松油烯4醇的抑菌性及促进MC3T3-E1细胞成骨分化作用

doi:10.12307/2023.545

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (25): 4006-4012.doi: 10.12307/2023.545

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松油烯4醇的抑菌性及促进MC3T3-E1细胞成骨分化作用

郭鹏达1，刘珂珂2，段昕1，刘朝辉1，张云涛1

1滨州医学院附属医院口腔科，山东省滨州市 256600；2周口市中心医院口腔科，河南省周口市 466099

收稿日期:2022-06-23 接受日期:2022-09-06 出版日期:2023-09-08 发布日期:2023-01-17
通讯作者: 张云涛，副教授，滨州医学院附属医院口腔科，山东省滨州市 256600
作者简介:郭鹏达，男，1994年生，山东省潍坊市人，汉族，在读硕士，主要从事口腔种植修复研究。

Terpinen-4-ol with antibacterial properties promotes osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells

Guo Pengda1, Liu Keke2, Duan Xin1, Liu Zhaohui1, Zhang Yuntao1

1Department of Stomatology, Binzhou Medical University Hospital, Binzhou 256600, Shandong Province, China; 2Department of Stomatology, Zhoukou Central Hospital, Zhoukou 466099, Henan Province, China

Received:2022-06-23 Accepted:2022-09-06 Online:2023-09-08 Published:2023-01-17
Contact: Zhang Yuntao, Associate professor, Department of Stomatology, Binzhou Medical University Hospital, Binzhou 256600, Shandong Province, China
About author:Guo Pengda, Master candidate, Department of Stomatology, Binzhou Medical University Hospital, Binzhou 256600, Shandong Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

松油烯4醇：是经化学萃取而得的一种植物活性成分，主要来源于茶树精油。茶树精油是一种气味清新、淡黄色至无色(萃取方式不同，颜色表现出不同深浅)、不溶于水的油性液体，研究表明茶树精油在抗菌、防腐、杀虫等方面表现出良好的活性，被广泛应用于各个领域。
种植体周围病变：又称种植体周组织炎症，是指发生于种植体周围软、硬组织的炎症损害，包括仅累及软组织的种植体周黏膜炎和累及种植骨床造成显著骨吸收的种植体周围炎。种植体周围炎如不及时治疗，将导致持续的骨吸收和种植体-骨界面的“去整合”，最终使种植体松动、脱落。种植体周围炎是影响牙种植远期效果导致种植体失败的主要原因之一。

背景：有研究发现，松油烯4醇对于种植体周围炎相关致病菌表现出明显的抑菌活性，当应用于钛种植体表面时能有效减少表面生物膜形成，降低种植体周围炎的发生，但是有关其生物安全性的研究不多。
目的：分析松油烯4醇对金黄色葡萄球菌、变异链球菌的抗菌效果，以及其对MC3T3-E1细胞生长与成骨分化的影响。
方法：将松油烯4醇以不同体积分数溶于二甲基亚砜中，检测松油烯4醇溶液对金黄色葡萄球菌和变异链球菌的最低抑菌浓度及最低杀菌浓度，并采用抑菌圈实验检测1/2最低抑菌浓度、最低抑菌浓度及最低杀菌浓度松油烯4醇的抗菌效果。以不同浓度(0%，0.3%，0.2%，0.1%，均为体积分数)松油烯4醇的培养基或钙化诱导液处理MC3T3-E1细胞，采用CCK-8实验检测细胞的增殖活性，罗丹明-鬼笔环肽染色观察细胞骨架，碱性磷酸酶活性实验检测细胞分化能力，茜素红染色观察矿化结节形成，RT-PCR 检测Runx2、骨钙素mRNA的表达。

结果与结论：①松油烯4醇溶液对变异链球菌的最低抑菌浓度为0.1%、最低杀菌浓度为0.4%，对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.03%、最低杀菌浓度为0.125%；随着浓度的增加，松油烯4醇溶液对两种细菌的抑菌圈直径增加(P < 0.05)；②CCK-8实验显示，松油烯4醇可促进MC3T3-E1细胞的增殖，其中以浓度0.2%组最明显；③罗丹明-鬼笔环肽染色显示，松油烯4醇可促进MC3T3-E1细胞的黏附；④碱性磷酸酶活性与茜素红染色显示，松油烯4醇均可促进MC3T3-E1细胞的早期分化与矿化，其中以浓度0.2%组最明显；⑤RT-PCR检测显示，钙化诱导1 d时，0.3%，0.2%，0.1%组Runx2 mRNA的表达高于0%组(P < 0.05)；钙化培养7，14 d时，0.2%，0.1%组Runx2、骨钙素mRNA的表达高于0.3%，0%组(P < 0.05)；⑥结果表明，松油烯4醇可以抑制金黄色葡萄球菌及变异链球菌的生长，促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化和矿化。

https://orcid.org/0000-0002-4432-9719(郭鹏达)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 松油烯4醇, 金黄色葡萄球菌, 变异链球菌, MC3T3-E1细胞, 骨钙素OCN, Runx2

Abstract: BACKGROUND: Terpinen-4-ol has been found to have a significant antibacterial activity against pathogenic bacteria associated with peri-implantitis and can reduce the formation of surface biofilm and the occurrence of peri-implantitis when applied to the surface of titanium implants; however, the studies regarding its biosafety are lacking.
OBJECTIVE: To explore the antibacterial effects of terpinen-4-ol on Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans and its effect on the growth and osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells.
METHODS: Different concentrations of terpinen-4-ol were dissolved in dimethyl sulfoxide. The minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration of pineolene 4 alcohol solution against Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans were tested. The 1/2 minimum inhibitory concentration, minimum inhibitory concentration, and minimum bactericidal concentration of pineolene 4 alcohol were tested by bacteriostatic zone test. MC3T3-E1 cells were treated with different concentrations (0%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, v/v) of terpinen-4-ol in medium or calcification-inducing solution. The proliferation activity of cells was detected by CCK-8 assay. Cells were stained with rhodamine-phalloidin to observe cytoskeleton. Differentiation ability of cells was detected by alkaline phosphatase activity assay. The formation of mineralized nodules was observed by alizarin red staining. The mRNA expression of Runx2 and osteocalcin was detected by real-time reverse transcription-polymerase chain reaction.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration of terpinen-4-ol against Streptococcus mutans were 0.1% (v/v) and 0.4% (v/v) respectively and against Staphylococcus aureus were 0.03% (v/v) and 0.125% (v/v) respectively. With the increase of the concentration of terpinen-4-ol, the diameter of bacteriostatic zone was significantly increased (P < 0.05). (2) CCK-8 assay showed that terpinen-4-ol promoted the proliferation of MC3T3-E1 cells, with the most obvious effects in the 0.2% group. (3) Rhodamine-phalloidin staining showed that terpinen-4-ol promoted the adhesion of MC3T3-E1 cells. (4) Alkaline phosphatase activity assay and alizarin red staining showed that terpinen-4-ol promoted the early differentiation and mineralization of MC3T3-E1 cells, with the most obvious effects in the 0.2% group. (5) Real-time reverse transcription-polymerase chain reaction showed that the mRNA expression of Runx2 was significantly higher in the 0.3%, 0.2%, and 0.1% groups than in the 0% group at 1 day of calcification induction (P < 0.05), and the mRNA expression of Runx2 and osteocalcin was significantly higher in the 0.2% and 0.1% groups than in the 0.3% and 0% groups at 7 and 14 days of calcification induction (P < 0.05). (6) These results indicate that terpinen-4-ol can inhibit the growth of Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans and promote the proliferation, differentiation and mineralization of MC3T3-E1 cells.

Key words: terpinen-4-ol, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, MC3T3-E1 cells, osteocalcin, Runx2

中图分类号:

郭鹏达, 刘珂珂, 段昕, 刘朝辉, 张云涛. 松油烯4醇的抑菌性及促进MC3T3-E1细胞成骨分化作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(25): 4006-4012.

Guo Pengda, Liu Keke, Duan Xin, Liu Zhaohui, Zhang Yuntao. Terpinen-4-ol with antibacterial properties promotes osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(25): 4006-4012.

图/表（结果） 10

2.1 松油烯4醇对两种细菌的最低抑菌浓度与最低杀菌浓度不同浓度松油烯4醇溶液对金黄色葡萄球菌与变异链球菌作用的吸光度值，见表2，3。

松油烯4醇对金黄色葡萄球菌和变异链球菌表现出不同程度的抑制作用，通过吸光度值法测得松油烯4醇对两种细菌的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度值，见表4。

2.2 松油烯4醇对金黄色葡萄球菌和变异链球菌的抑菌圈直径比较松油烯4醇浓度为1/2最低抑菌浓度、最低抑菌浓度、最低杀菌浓度时，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为0，(7.24±0.51)，(15.31±0.49) mm，对变异链球菌的抑菌圈直径分别为0，(6.89±0.44)，(18.29±0.81) mm，见图1。随着浓度的增大，最低杀菌浓度组抑菌圈直径大于最低抑菌浓度组(P < 0.05)。

2.3 CCK-8实验检测细胞增殖结果 1 d时，各组之间吸光度值比较差异无显著性意义(P > 0.05)；4 d时，各组间吸光度值比较差异有显著性意义(P < 0.05)，0.1%，0.2%，0.3%松油烯4醇组吸光度值大于0%松油烯4醇组(P < 0.05)，0.2%松油烯4醇组吸光度值大于0.1%，0.3%松油烯4醇组(P < 0.05)；7 d时，各组间吸光度值比较差异有显著性意义(P < 0.05)，0.2%，0.3%松油烯4醇组吸光度值大于0.1%松油烯4醇组(P < 0.05)，0.2%，0.3%松油烯4醇组吸光度值比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图2。

2.4 罗丹明-鬼笔环肽染色结果细胞培养24 h后，与0%松油烯4醇组相比，0.1%，0.2%，0.3%松油烯4醇组细胞黏附数量多，有较大的伸展范围，可见细胞完全伸展，体积增大，细胞框架和内部纤维走形清晰，见图3。

2.5 碱性磷酸酶活性检测结果细胞培养4 d时，各组之间碱性磷酸酶活性比较差异无显著性意义(P > 0.05)。培养7，14 d时，各组之间碱性磷酸酶活性比较差异有显著性意义(P < 0.05)，0.1%，0.2%，0.3%松油烯4醇组碱性磷酸酶活性大于0%松油烯4醇组(P < 0.05)，0.2%松油烯4醇组碱性磷酸酶活性大于0.3%，0.1%松油烯4醇组(P < 0.05)，见图4。

2.6 茜素红染色结果钙化诱导21 d后，与0%松油烯4醇组比较，0.1%，0.2%，0.3%松油烯4醇组钙化结节数目多且体积大，并且着色深，0.2%松油烯4醇组细胞钙化结节无论是在数量还是体积方面都较其他组表现出明显的优势，见图5。

2.7 RT-PCR检测结果见图6。

细胞钙化诱导1 d时，各组之间骨钙素 mRNA表达量比较差异无显著性意义(P > 0.05)；各组间Runx2 mRNA表达量比较差异有显著性意义(P < 0.05)，0.1%，0.2%，0.3%松油烯4醇组Runx2 mRNA表达量高于0%松油烯4醇组(P < 0.05)。7 d时，各组间骨钙素、Runx2 mRNA表达量比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，0.1%，0.2%，0.3%松油烯4醇组骨钙素、Runx2 mRNA表达量均高于0%松油烯4醇组(P < 0.05)，0.2%松油烯4醇组骨钙素、Runx2 mRNA表达量高于0.1%，0.3%松油烯4醇组(P < 0.05)。14 d时，各组间骨钙素、Runx2 mRNA表达量差异有显著性意义(P < 0.05)，0.1%，0.2%，0.3%松油烯4醇组骨钙素mRNA表达量高于0%松油烯4醇组(P < 0.05)，0.2%，0.1%松油烯4醇组骨钙素mRNA表达量高于0.3%松油烯4醇组(P < 0.05)；0.2%，0.1%松油烯4醇组Runx2 mRNA表达量高于0%，0.3%松油烯4醇组(P < 0.05)。

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引言

牙列缺损是影响当代中老年人的主要口腔问题。目前牙列缺损的治疗主要有以下3种方式：可摘局部义齿、口腔种植义齿或固定修复[1]。种植牙在舒适性和美观性方面较另外两种修复方式有明显优势，所以近十年来口腔种植修复技术被广泛应用于临床。种植体周围炎是口腔种植术后常见并发症[2-3]，临床表现及相关组织学变化和牙周病相似[4-5]，如植入物周围发红、探诊出血、深牙周袋等，病变晚期植入物周围牙槽骨吸收加重会导致种植体松动，甚至脱落[6]。目前认为，细菌生物膜是种植体周围炎发展和加剧的始动因素[7]，主要致病菌与天然牙牙龈炎或牙周炎周围菌群相似，包括牙龈卟啉单胞菌、血链球菌、变异链球菌等[8-9]。SALVI 等[10]研究显示，早期种植体周围炎中能检出金黄色葡萄菌，被证实是早期定植菌。目前种植体周围炎的治疗主要包括机械去除菌斑和抗菌含漱等[11]。氯己定是一种广谱抗生素类含漱液，在各种口腔急慢性感染中被广泛使用[12]，但长期使用会导致黏膜着色。有研究表明，氯己定存在一定的细胞毒性作用。所以在口腔种植体周围炎的治疗方面，亟待发掘和研究出抑菌效果更好、更无毒无害的抗菌产品。
松油烯4醇是经化学萃取而得的一种植物活性成分，主要来源于茶树精油。松油烯4醇常温下为黄色透明液体，易挥发，有特殊宜人的香味，具有多种如抗氧、抗菌、驱虫、杀螨作用。含松油烯4醇的植物种类很多，其自然资源极为丰富，便于直接开发利用[13]。研究表明茶树精油在抗菌、防腐、杀虫等方面表现出良好的活性，被广泛应用于各个领
域[14-15]。RIPARI实验团队[16]将茶树精油以漱口水的形式使用，与含0.12%氯己定的漱口水进行比较，结果表明茶树精油组的菌斑指数、探诊出血指数和探诊深度较氯己定组有明显改善；此外，茶树精油组未发现黏膜着色和味觉改变，而氯己定组中20%的人表现出医源性牙齿着色，表明茶树精油在有效减轻牙龈炎症的同时展现出较小的不良反应。NOUMI等[17]研究发现，松油烯4醇对牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌具有明确的抑菌效果，且最低抑菌浓度为0.06%(体积分数)，最低杀菌浓度为0.24%(体积分数)。基于以往文献研究，松油烯4醇对于种植体周围炎相关致病菌表现出明显的抑菌活性[18]，当应用于钛种植体表面时能有效减少表面生物膜形成[18-19]，降低种植体周围炎的发生，但是有关其生物安全性的研究不多。因此，此次实验将口腔常见致病菌变异链球菌和具有强大成膜作用的金黄色葡萄球菌作为目的菌株，通过测定出松油烯4醇的最小抑菌浓度后进行细胞实验，研究松油烯4醇是否具有细胞毒性作用，为种植体周围炎药物治疗提供进一步的理论支持和参考。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞观察实验，采用单因素方差分析进行组间比较，LSD-t检验进行两两比较。
1.2 时间及地点实验于2021年10月至2022年4月在滨州医学院完成。
1.3 材料
1.3.1 实验菌株与细胞变异链球菌(UA159)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)(青岛大学实验室赠送)；MC3T3-E1细胞(四川大学实验室赠送)。
1.3.2 实验试剂松油烯-4-醇(麦克林)；二甲基亚砜、荧光定量PCR试剂盒(索莱宝)；PBS、胰蛋白酶、青霉素/链霉素(美仑，大连)；LB培养基、琼脂粉、BHI培养基(海博生科)；定性滤纸(直径7 cm)中速、维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠(Sigma公司，美国)；DEPC水(Amresco公司，美国)；胎牛血清(Gibco公司，美国)；α-MEM 培养基(Hyclone 公司，美国)；CCK-8检测试剂盒(同仁，美国)；碱性磷酸酶检测试剂盒、Western及IP细胞裂解液(碧云天)；氯仿(福辰试剂公司，天津)；反转录试剂盒、总RNA 提取试剂(RNAiso Plus) (TaKaRa 公司，日本)；PCR引物(生工，上海)；茜素红S染液(Solarbio)、罗丹明标记的鬼笔环肽(Cytoskeleton公司，美国)。
1.3.3 实验设备厌氧产气袋、厌氧培养袋(Amresco公司，美国)；超净台(安泰空气技术公司)；CO2培养箱、-80 ℃超低温冰箱(Thermo Fisher Scientific公司，美国)；超纯水装置(莱特莱德)；电子天平(精宏有限公司)；-20 ℃ 冰箱、4 ℃冰箱(海尔，中国)；高压灭菌锅(新华医疗器械公司，山东)；96孔板、麦氏比浊管、培养皿(康泰生物，温州)；0.22 μm滤器(Millpore)；多功能酶标仪(SpectraMax M2，MolecuLar Devices公司，美国)；恒温水浴锅(国华电器有限公司)；制冰机(惠康电器，中国)；荧光实时定量聚合酶链反应仪(Corbett公司，澳大利亚)；通用型台式离心机(Eppendorf公司)；细胞计数板(镇江医疗用品厂)；细胞培养瓶、6孔板、24孔板(Coming公司，美国)；倒置显微镜(Olympus公司，日本)；0.22 μm滤器(美仑，大连)。
1.4 实验方法
1.4.1 细菌培养分别将金黄色葡萄球菌与变异链球菌接种于培养皿中，倒置于CO2培养箱(37 ℃)中培养48 h，分别挑取单菌落至LB、BHI培养基中，培养至对数生长期，取出菌悬液，用等渗生理盐水稀释成浓度为1×106 CFU/mL备用。
1.4.2 测定松油烯4醇对两种菌株的最低抑菌浓度、最低杀菌浓度设定松油烯4醇溶液(溶剂为二甲基亚砜)初始最大浓度为0.8%(体积分数)，用二倍液稀释法将其稀释成如下10个浓度：对于金黄色葡萄球菌，每孔浓度分别为：4%，2%，1%，0.5%，0.25%，0.125%，0.06%，0.03%，0.015%，0.007%；对于变异链球菌，每孔浓度分别为：0.8%，0.4%，0.2%，0.1%，0.05%，0.025%，0.012 5%，0.006%，0.003%，0.001 5%。空白对照组为无菌水。取96孔板，每孔加入100 μL不同浓度的松油烯4醇溶液或无菌水，每组8个复孔。铺设完毕后，加入1×106 CFU/mL的菌悬液后混匀，每孔100 μL。采用酶标仪测定630 nm波长下的初始吸光度值后置于培养箱中，分别在两种菌株适宜条件下培养24 h，再次测定吸光度值，最低抑菌浓度记为吸光度值变化小于0.05的最低浓度。对大于最低抑菌浓度的剩余各组每组吸取10 μL溶液，稀释100倍后取20 μL在培养皿上均匀涂布，标记后倒置于培养箱培养24 h，观察培养皿表面完全无任何菌落形成，记此时的药物最低浓度为最低杀菌浓度。重复3次，取平均值。
1.4.3 抑菌圈实验根据对两种细菌不同的最低抑菌浓度值，分别以1/2最低抑菌浓度、最低抑菌浓度、最低杀菌浓度制备样品两组。置于已经进行分区标记的含菌液培养皿表面，培养24 h后，观察记录抑菌圈直径。重复实验3次。
1.4.4 细胞培养 MC3T3-E1细胞的培养基为完全培养基，成分为含体积分数10%胎牛血清、1%链霉素-青霉素溶液的α-MEM 培养基，细胞复苏后传代3次，进行后续实验。
1.4.5 CCK-8实验检测细胞增殖将处于对数生长期的MC3T3-E1细胞以 3×107 L-1的细胞浓度接种于96孔板，每孔100 μL，培养 24 h细胞贴壁后，更换为含0%，0.1%，0.2%，0.3%松油烯4醇的完全培养基，每组5复孔。培养 1，4，7 d 后，按照CCK-8试剂盒说明进行细胞增殖检测。
1.4.6 罗丹明-鬼笔环肽染色检测细胞黏附将处于对数生长期的MC3T3-E1细胞以2×107 L-1的细胞浓度接种于24孔板，制作细胞爬片，毎孔1 mL。24 h细胞贴壁后，更换为含0%，0.1%，0.2%，0.3%松油烯4醇的完全培养基，每组3复孔。温箱培育24 h后，吸去培养液，用PBS清洗3次，40 g/L多聚甲醛固定10 min，PBS清洗3次，每次10 min。取含体积分数1%胎牛血清的PBS，配制罗丹明-鬼笔环肽工作液(100 nmol/L)250 μL，覆盖小皿中央观察区域细胞，室温避光孵育 30 min，PBS冲洗3次，每次5 min，使用含体积分数1%胎牛血清的PBS配制DAPI工作液(200 nmol/L)，每皿加入250 μL。染色30 s，PBS洗2次，封固后在激光共聚焦显微镜下观察。
1.4.7 碱性磷酸酶活性检测细胞早期分化将处于对数生长期的MC3T3-E1细胞以5×107 L-1的细胞浓度接种于6孔板，每孔加入1 mL。24 h 细胞贴壁后，更换为含0%，0.1%，0.2%，0.3%松油烯4醇的钙化诱导液，钙化诱导液成分为含体积分数10%胎牛血清、1%双抗溶液、50 mg/L维生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、1×10-8 mol/L地塞米松的α-MEM培养基，每组3复孔。培养4，7，14 d时，弃原培养液，每孔加入细胞裂解液200 μL充分裂解，收集细胞，25 000 r/min离心30 min后取上清液，按说明书进行操作，使用酶标仪测定405 nm波长下的吸光度值(A值)。
1.4.8 茜素红染色检测细胞矿化将处于对数生长期的MC3T3-E1细胞以5×107 L-1的细胞浓度接种于6孔板，每孔加入1 mL。24 h 细胞贴壁后，更换为含0%，0.1%，0.2%，0.3%松油烯4醇的钙化诱导液。培养21 d后，茜素红染色后光镜下观察细胞矿化。

1.4.9 RT-PCR检测各组细胞骨钙素、Runx2 mRNA的表达将处于对数生长期的MC3T3-E1细胞以5×107 L-1的细胞浓度接种于6孔板，每孔加入1 mL。24 h 细胞贴壁后，更换为含0%，0.1%，0.2%，0.3%松油烯4醇的钙化诱导液。培养1，7，14 d后，按照总RNA提取试剂盒的说明提取总RNA，用紫外-可见光分光光度计测定提取的总RNA纯度，经测定得各组的A260∶A280 值均为 1.8-2.1。用反转录试剂盒合成 cDNA。目的基因引物及内参 GAPDH 由上海生工生物公司合成(表1)，根据SYBR Premix Ex Taq说明选择 20 μL 体系进行Q-PCR反应，反应条件为 95 ℃预变性 30 s，1 个循环；95 ℃变性5 s，60 ℃退火 30 s，45 个循环。绘制荧光信号熔解曲线分析，实时定量反转录聚合酶链反应结果用荧光阈值表示；依据公式(2-∆∆Ct) 计算目的基因表达量。

1.5 主要观察指标松油烯4醇对金黄色葡萄球菌与变异链球菌的抑制效果，以及对MC3T3-E1细胞增殖与成骨分化的影响。

1.6 统计学分析采用SPSS 22.0统计分析软件进行数据处理，检验各组数据均符合正态分布，结果用x±s表示。用单因素方差分析进行组间比较，LSD-t检验进行两两比较，P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经滨州医学院附属医院生物统计学专家审核。

讨论

口腔种植修复迅猛发展，与传统修复相比在美观性和舒适性方面有较大的优势[20]。种植体周围炎是口腔种植术后常见并发症，其发病原因、临床表现与天然牙的牙周病相似，主要表现为牙龈红肿、探诊出血、牙槽骨吸收等，病变晚期会导致种植体松动甚至脱落[21-22]。细菌生物膜是种植体周围炎发生和发展的始动因素。同时，口腔卫生不佳、高血糖、吸烟、牙周病史等局部和全身因素亦能加重种植体周围炎的发生与发展 [23-24]。目前种植体周围炎的治疗方式主要包括机械去除菌斑和抗菌含漱液等[25-26]，而临床常用的氯己定含漱液属于广谱抗生素[27]，长期使用会产生耐药性，不利于口腔微生态环境的稳定且极易导致口腔黏膜及牙齿着色[28]。
松油烯4醇是一种化学萃取得到的植物活性成分，主要来源于茶树精油，其在抗菌、防腐、杀虫等方面表现出良好的活性。研究表明松油烯4醇作为一种植物提取物，应用时不易产生耐药性，且其在抑制细菌生物膜的形成方面也有良好的效果[29-30]，主要机制是其可有效破坏细胞膜的完整性、减少细菌聚集、降低生物膜厚度和抑制生物膜的形成。此次实验从松油烯4醇的抑菌活性出发，通过对金黄色葡萄球菌和变异链球菌的抑菌实验得出松油烯4醇的最低抑菌浓度，并将其应用于细胞实验，观察它的细胞毒性作用，旨为种植体周围炎的药物治疗提供新的方向。
通过实验得出松油烯4醇对两种细菌的最低抑菌和最低杀菌浓度值，发现金黄色葡萄球菌的值较变异链球菌明显偏小，说明金黄色葡萄球菌对松油烯4醇较为敏感。松油烯4醇与青霉素结合蛋白2a(PBP2a)之间存在某种关联，PBP2a是参与金黄色葡萄球菌对β-内酰胺类药物耐药的主要分子之一，因为它与β-内酰胺类药物亲和力低，而且其转肽酶活性允许细胞壁生物合成；而松油烯4醇可有效锚定PBP2a的酶活性部位，从而达到抑制金黄色葡萄球菌生长的作用[31]。
此次实验通过观察1/2最低抑菌浓度、最低抑菌浓度、最低杀菌浓度下的抑菌圈直径发现，当浓度小于最低抑菌浓度(即浓度为1/2最低抑菌浓度)时松油烯4醇达不到抑菌效果；随着浓度增高至最低杀菌浓度时，松油烯4醇对两种细菌的抑菌圈直径都明显增大，与最低抑菌浓度组相比差异具有统计学意义。CCK-8实验结果显示，0.1%，0.2%，0.3%松油烯4醇组对MC3T3-E1细胞的增殖总体表现为促进趋势，细胞培养第7天时，0.2%松油烯4醇组促进作用大于0.1%，0.3%松油烯4醇组，并确定松油烯4醇对MC3T3-E1细胞增殖的最佳促进浓度。罗丹明荧光染料标记显示，细胞培养24 h后，0.1%，0.2%，0.3%松油烯4醇组肌动蛋白骨架较0%松油烯4醇组有更清晰的走行，细胞形态和连接与0%松油烯4醇组相比也更明显，细胞密度也更大，这与CCK-8实验检测结果结果一致。碱性磷酸酶活性检测结果显示，细胞培养7，14 d时，0.1%，0.2%，0.3%松油烯4醇组碱性磷酸酶活性明显高于空0%松油烯4醇组，且0.2%松油烯4醇组碱性磷酸酶活性最高，说明松油烯4醇可以促进MC3T3-E1细胞的早期分化。将钙化诱导21 d的细胞进行固定染色，镜下观察拍照发现细胞钙化结节大且颜色深数量多。推测一定浓度的松油烯4醇可以促进成骨细胞的早期分化和钙化。
种植体在口腔内存活的关键取决于种植体与牙槽骨的骨结合能力，研究表明想要获得理想的骨结合，除了种植早期稳定减少负重之外，牙槽骨的生长和改建也尤为重要[32-33]。
在骨生长和改建过程中有多重成骨及破骨基因的参与，Runx2是成骨分化中的关键调节因子，因其具有BTU(基本转录单位Basic Transcript Unit)结构，在成骨分化过程中可以直接调控其他成骨相关基因的表达[34-35]。骨钙素是一种主要用于调节骨钙代谢的糖蛋白[36]，由于其主要由成骨细胞和一些增生的软骨细胞合成，所以现在实验将其作为是研究骨代谢的一项新的生化标志物[37]。此次实验通过测定不同时间点Runx2和骨钙素两种标志物mRNA的表达[38]，以此研究松油烯4醇对MC3T3-E1细胞成骨能力的影响。实验结果显示，Runx2 mRNA表达量在1 d和7 d时较高，14 d表达量下降；且0.1%，0.2%松油烯4醇组细胞Runx2 mRNA表达量较其余两组高。查阅文献发现，Runx2是成骨细胞开始分化的标志，这也解释了为什么在细胞培养早期Runx2高表达。骨钙素随着细胞培养时间的增加表达量增加，第14天表达量达到最高，且0.2%松油烯4醇组细胞骨钙素较其他组也表现出高表达量。研究表明，骨钙素主要分布在成骨细胞分化末期，可以与Ca2+结合以调节钙离子稳态和骨骼钙化。此次实验结果提示，松油烯4醇可以促进MC3T3-E1细胞Runx2和骨钙素 mRNA 的表达，说明松油烯4醇在成骨细胞分化方面起到了一定的促进作用，但具体机制还需要后续实验继续探索。
种植体周围炎是一种细菌感染性疾病，单纯靠机械清除很难彻底治愈，它虽然与牙周病的致病菌及临床表现类似，但是在治疗过程中还要注意保护种植体和周围组织尤其是骨组织之间的结合不被破坏。用于种植体周围炎治疗的药需要表现出非常小的毒副作用，尤其是对成骨细胞，而临床常用的广谱抗生素大多数被报道有轻度细胞毒性。近年来对于天然药物及材料的研究层出不穷，一大批植物提取药、中成药也被报道具有抗菌抗炎效果，应用于临床可以有效缓解抗生素滥用、耐药菌泛滥的情况。松油烯4醇被证实具有良好的抗菌、抗炎作用[39-40]，作为植物提取物在应用过程中相对安全。此次实验结果发现，松油烯4醇可以抑制金黄色葡萄球菌和变异链球菌的生长，并且对MC3T3-E1细胞的增殖和分化具有促进作用。
结论：此次实验旨在研究松油烯4醇对金黄色葡萄球菌、变异链球菌的抑菌作用，并评价最低抑菌浓度下松油烯4醇对MC3T3-E1细胞增殖和分化的影响，从而为种植体周围炎的药物治疗提供新的设想与证据。实验结果显示：松油烯4醇可以抑制金黄色葡萄球菌和变异链球菌的生长，且对变异链球菌的最低抑菌浓度为0.1%、最低杀菌浓度为0.4%，对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.03%、最低杀菌浓度为0.125%；松油烯4醇无细胞毒性且能促进MC3T3-E1细胞增殖；松油烯4醇能促进MC3T3-E1细胞的分化、钙化结节形成以及相关成骨基因的表达。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

松油烯4醇的抑菌性及促进MC3T3-E1细胞成骨分化作用

Terpinen-4-ol with antibacterial properties promotes osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells

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