准曲线，计算4T1m/ITIC-4CI/PFH中ITIC-4CI的包封率及载药量。
采用荧光分光光度计检测4T1m/ITIC-4CI/PFH的荧光光谱，分析其光物理性质。
采用凝胶电泳法(SDS-PAGE)检测4T1m/ITIC-4CI/PFH表面膜蛋白图谱，验证癌细胞膜是否包被成功。
1.4.3 纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH体外细胞摄取和同源靶向性检测当4T1细胞处于对数生长期时，以1×105/孔的密度接种于培养皿，于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中孵育24 h后，将DiI标记的ITIC-4CI/PFH和4T1m/ITIC-4CI/PFH分别加入到培养皿中，孵育 0.5，1，2，3 h，去掉培养基，终止孵育。用PBS洗3遍，加入40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS 清洗3遍；加入适量的DAPI染色10 min；PBS 清洗3遍，在荧光显微镜下观察细胞摄取情况。
将4T1m/ITIC-4CI/PFH分别与MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞、A549细胞孵育3 h，采用上述同样步骤进行染色，荧光显微镜下观察并采集图像。
1.4.4 纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH体外近红外Ⅱ区荧光/超声成像将不同质量浓度(0，0.03，0.06，0.125，0.5，1 mg/mL)的4T1m/ITIC-4CI/PFH分别避光加入96孔板中，200 µL/孔，在880 nm激发下观察不同质量浓度纳米探针的近红外Ⅱ区荧光成像效果并对荧光强度进行定量分析。
将不同质量浓度(0，0.125，0.25，0.5，1 mg/mL)的4T1m/ITIC-4CI/PFH加入到琼脂糖凝胶模型中，在660 nm激光照射下(1 W/cm2)观察超声二维模式和增强模式显像效果，应用Image J软件进行定量分析。激光照射前后，光镜下观察纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH(1 mg/mL)的相变情况。
1.4.5 纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH体外光热性能及光热稳定性评估用660 nm激光(1 W/cm2)照射不同质量浓度4T1m/ITIC-4CI/PFH溶液10 min，热像仪记录溶液的温度变化；然后固定溶液质量浓度(0.5 mg/mL)，采用不同功率密度激光照射10 min并记录温度变化。
为了研究4T1m/ITIC-4CI/PFH的光热转换能力和光热稳定性，将纳米粒溶液(0.5 mg/mL)加热、冷却循环5次，热像仪实时记录溶液温度变化，最后获得温升和降温曲线。
1.4.6 纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH体外光热治疗效果评估首先，采用CCK-8检测纳米探针对MCF-10A和4T1细胞的细胞毒性。当MCF-10A细胞、4T1细胞处于对数生长期且细胞长至80%-90%时，使用计数板计数，用新鲜的完全培养基调整细胞悬液浓度；将MCF-10A细胞和4T1细胞按(6-8)×103/孔的密度接种于96孔板，在培养箱中孵育24 h后，实验组加入含有不同质量浓度4T1m/ITIC-4CI/PFH的新鲜培养基，放入培养箱中培养。孵育24 h后，以换液形式将含有10%CCK-8的培养基加入每孔，孵育1 h后，用酶标仪记录450 nm处的吸光度值，计算细胞存活率。细胞存活率=(实验组吸光度值-空白组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)×100%，对照组未加入4T1m/ITIC-4CI/PFH，空白组未加入4T1m/ITIC-4CI/PFH与细胞。
将4T1细胞以(6-8)×103/孔的密度接种于96孔板，在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中孵育过夜，分为对照组、单激光组、4T1m/ITIC-4CI/PFH组、4T1m/ITIC-4CI+激光组、ITIC-4CI/PFH+激光组、4T1m/ITIC-4CI/PFH+激光组。将不同组分纳米探针与4T1细胞共同孵育4 h后，各激光组予以激光照射(1 W/cm2，5 min)，采用CCK-8法测定各组细胞存活率；用钙黄绿素和碘化丙啶染色，在荧光显微镜下观察细胞的存活状态。
1.5 主要观察指标纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH的体外同源靶向能力及其增强近红外Ⅱ区荧光/超声显像和光热治疗效果。
1.6 统计学分析采用GraphPad Prism v9.0.0软件进行统计学分析，计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，两变量之间关系采用线性相关分析；计数资料以百分比表示；P < 0.05表示差异有显著性意义。统计学方法已经西南医科大学附属医院统计学老师刘军祥审核。

讨论

光热治疗被认为是近年来癌症治疗的重大突破，通过非电离、非侵入性光照射可实现肿瘤局部热消融[24]。分子成像技术，包括计算机断层扫描、磁共振、核医学成像、超声成像和光学成像[25-29]，已被用于非侵入性的肿瘤早期诊断[30]。将近红外Ⅱ区荧光成像与超声成像结合，可以实现肿瘤实时成像，为肿瘤的早期诊断和实时监测光热治疗疗效提供一种潜在新策略[31]。
ITIC-4CI是一种低带A-D-A结构分子，其独特的分子结构使其自组装后形成的纳米探针表现出优异的光物理特性，在其光物理性质研究中发现，游离的ITIC-4CI在690 nm处具有很强的吸收峰。纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH在PBS中具有与游离ITIC-4CI相似的特征吸收峰，但吸收峰红移至745 nm附近。此外，纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH的最大发射峰位于876 nm附近，并具有延伸到近红外Ⅱ区的尾部发射，这可能是由于A-D-A结构分子端基的强吸电子能力和大稠环共轭核的供电子能力促进了分子内电荷转移，从而使吸收光谱和荧光发射光谱向近红外区域移动[16，32]。利用纳米探针在溶液中优异的光学性质，进一步验证其荧光成像性能发现，在880 nm激光照射下，纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH在PBS中可发出明亮的近红外Ⅱ区荧光信号，随着纳米探针质量浓度的增加，荧光信号逐渐增强。因此，4T1m/ITIC-4CI/PFH是一种具有近红外Ⅰ区吸收和近红外Ⅱ区尾部发射的近红外纳米探针，具有近红外Ⅱ区荧光成像和高效光热治疗的潜力。
光热纳米的光热性能和热稳定性是临床应用的重要参数。基于A-D-A结构分子ITIC的纳米粒子，已被证实在660 nm
激光照射下具有光热治疗效应，在体外具有高的光热转换效率(≈41.6%)[33]，其衍生物ITIC-4CI具有更低的光学带隙(1.48 eV)和更好的电子传输能力[34]，是一种理想的光热剂。纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH在660 nm激光照射下温度变化呈浓度、功率依赖性；同时，纳米探针在5个照射周期表现出优异的光热稳定性和光热转换能力。此外，纳米探针在近红外激光照射下可发生相变，实现增强超声显像的功能，其潜在机制可能与纳米探针发生相变后转化为微气泡，与周围环境产生声阻抗差异，从而增强背向散射，实现增强超声对比显影[35]。结果表明，纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH具有良好的光热性能和增强超声显像的能力。
癌细胞膜的包覆可以改善纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH的生物相容性并赋予其同源靶向能力。4T1细胞表面具有转铁蛋白抗原、上皮细胞黏附分子、CD44和CD47等细胞黏附分子[36-37]，这些黏附分子(转铁蛋白抗原、CD44和CD47)在细胞黏附中发挥了重要的作用，通过特异性识别黏附分子实现源细胞特异性靶向，基于这些膜蛋白的同源结合机制，从而可以实现纳米探针与肿瘤细胞之间的特异性识别和结合。此次研究通过双步乳化法和超声法成功制备了4T1细胞膜包被的多功能纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH，经4T1细胞膜修饰后其粒径为(92.7±2.3) nm，尺寸均一、稳定性良好。制备的纳米探针与4T1细胞膜具有相似的蛋白图谱，因而可以通过同源靶向结合机制，主动靶向同源肿瘤细胞[38]。此外，在体外同源靶向性实验中发现，4T1细胞组对包覆同源4T1细胞膜的纳米探针摄取率和荧光强度更高，进一步证实了纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH与同源4T1细胞的特异性结合能力。因此，纳米探针4 T1m/ITIC-4CI/PFH可以主动靶向同源4T1细胞，有助于提高肿瘤成像效果和光热治疗疗效。
良好的生物安全性和肿瘤靶向性有助于实现安全高效的光热治疗。在体外细胞毒性实验中，纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH对4T1细胞和MCF-10A细胞均无明显的细胞毒性，细胞存活率大于90%，且单激光照射或4T1m/ITIC-4CI/PFH处理的4T1细胞生长无明显抑制，说明4T1m/ITIC-4CI/PFH具有良好的生物相容性。相比之下，激光辐照时ITIC-4CI/PFH组、4T1m/ITIC-4CI/PFH组表现出明显的细胞抑制作用，4T1m/ITIC-4CI/PFH联合激光处理时热疗效果更为显著，说明纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH的同源靶向作用促进了对肿瘤细胞的选择性杀伤效应。4T1m/ITIC-4CI+激光组对4T1细胞的杀伤效果弱于4T1m/ITIC-4CI/PFH+激光组，但强于ITIC-4CI/PFH+激光组，这可能是激光照射下ITIC-4CI的光热效应促使4T1m/ITIC-4CI/PFH纳米探针发生液气相变，转化为微泡，相变时的空化效应、机械破坏作用使细胞膜通透性增强[39-40]，纳米探针更容易进入肿瘤细胞，从而协同增强光热治疗疗效。以上结果表明，4T1m/ITIC-4CI/PFH纳米探针具有良好的生物相容性和体外靶向治疗效果，是一种有前途的肿瘤光疗制剂。
综上所述，研究成功制备了一种新型近红外仿生纳米探针4T1m/ITIC-4CI/PFH，在体外验证了其近红外荧光/超声成像效果，探究了其同源靶向能力和光热治疗效果。研究首次通过双步乳化法将A-D-A结构的有机小分子ITIC-4CI负载于聚乳酸/羟基乙酸共聚物纳米粒中，使ITIC-4CI的水溶性和生物相容性得到改善，且在PBS中表现出优异的近红外Ⅱ荧光成像能力和光热性能。此外，经4T1细胞膜修饰的纳米探针既避免了繁琐的基团修饰工程，又实现了纳米探针与肿瘤细胞之间的特异性识别和结合，提高了对肿瘤的同源靶向性和光热治疗效果。因此，研究为新型纳米探针的制备及双模态成像导航下乳腺癌精准诊疗提供了一种新策略，但纳米探针在体内的生物安全性、分布及光热治疗疗效仍需进一步验证。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

制备近红外光响应性仿生纳米探针及在乳腺癌光热诊疗中的应用

Preparation of a near-infrared photoresponsive biomimetic nanoprobe and its application in photothermal detection and treatment of breast cancer

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[1]	刘瀚峰, 王晶晶, 余云生. 人造外泌体治疗心肌梗死：应用现状及前景[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1118-1123.
[2]	范亚茹, 李瑞欣, 李凤集, 罗睿, 刘浩, 严颖彬. 载吲哚菁绿聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球的表征及其光热效应[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(12): 1817-1823.
[3]	甘甜, 王文渊, 晏殊瑾, 郝兰, 冉海涛, 王志刚, 夏纪筑. 携载LXR激动剂近红外光响应性纳米粒的光热协同免疫效应[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(12): 1863-1869.
[4]	范亚茹, 李瑞欣, 李凤集, 罗睿, 刘浩, 严颖彬. 载吲哚菁绿聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球的表征及其光热效应 [J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(在线): 1-6.
[5]	岑超德, 张永, 罗聪, 杨晓兰, 邬均, 吴声忠, 刘福尧. 超顺磁性壳聚糖明胶微球作为缓释基因载体的磁转染及释放[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(2): 218-225.
[6]	王琳，陈丹莹，张治宇，张杭州. 纳米材料在关节置换内植物应用中的研究与特点[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(22): 3567-3575.
[7]	官晨雨，侯世达，周洋，曾融生. 磁性四氧化三铁纳米颗粒作用于前成骨细胞的生物相容性[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(38): 5684-5690.
[8]	王晓东，张永红. 聚羟基丁酸-羟基辛酸共聚酯载生长因子的缓释纳米微球[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(52): 8405-8408.
[9]	曹爱红，杨欣，郭子威，胡维. 纳米生物探针双标大鼠骨髓间充质干细胞的成活及生长[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(41): 6567-6572.
[10]	李增耀，王彤. 硅纳米线生物传感器与肿瘤标记物的检测[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(47): 8248-8254.
[11]	周伟华1, 2，郭讯枝1, 2，张阳德1，何剪太1. 聚丁二炔纳米粒快速检测日本血吸虫**☆◆[J]. 中国组织工程研究, 2012, 16(8): 1359-1362.
[12]	丛林海1，何晓光1，杨一兵1，张世文2，彭淑昆1 . 金纳米链与人喉癌Hep-2细胞共培养自由进出细胞的形式*^☆[J]. 中国组织工程研究, 2012, 16(8): 1363-1366.
[13]	陆凯. 组织工程学技术与运动性骨损伤的修复^★[J]. 中国组织工程研究, 2012, 16(7): 1311-1314.
[14]	丛林海，彭淑昆，何晓光，杨一兵. 金纳米链及抗表皮生长因子受体抗体/金纳米链共轭物近红外热疗可启动细胞凋亡通路*☆[J]. 中国组织工程研究, 2012, 16(16): 2875-2878.
[15]	金彦召，谭敏. 磁性碳纳米管载附5-氟尿嘧啶对结肠癌淋巴结转移的靶向抑制作用☆[J]. 中国组织工程研究, 2012, 16(16): 2884-2888.