miR-2116-3p在人增生性瘢痕中的表达及作用

doi:10.12307/2023.562

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (28): 4480-4486.doi: 10.12307/2023.562

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miR-2116-3p在人增生性瘢痕中的表达及作用

田文融，左俊，余扬，齐郁松，艾江，卜盼盼，赵皎均，马志伟，李培培，马少林

新疆医科大学第一附属医院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011

收稿日期:2022-08-01 接受日期:2022-08-27 出版日期:2023-10-08 发布日期:2023-01-29
通讯作者: 马少林，主任医师，教授，新疆医科大学第一附属医院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011
作者简介:田文融，女，1999年生，汉族，硕士，医师，主要从事增生性瘢痕的形成机制与防治研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81760345)：中医药提取物总黄酮抑制增生性瘢痕TGF-β1激活下游MAPK与Smad信号通路调控机制研究，项目负责人：马少林；新疆维吾尔自治区科研创新项目基金(XJ2919G202)：肉苁蓉苯乙醇总苷对人增生性瘢痕成纤维细胞基于TGF-β/Smad信号通路的机制研究，项目负责人：艾江；新疆维吾尔自治区科研创新项目基金(XJ2022G174)：miRNA在人增生性瘢痕中的表达及作用，项目负责人：田文融

Expression and effect of microRNA-2116-3p in human hypertrophic scar

Tian Wenrong, Zuo Jun, Yu Yang, Qi Yusong, Ai Jiang, Bu Panpan, Zhao Jiaojun, Ma Zhiwei, Li Peipei, Ma Shaolin

Department of Plastic Surgery, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2022-08-01 Accepted:2022-08-27 Online:2023-10-08 Published:2023-01-29
Contact: Ma Shaolin, Chief physician, Professor, Department of Plastic Surgery, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Tian Wenrong, Master, Physician, Department of Plastic Surgery, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81760345 (to MSL); Scientific Research and Innovation Projects of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Nos. XJ2919G202 (to AJ) and XJ2022G174 (to TWR)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

miRNA：是一种小片段的非编码RNA，能够通过与目的基因靶向结合进而调控其基因表达，并产生相应生物学表现。
增生性瘢痕：是真皮或深部组织损伤或病变后，由新生结缔组织过度增生修复而成的一种皮损。增生性瘢痕多见于创伤、溃疡和局部炎症病变引起的深达真皮层的创面愈合之后，是人体创伤或炎症愈合过程的产物，临床表现为局部隆起的粉红色或紫红色肿块，表面充血、质地偏硬、边缘不突向正常皮肤，伴痒痛症状，治疗上以综合治疗为主。

背景：目前多项研究证实了miRNA影响增生性瘢痕的发生发展，Ⅰ型胶原与增生性瘢痕成纤维细胞密切相关，猜测miR-2116-3p也有可能与增生性瘢痕的发生发展有关系。
目的：探讨miR-2116-3p在人增生性瘢痕中的表达及作用。
方法：收集新疆医科大学第一附属医院6例患者的增生性瘢痕组织与6例患者重睑术后正常皮肤组织，采用qRT-PCR法检测miR-2116-3p与Ⅰ型胶原的表达。取增生性瘢痕组织，原代培养第3-6代成纤维细胞，分为阴性对照组、miR-2116-3p模拟物组和miR-2116-3p抑制物组，分别转染对应的序列，用CCK-8法与EdU试剂盒检测细胞增殖活力，划痕实验检测细胞迁移能力，流式细胞术检测细胞凋亡，qRT-PCR法与Western blot法检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α平滑肌肌动蛋白的基因与蛋白表达，双荧光素酶实验验证其靶向结合。
结果与结论：①增生性瘢痕组织中miR-2116-3p的mRNA表达量低于正常皮肤组织(P < 0.01)，Ⅰ型胶原的mRNA表达量低于正常皮肤组织

(P < 0.01)；②转染后24，48，72 h，与阴性对照组比较，miR-2116-3p模拟物组细胞活力降低(P < 0.05或P < 0.01)，miR-2116-3p抑制物组细胞活力升高(P < 0.05或P < 0.01)；转染后48 h，与阴性对照组比较，miR-2116-3p模拟物组细胞EdU标记数减少(P < 0.01)，miR-2116-3p抑制物组EdU标记数增加(P < 0.05)；③转染后24 h，与阴性对照组比较，miR-2116-3p模拟物组细胞划痕面积、细胞凋亡率增加(P < 0.01)，miR-2116-3p抑制物组细胞划痕面积、细胞凋亡率减少(P < 0.01或P < 0.05)；④转染后24 h，与阴性对照组比较，miR-2116-3p模拟物组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-平滑肌肌动蛋白的基因与蛋白表达下降(P < 0.05或P < 0.01)，miR-2116-3p抑制物组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达升高(P < 0.01)；⑤双荧光素酶实验显示，miR-2116-3p能够与Ⅰ型胶原靶向结合；⑥结果表明，人增生性瘢痕中miR-2116-3p表达下调，miR-2116-3p可能通过靶向抑制Ⅰ型胶原的表达抑制人增生性瘢痕成纤维细胞的增殖、迁移，促进其凋亡。

https://orcid.org/0000-0003-2108-4541(田文融)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: miR-2116-3p, Ⅰ型胶原, 增生性瘢痕, 成纤维细胞, 皮肤纤维化

Abstract: BACKGROUND: A wide range of studies have demonstrated that microRNA (miR) plays a crucial role in hypertrophic scars development, and type I collagen is closely related to hypertrophic scar fibroblasts. There might be a relationship between miR-2116-3p and occurrence and development of hypertrophic scars.
OBJECTIVE: To investigate the expression and role of miR-2116-3p on human hypertrophic scar fibroblasts.
METHODS: Hypertrophic scar tissues were collected from six patients from the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University and normal skin tissues were collected from another six patients after blepharoplasty in the same unit at the same time. The expression of miR-2116-3p and type I collagen was detected by qRT-PCR. Hypertrophic scar tissues were taken and primary cells were cultured to passages 3 to 6. Hypertrophic scar fibroblasts were divided into negative control group, miR-2116-3p mimic group, and miR-2116-3p inhibitor group, and transfected with corresponding sequences. Cell proliferation was detected by cell counting kit-8 and EdU kit. Cell migration was detected by cell scratch assay, and apoptosis was detected by flow cytometry. Expression of type I collagen, type III collagen and α-smooth muscle actin was detected by western blot and qRT-PCR at protein and mRNA levels, respectively. Dual luciferase reporter assay system was used to carry out targeting assays.
RESULTS AND CONCLUSION: The mRNA expression of miR-2116-3p and type I collagen in hypertrophic scar tissues was significantly lower than that in normal skin tissues (P < 0.01). After 24, 48, and 72 hours of transfection, the cell viability of the miR-2116-3p mimic group was significantly lower than that of the negative control group (P < 0.05 or P < 0.01), while the cell viability of miR-2116-3p inhibitor group was significantly higher than that of the negative control group (P < 0.05 or P < 0.01). At 48 hours after transfection, the number of EdU positive cells in the miR-2116-3p mimic group was significantly lower than that in the negative control group, while the number of EdU positive cells in the miR-2116-3p inhibitor group was significantly higher than that in the negative control group (P < 0.05). At 24 hours after transfection, the cell scratch area and apoptotic rate of the miR-2116-3p mimic group were significantly higher than those of the negative control group (P < 0.01), and while the cell scratch area and apoptotic rate of the miR-2116-3p inhibitor group werer significantly lower than those of the negative control group (P < 0.01 or P < 0.05). At 24 hours after transfection, the mRMA and protein expression levels of type I collagen, type II collagen and α-smooth muscle actin were significantly decreased in the miR-2116-3p mimic group (P < 0.05 or P < 0.01) and significantly increased in the miR-2116-3p inhibitor group (P < 0.01) compared with the negative control group. Results from the dual luciferase assay showed that miR-2116-3p could bind to type I collagen. To conclude, the expression of miR-2116-3p is down-regulated in human hypertrophic scar. miR-2116-3p may inhibit the proliferation and migration of human hypertrophic scar fibroblasts and promote their apoptosis by targeting the expression of type I collagen.

Key words: miR-2116-3p, type I collagen, hypertrophic scar, fibroblast, skin fibrosis

中图分类号:

田文融, 左俊, 余扬, 齐郁松, 艾江, 卜盼盼, 赵皎均, 马志伟, 李培培, 马少林. miR-2116-3p在人增生性瘢痕中的表达及作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(28): 4480-4486.

Tian Wenrong, Zuo Jun, Yu Yang, Qi Yusong, Ai Jiang, Bu Panpan, Zhao Jiaojun, Ma Zhiwei, Li Peipei, Ma Shaolin. Expression and effect of microRNA-2116-3p in human hypertrophic scar[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(28): 4480-4486.

图/表（结果） 7

2.1 两种皮肤组织中miR-2116-3p与Ⅰ型胶原的mRNA表达 qRT-PCR检测结果显示，与正常皮肤组织相比，增生性瘢痕组织中miR-2116-3p的mRNA表达量减少(P < 0.01)；与正常皮肤成纤维细胞相比，增生性瘢痕组织成纤维细胞中miR-2116-3p的mRNA表达量减少(P < 0.01)；与正常皮肤组织相比，增生性瘢痕组织中Ⅰ型胶原的mRNA表达量减少(P < 0.01)，见图1。

2.2 miR-2116-3p对增生性瘢痕成纤维细胞增殖活力的影响 CCK-8检测显示，转染后0 h，各组细胞活力相近(P > 0.05)；转染后24，48，72 h，miR-2116-3p模拟物组细胞活力明显低于阴性对照组(t=5.693，15.541，36.26，P < 0.05或P < 0.01)，miR-2116-3p抑制物组细胞活力明显高于阴性对照组(t=7.021，20.782，18.618，P < 0.05或P < 0.01)，见图2A。依据EdU试剂盒操作后，用绿色细胞数/蓝色的细胞数的比值进行统计分析，结果显示，与miR-2116-3p阴性对照组相比，miR-2116-3p模拟物组细胞增殖水平显著下降(P < 0.05)，miR-2116-3p抑制物组细胞增殖水平显著升高(P < 0.05)，见图2B。

2.3 miR-2116-3p对增生性瘢痕成纤维细胞迁移的影响转染后24 h，与阴性对照组相比，miR-2116-3p模拟物组细胞迁移面积显著下降(t=25.387，P < 0.01)，miR-2116-3p抑制物组细胞迁移面积显著升高(t=42.834，P < 0.01)，见图3。

2.4 miR-2116-3p对增生性瘢痕成纤维细胞凋亡的影响转染后24 h，miR-2116-3p阴性对照组、miR-2116-3p模拟物组、miR-2116-3p抑制物组细胞凋亡率分别为(11.97±1.33)%，(42.03±2.17)%，(7.267±1.65)%，miR-2116-3p模拟物组的细胞凋亡率较阴性对照组显著升高(t=20.432，P < 0.01)，miR-2116-3p抑制物组的细胞凋亡率较阴性对照组显著下降(t=3.839，P < 0.05)，见图4。

2.5 miR-2116-3p与Ⅰ型胶原的靶向结合运用 Targetscan预测 miR-2116-3p的下游靶基因，即Ⅰ型胶原，见图5A。双荧光素酶结果示，与miR-2116-3p阴性对照组相比，共转染野生型(WT)Ⅰ型胶原-3′UTR时，miR-2116-3p模拟物组能减弱萤光素酶活性(P < 0.01)，共转染突变型(MT)Ⅰ型胶原-3′UTR时，两组萤光素酶活性比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5B。

2.6 miR-2116-3p对增生性瘢痕成纤维细胞中相关基因与蛋白表达的影响 qRT-PCR检测结果显示，与阴性对照组相比，miR-2116-3p模拟物组细胞Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-平滑肌肌动蛋白的mRNA表达量显著下降(P < 0.01)，miR-2116-3p抑制物组细胞Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-平滑肌肌动蛋白的mRNA表达量明显升高(P < 0.01)，见图6。Western blot检测结果显示，与阴性对照组相比，miR-2116-3p模拟物组细胞Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达量明显降低，miR-2116-3p抑制物组细胞Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达量升高，见图7。

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引言

烧伤或其他创伤后产生的增生性瘢痕，不仅引发相关功能障碍还产生瘙痒或伴有疼痛，严重影响患者生活且在外观上对患者心理产生严重影响[1]。目前临床上增生性瘢痕常采用物理治疗、手术切除、激光治疗以及糖皮质激素注射药物治疗等，但疗效欠佳，且暂无治疗金标准，有必要进一步阐明分子机制以开发新的预防和治疗增生性瘢痕的策略与方法。微小RNA(miRNA)是一种小片段的非编码RNA，能够通过与目的基因靶向结合进而调控表达[2-3]。miRNA被观察到在多种疾病中存在表达差异，并参与调节皮肤纤维化[4]、肝纤维化[5]、肾纤维化[6]、心肌纤维化等纤维化疾病[7]。BI等[8]发现miR-98的模拟物通过靶向Ⅰ型胶原抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖。CHAO等[9]发现在增生性瘢痕成纤维细胞中，miR-181c和miR-10a分别以尿激酶型纤溶酶原激活物和纤溶酶原激活物抑制物1为靶点进行差异表达，其抑制了Ⅰ型胶原的表达、促进了基质金属蛋白酶1的表达，从而抑制增生性瘢痕的形成。LI等[10]发现增生性瘢痕和增生性瘢痕成纤维细胞中miR-101的表达下调，证实模拟物miR-101可靶向结合EZH2，从而降低增生性瘢痕成纤维细胞中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-平滑肌肌动蛋白的表达，其还可有效抑制博莱霉素诱导的纤维化小鼠模型中的胶原沉积。近年研究已表明，各种miRNA能够参与增生性瘢痕的发生发展。增生性瘢痕形成与发展中涉及的多种细胞类型中，成纤维细胞是其形成的原型细胞，因为它们直接参与肉芽形成、细胞外基质沉积、伤口收缩和异常增生的整个过程[11]。目前有研究表明，miR-422a、miR2116-3p和miR-3187-3p在增生性瘢痕组织和增生性瘢痕成纤维细胞中表达下调[12]，并与泛素化密切相关，其中有关miR-2116-3p在增生性瘢痕中的具体作用机制研究鲜见报道[13]。此次研究在检测miR-2116-3p在增生性瘢痕组织中表达情况后，分析miR-2116-3p对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖、凋亡的调节作用，进一步探讨miR-2116-3p影响增生性瘢痕的机制，以期为增生性瘢痕的防治提供新的策略，为增生性瘢痕的发病机制和临床治疗的探寻提供理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞实验，采用盲法评估，组间比较采用两样本均数t检验。
1.2 时间及地点实验于 2021-2022年在新疆医科大学科技楼研究重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 标本来源收集2021-2022年新疆医科大学第一临床医学院整形外科提供的增生性瘢痕和正常皮肤。6例增生性瘢痕患者，其中男3例，女3例；6例重睑术后患者，其中男3例，女3例。研究方案的实施符合《赫尔辛基宣言》和新疆医科大学第一临床医学院的相关伦理要求 (伦理批号：20170214-71)。供者对标本的采集完全知情同意，并签署了“知情同意书”。
增生性瘢痕患者纳入标准：①烧烫伤或创伤后增生期增生性瘢痕皮肤；②患者没有任何血液系统及全身性疾病；③只接受过手术治疗。
增生性瘢痕患者排除标准：①瘢痕疙瘩；②供者伴有其他血液系统及全身性疾病；③孕妇及哺乳期妇女；④依从性差者。
正常皮肤供者纳入标准：①正常皮肤；②患者没有血液系统及全身性疾病。
正常皮肤供者排除标准：①供者伴有其他血液系统及全身性疾病；②依从性差者。
1.3.2 主要试剂及仪器 DMEM高糖培养基、PBS (Hyclone，美国)；EDTA-胰蛋白酶(Gibico，美国)；细胞RIPA裂解液(Solarbio，中国)；Ⅰ型胶原多克隆抗体、Ⅲ型胶原单克隆抗体、α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(Abcam，英国)；GAPDH单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的IgG抗体、CCK-8试剂(bioss，美国)；miR-2116-3p前向引物、U6前向引物、Ⅰ型胶原野生型(WT)、Ⅰ型胶原突变型(MT)(与miR-2116-3p结合位点的序列突变)及Ⅰ型胶原质粒引物(生工，上海)；miR-2116-3p模拟物、miR-2116-3p抑制物、miR-2116-3p阴性对照(锐博，广州)；脂质体Lipo8000转染试剂(碧云天，上海)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、BD FACSCalibur型流式细胞仪(BD，美国)；SYBRGreen荧光定量试剂盒-RR820、荧光素酶报告基因检测试剂盒(promega，美国)；PCR反转录试剂盒-RR047(Takara，日本)；miRNA提取分离试剂盒-DP501、miRNA cDNA第一链合成试剂盒-KR211、miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)-FP411(天根，北京)；TRIzol、ThermoScientific™ MultiskanSky型全波长酶标仪(Thermo，美国)；CFX96™型实时荧光定量PCR仪、Gel DocTM XR+Western-Blot凝胶成像分析系统(Bio-Rad，美国)；Leica DMI4000B/DM5000B型正、倒置荧光显微镜(Leica，日本)。
1.4 实验方法

1.4.1 qRT-PCR检测miR-2116-3p、Ⅰ型胶原的mRNA表达 miR-2116-3p的mRNA表达：取正常皮肤组织、增生性瘢痕组织，每50 mg组织加1 mL 裂解液MZ，用匀浆仪进行匀浆处理。按照天根DP501试剂盒提取富集miRNA；按照天根KR211试剂盒反转录cDNA；按SYBRGreen荧光定量试剂盒-FP411说明书，采用实时荧光定量PCR仪进行检测。采用Δ循环阈值(Ct)法处理结果，计算目的基因的相对表达量，即2-ΔΔCt。基因引物序列见表1，扩增条件见表2。

Ⅰ型胶原的mRNA表达：取正常皮肤组织、增生性瘢痕组织，每60-70 mg组织用0.3 mL TRIzol于高速研磨仪匀浆，后加TRIzol试剂至1 mL完全裂解；收集裂解液，加入0.2 mL氯仿，大力振荡15 s，静置2 min；4 ℃下12 000×g离心15 min，取上清液，加入异丙醇0.6 mL，振荡15 s；4 ℃下12 000×g离心10 min，弃上清液，加入等体积的75%无水乙醇洗涤2遍；7 500×g离心5 min，弃上清液，静置风干至啫喱状，用15-30 μL双蒸水溶解RNA沉淀，用nanodrop2000测量总RNA浓度。使用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA。基因引物序列见表 1，扩增条件见表 2。

1.4.2 增生性瘢痕成纤维细胞的分离及培养取增生性瘢痕组织，用含3%双抗的PBS漂洗3次，用眼科剪剪为长宽高约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的组织块，放入10 cm培养皿中，加入含体积分数15%胎牛血清的高糖DMEM培养基。待细胞从组织块中爬出，移除组织块，加入含EDTA的胰蛋白酶1.5 mL消化两三分钟；加入3-5 mL含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基终止消化，1 000×g离心5 min，弃上清液，加入前述培养基重新悬浮细胞，置于37 ℃含体积分数5%二氧化碳的培养箱中恒温培养。待细胞生长至80%以上融合时，用EDTA-胰蛋白酶消化，并传代培养。倒置荧光显微镜下观察细胞形态，取第3-6代增生性瘢痕成纤维细胞细胞用于后续实验。同理，分离培养正常皮肤组织成纤维细胞。采用qRT-PCR检测两种皮肤组织成纤维细胞内miR-2116-3p的mRNA表达。

1.4.3 CCK-8法检测成纤维细胞的增殖活力将成纤维细胞按4×107 L-1的细胞浓度接种于96孔板中，每孔100 μL。将细胞分为阴性对照组、miR-2116-3p模拟物组和miR-2116-3p抑制物组，每组15孔。按照脂质体Lipo8000转染试剂说明书分别转染阴性对照(miR1N0000001-1-5)、miR-2116-3p模拟物(5′-CCU CCC AUG CCA AGA ACU CCC-3′)和miR-2116-3p抑制物(5′-CCU CCC AUG CCA AGA ACU CCC-3′)。转染后0，24，48，72 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，避光置于37 ℃、含体积分数5%CO2的培养箱中恒温培养1-1.5 h，用酶标仪测量450 nm波长处的吸光度值，按照CCK-8试剂说明书计算细胞活力。
1.4.4 EdU检测成纤维细胞的增殖活力取成纤维细胞，按5×104的细胞密度接种于20 mm共聚焦小皿中。将细胞分为阴性对照组、miR-2116-3p模拟物组和miR-2116-3p抑制物组，每组3皿。转染后48 h，依据 EdU检测说明书进行操作完后用激光共聚焦拍摄，计数绿色的细胞数(处于增殖期的增生性瘢痕成纤维细胞)和蓝色的细胞数(细胞核)，用绿色的细胞数/蓝色的细胞数的比值进行统计分析。
1.4.5 细胞划痕实验检测成纤维细胞迁移能力将成纤维细胞按1×105/孔的细胞密度接种于6孔板中，待细胞密度达到80%后，取 10 μL枪头在6孔板底垂直划线，用37 ℃预热的 PBS洗涤未贴壁的细胞，加入含有体积分数3%胎牛血清的DMEM高糖培养基，按1.4.3分组转染相应试剂后，立即在倒置相差显微镜下拍摄0 h图像，37 ℃培养箱中培养 24 h后观察并拍摄图像，通过Image J软件计算划痕面积。
1.4.6 流式细胞术检测成纤维细胞凋亡将成纤维细胞按1×108 L-1的细胞浓度接种于6孔板，每孔加2 mL完全培养基，按照1.4.3分组及处理。转染后24 h，加入5 μL膜联蛋白AV-FITC混匀后，避光室温孵育15 min，加入400 μL结合缓冲液悬浮细胞。用流式细胞仪分别测细胞凋亡比例，计算细胞凋亡率。
1.4.7 Western blot法检测成纤维细胞中相关蛋白表达将成纤维细胞按1×108 L-1的细胞浓度接种于6孔板中，每孔加2 mL完全培养基，按照1.4.3分组及处理，每组3孔。转染后24 h，使用细胞RIPA裂解液提取蛋白。取20 μg蛋白样品，Bis-Tris凝胶电泳，湿法转膜，快速封闭液封闭0.5 h。分别加入兔抗人Ⅰ型胶原、α-平滑肌肌动蛋白、Ⅲ型胶原和GAPDH一抗(稀释比：1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。加入二抗(稀释比：1∶10 000)，室温孵育1 h。采用 ECL显影，Biorad凝胶成像分析系统获取图像，采用ImageJ软件行灰度分析，分别计算Ⅰ型胶原、α-平滑肌肌动蛋白、Ⅲ型胶原蛋白灰度值与GAPDH蛋白灰度值的比值，计算各蛋白表达水平。
1.4.8 qRT-PCR检测成纤维细胞中相关基因表达将成纤维细胞按1×108 L-1的细胞浓度接种于6孔板中，每孔加2 mL完全培养基，按照1.4.3分组及处理，每组3孔。转染后24 h，使用细胞RIPA裂解液进行裂解，检测方法同1.4.1中Ⅰ型胶原的mRNA表达检测。引物序列与扩增条件见表1，2。
1.4.9 生物信息学网站预测miR-2116-3p与Ⅰ型胶原的靶向关系应用靶基因预测数据库 Targetscan(www.targetscan.org/vert_80/)预测miR-2116-3p和Ⅰ型胶原的潜在结合位点，选出与增生性瘢痕密切相关的Ⅰ型胶原作为研究对象。
1.4.10 双荧光素酶法检测miR-2116-3p与Ⅰ型胶原的靶向关系将增生性瘢痕成纤维细胞接种于24孔板上，将含有Ⅰ型胶原的突变型质粒(MT)和对照野生型质粒(WT)分别转染至增生性瘢痕成纤维细胞中，同时分别共转染miR-2116-3p阴性对照物和 miR-2116-3p模拟物。按照Lipo8000转染试剂说明书分别转染。转染后48 h，用荧光素酶报告基因检测试剂盒分别检测并计算荧光素酶和肾荧光素酶的数值，随后计算荧光素酶/肾荧光素酶比值。
1.5 主要观察指标 ①增生性瘢痕组织与正常皮肤组织中miR-2116-3p、Ⅰ型胶原的mRNA表达；②各组成纤维细胞的增殖与凋亡；③各组成纤维细胞中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及α-平滑肌肌动蛋白的蛋白与mRNA表达；④Targetscan预测miR-2116-3p的下游靶基因，双荧光素酶验证miR-2116-3p与Ⅰ型胶原的结合情况。
1.6 统计学分析使用软件 SPSS 25.0进行统计分析，数据均以x±s表示。两组间比较采用t检验，P < 0.05认为差异有显著性意义。文章统计学方法已经新疆医科大学统计学专家审核。

讨论

增生性瘢痕是一种皮肤纤维化疾病[14]，其发病机制尚不明确[11]，且无特效的治疗手段[1]。目前常见的增生性瘢痕治疗方案机制主要是抑制增生性瘢痕成纤维细胞的过度增殖、促进其凋亡，减少细胞外基质沉积、促进其降解吸收[2]。因此，为了寻找更好的治疗手段并取得更有效的治疗效果，需要更加深入研究增生性瘢痕的发病机制。近年来，miRNA在各种疾病中的作用机制是研究热点，多种miRNA被证明可以通过多种方式影响增生性瘢痕成纤维细胞的生物学功能[12，15-23]。研究发现miR-422a、miR2116-3p和miR-3187-3p在增生性瘢痕组织和增生性瘢痕成纤维细胞中表达下调，还提出了各自的CERNA网络并进行了生物信息学分析，表明这些网络与泛素化密切相关[12]。已有研究表明，Ⅰ型、Ⅲ型胶原在增生性瘢痕中明显表达增多[24]，且Ⅰ型、Ⅲ型胶原是细胞外基质的主要成分，抑制其表达可有效减少细胞外基质的沉积[25-30]。
此次研究发现，miR-2116-3p在增生性瘢痕中呈低表达，Ⅰ型胶原mRNA在增生性瘢痕中呈低表达，提示其在增生性瘢痕与正常皮肤中存在明显的表达差异，并可能与增生性瘢痕的发生发展有关；过表达miR-2116-3p后，增生性瘢痕成纤维细胞的增殖能力显著减弱，凋亡明显增加，Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α-平滑肌肌动蛋白的mRNA与蛋白表达减少；采用生物信息学网站 Targetscan预测发现，miR-2116-3p与Ⅰ型胶原mRNA存在靶向结合位点。双萤光素酶报告提示miR-2116-3p可直接结合于Ⅰ型胶原mRNA，靶向调控Ⅰ型胶原的表达与翻译，表明 miR-2116-3p与Ⅰ型胶原存在一定的负向调控关系；使用miR-2116-3p抑制物使miR-2116-3p表达降低后，增生性瘢痕成纤维细胞的增殖能力增加，凋亡明显减少，Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达增多，但Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α-平滑肌肌动蛋白的mRNA未见明显差异。综上所述，miR-2116-3p可下调Ⅰ型胶原的表达进而抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖，提示miR-2116-3p可能成为增生性瘢痕治疗的潜在防治靶点。
此次研究只探讨了miR-2116-3p与Ⅰ型胶原对增生性瘢痕增殖、迁移、凋亡的影响，还需进一步在动物模型中使用miR-2116-3p拮抗剂与激动剂[31]，或与泛素化深入研究miR-2116-3p与Ⅰ型胶原对增生性瘢痕的作用[12，32]；其中模拟物是双链RNA，抑制物是单链RNA，此次研究只设计了模拟物的阴性对照组，可再设置抑制物的阴性对照组以排除可能产生的假阳性结果；其中分组转染miR-2116-3p抑制物后Ⅰ型胶原蛋白呈高表达、而Ⅰ型胶原mRNA未见明显差异，考虑可能是由于miRNA 抑制剂是化学合成经特殊修饰的单链，通过特异性结合成熟miRNA分子发挥其作用，它并不是改变了目的miRNA的生成，或miR-2116-3p与增生性瘢痕成纤维细胞细胞外基质的蛋白沉积较基因更为相关。
此次研究揭示了增生性瘢痕成纤维细胞增殖的部分分子机制，为靶向调控 miR-2116-3p/Ⅰ型胶原相关分子来防治增生性瘢痕的发生发展提供一定的理论依据。未来可继续探寻增生性瘢痕的相关作用机制，以期为防治增生性瘢痕提供新的策略。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

miR-2116-3p在人增生性瘢痕中的表达及作用

Expression and effect of microRNA-2116-3p in human hypertrophic scar

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