精准靶向CD24高表达三阴性乳腺癌细胞纳米递送系统的制备及体外验证

doi:10.12307/2023.452

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (25): 4013-4019.doi: 10.12307/2023.452

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精准靶向CD24高表达三阴性乳腺癌细胞纳米递送系统的制备及体外验证

周瑜清1，2，李金穗2，3，陈宇1，2，陈茂山4，侯令密2，3，王东生4，蒲卢兰1，2，邓世山2，周方方1，2

1川北医学院基础医学与法医学院解剖教研室，四川省南充市 637000；川北医学院附属医院，2乳腺癌生物靶向研究室院士工作站，3甲状腺乳腺外科，四川省南充市 637000；4重庆医科大学附属遂宁市中心医院内分泌乳腺外科，四川省遂宁市 629000

收稿日期:2022-04-13 接受日期:2022-06-22 出版日期:2023-09-08 发布日期:2023-01-17
通讯作者: 周方方，硕士，讲师，川北医学院基础医学与法医学院解剖教研室，四川省南充市 637000 邓世山，博士，教授，川北医学院附属医院乳腺癌生物靶向研究室院士工作站，四川省南充市 637000
作者简介:周瑜清，女，1998年生，陕西省咸阳市人，汉族，川北医学院基础医学与法医学院在读硕士，主要从事乳腺癌发病机制及治疗的研究。李金穗，女，1983年生，四川省南充市人，汉族，硕士，主治医师，主要从事乳腺癌发病机制及治疗的研究。
基金资助:
南充市2020年市校科技战略合作专项(川北医学院)资金(20SXCXTD0001)，项目负责人：侯令密；四川省中医药管理局科研项目(2020JC0055)，项目负责人：侯令密；南充市科技局市校科技战略合作项目(20SXQT0052)，项目负责人：周方方；川北医学院2022年开放创新实验项目(SY22-060)，项目负责人：周方方；川北医学院附属医院2022年科研发展计划项目(2022JC004)，项目负责人：李金穗

Preparation and in vitro validation of nanotransmission system for accurate targeting of CD24 high-expression triple negative breast cancer cells

Zhou Yuqing1, 2, Li Jinsui2, 3, Chen Yu1, 2, Chen Maoshan4, Hou Lingmi2, 3, Wang Dongsheng4, Pu Lulan1, 2, Deng Shishan2, Zhou Fangfang1, 2

1Department of Anatomy, School of Basic Medicine and Forensics, North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China; 2Biological Targeting Laboratory of Breast Cancer, Academician (Expert) Workstation, Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China; 3Department of Breast and Thyroid Surgery, Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China; 4Department of Breast and Thyroid Surgery, Affiliated Suining Central Hospital of Chongqing Medical University, Suining 629000, Sichuan Province, China

Received:2022-04-13 Accepted:2022-06-22 Online:2023-09-08 Published:2023-01-17
Contact: Zhou Fangfang, Master, Lecturer, Department of Anatomy, School of Basic Medicine and Forensics, North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China; Biological Targeting Laboratory of Breast Cancer, Academician (Expert) Workstation, Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China Deng Shishan, PhD, Professor, Biological Targeting Laboratory of Breast Cancer, Academician (Expert) Workstation, Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China
About author:Zhou Yuqing, Master candidate, Department of Anatomy, School of Basic Medicine and Forensics, North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China; Biological Targeting Laboratory of Breast Cancer, Academician (Expert) Workstation, Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China Li Jinsui, Master, Attending physician, Biological Targeting Laboratory of Breast Cancer, Academician (Expert) Workstation, Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China; Department of Breast and Thyroid Surgery, Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China
Supported by:
the City and School Cooperation Innovation Team Project of Nanchong in 2020, No. 20SXCXTD0001 (to HLM); the Administration of Traditional Chinese Medicine Scientific Research Project of Sichuan Province, No. 2020JC0055 (to HLM); the Municipal School Science and Technology Strategic Cooperation Project of Nanchong Municipal Science and Technology Bureau, No. 20SXQT0052 (to ZFF); 2022 Open Experimental Project of North Sichuan Medical College, No. SY22-060 (to ZFF); 2022 Scientific Research and Development Program of Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, No. 2022JC004 (to LJS)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

铁死亡：是一种铁依赖性的脂质过氧化积累所致的程序性死亡，有着独特的形态学和生物化学特征，不同于凋亡、坏死、自噬等细胞死亡方式。研究发现，铁死亡激动剂Erastin在多种肿瘤细胞中表现出活跃的致死性，可非常有效地激活铁死亡途径，从而抑制肿瘤生长与发展。
乳腺癌：是全球女性最为常见的恶性肿瘤，其中三阴性乳腺癌是最具侵袭性的乳腺癌亚型，具备高复发风险和较差预后的特性。化疗为主要的辅助治疗手段，但极易产生耐药性，预后仍是难题。

背景：纳米技术与医学的结合在选择性靶向及治疗肿瘤领域开辟了一条全新的道路，通过应用纳米载体确保了装载药物的靶向递送与稳定性，增强了细胞摄取和生物相容性。
目的：制备一种谷胱甘肽和pH值双响应性CD24适配体修饰的载铁死亡激动剂Erastin和双质粒的纳米药物递送系统PC(coBP)Ca，探讨其在体外对三阴性乳腺癌中CD24高表达细胞的精准靶向性和可行性。
方法：PEG-CAPDB经过多次聚合反应生成纳米微球骨架COOH-PEG-CPADB-[co BMA co PDSMA]，再通过自组装合成内载铁死亡激动剂Erastin、1-2M2ge化合物、NF2敲除质粒和YAP过表达质粒形成PC(coBP)，利用SELEX技术筛选CD24适配体，进一步修饰PC(coBP)，最终形成载药纳米微球PC(coBP)Ca。检测PC(coBP)Ca表面CD24适配体修饰、对谷胱甘肽和pH值的敏感性、逃逸免疫细胞吞噬的性能及靶向性能、逃逸溶酶体吞噬和药物突释性能及对吞噬细胞吞噬作用的影响。

结果与结论：PC(coBP)Ca的平均粒径为(141.11±13.43) nm，平均多分散性指数为0.353±0.074，平均Zeta电位显示良好分散性；PC(coBP)Ca中铁死亡激动剂Erastin的平均载药量为(23.34±2.45)%、包封率为(90.24±3.11)%；PC(coBP)Ca在谷胱甘肽和pH值双重响应作用下的4 h释放量约为90%，可有效逃避免疫细胞吞噬精准靶向CD24高表达三阴乳腺癌细胞，逃逸溶酶体，达到药物突释，激活铁死亡途径和促进吞噬细胞吞噬。实验成功合成载药纳米微球PC(coBP)Ca具备精准、有效、安全和低毒性的特点，有望成为三阴乳腺癌中CD24高表达细胞靶向纳米药物递送系统。

https://orcid.org/0000-0001-5842-5819(周瑜清)；https://orcid.org/0000-0001-9505-5474(李金穗)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 三阴乳腺癌, 纳米递送系统, 铁死亡, CD24, 靶向给药, 谷胱甘肽

Abstract: BACKGROUND: The combination of nanotechnology and medicine has opened up a new path in the field of selective targeting and tumor treatment. Through the application of nano carriers, the targeted delivery and stability of loaded drugs are ensured, and the cell uptake and biocompatibility are enhanced.
OBJECTIVE: To prepare a glutathione and pH double-responsive CD24 aptamer-modified nanodrug delivery system PC (coBP) Ca for ferroptosis agonists Erastin and biplasmids and to investigate its precise targeting and feasibility of CD24 highly expressed cells in triple negative breast cancer in vitro.
METHODS: PEG-CAPDB underwent multiple polymerization reactions to form a nanosphere skeleton called: COOH-PEG-CPADB-[co BMA co PDSMA], and then PC (coBP) formation by self-assembling synthesis of the internally loaded ferroptosis agonist Erastin, 1-2M2ge compound, NF2 knockout plasmid and YAP overexpressed plasmid. SELEX technology was used to screen CD24 aptamers to further modify PC (CoBP). Nano-drug delivery system PC (coBP) Ca was eventually formed. The effects of CD24 aptamer modification on the surface of PC(coBP)Ca, sensitivity to glutathione and pH, phagocytosis and targeting properties of immune cells escaping, lysosomal escaping phagocytosis and drug burst release properties, and phagocytosis of phagocytes were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: The average particle size of PC (coBP) Ca was (141.11±13.43) nm. The average polydispersity index was (0.353±0.074). The average Zeta potential showed good dispersibility. The average drug loading of Erastin was (23.34±2.45)%. The encapsulation rate of PC (coBP) Ca was (90.24±3.11)%, and the 4-hour release was about 90% under the dual response system of glutathione and pH, which could effectively evade immune cell phagocytosis to accurately target CD24 highly expressed triple negative breast cancer, escape lysosomes, then achieve drug release, which activates the ferroptosis pathway and promotes phagocyte phagocytosis. The successful synthesis of nano-delivery system PC (coBP) Ca has the characteristics of precision, effectiveness, safety and low toxicity, and is expected to become a CD24 high-expression cell-targeted nano-delivery system in triple negative breast cancer.

Key words: triple negative breast cancer, nano-delivery system, ferroptosis, CD24, targeted drug delivery, glutathione

中图分类号:

周瑜清, 李金穗, 陈宇, 陈茂山, 侯令密, 王东生, 蒲卢兰, 邓世山, 周方方. 精准靶向CD24高表达三阴性乳腺癌细胞纳米递送系统的制备及体外验证[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(25): 4013-4019.

Zhou Yuqing, Li Jinsui, Chen Yu, Chen Maoshan, Hou Lingmi, Wang Dongsheng, Pu Lulan, Deng Shishan, Zhou Fangfang. Preparation and in vitro validation of nanotransmission system for accurate targeting of CD24 high-expression triple negative breast cancer cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(25): 4013-4019.

图/表（结果） 4

2.1 PC(coBP)Ca的表征 PC(coBP)Ca具有亲水基为壳、疏水基为核的结构特点，在透射电子显微镜下表现为规则均匀的球形结构，边缘具有模糊的絮状外观，并且链霉亲和素磁珠实验结果表明，溶液离心后出现明显分层，CD24适体成功地修饰到纳米微球PC(coBP)表面以形成载药纳米微球PC(coBP)Ca(图1A、B)。马尔文纳米粒子测试仪检测结果显示，PC(coBP)Ca的平均粒径为(141.11±13.43) nm，多分散性指数为0.371±0.054(图1C)，Zeta电位呈负电位(图1D)，表明PC(coBP)Ca总体上分散度良好，分布均匀。PC(coBP)具有光滑的表面(图1E)，平均粒径为(127.67±17.52) nm，多分散性指数为0.353±0.074(图1F)，Zeta电位呈现正电位(图1G)。

2.2 PC(coBP)Ca的载药量及包封率通过琼脂糖凝胶电泳检测YAP_OV和NF2_KO质粒包封率的结果表明，当AP_OV∶NF2_KO∶PC(coBP)的比例为1∶1∶3时，包裹效率最佳，见图2A。同样，在此摩尔比时，高效液相色谱仪测得PC(coBP)Ca的铁死亡激动剂Erastin平均载药量为(23.34±2.45)%，平均包封率为(90.24±3.11)%。
2.3 PC(coBP)Ca的药物突释在谷胱甘肽和pH值双重反应引擎下，负载药物在短时间内快速释放。当PC(coBP)Ca处于高水平谷胱甘肽溶液中时，透射电镜图像显示纳米微球结构出现不规则变化，出现聚集现象(图2H)。当PC(coBP)Ca处于酸性pH值(< 6.8)条件下，化合物1-2M2ge发生电离平衡反应，诱导大量二氧化碳生成(图2E、F)，透射电镜图像表明载药纳米微球PC(coBP)Ca的结构受损，不规则且多孔(图2F、G)。Q-PCR结果显示，MDA-MB-231细胞中有效敲低NF2和过表达YAP(图2B、C)，Western Blot结果也提示NF2敲低效率和YAP效率与Q-PCR结果一致(图2D)。琼脂凝胶电泳和紫外分光光度计结果提示，YAP_OV和NF2_KO质粒与铁死亡激动剂Erastin高效快速的释放(图2I、J)，证明了谷胱甘肽和pH值响应为药物突释提供了双重保障。

2.4 PC(coBP)Ca有效逃逸免疫细胞吞噬激光共聚焦显微镜结果显示，PC(coBP)Ca无论是与单核细胞还是中性粒细胞均表现为同性相斥，很好地避免了免疫细胞的吞噬，见图3A。
2.5 PC(coBP)Ca具精准靶向性对PC(coBP)Ca的靶向性能测定结果表明，与PC(coBP)相比，PC(coBP)Ca精准有效地靶向了MDA-MB-231细胞，见图3B。
2.6 PC(coBP)Ca逃逸溶酶体吞噬激光共聚焦显微镜见FITC标记的两组纳米微球：PC(coBP)Ca_(1M+FITC)组与Lyso tracker然为红色的溶酶体没有发生重叠，绿色荧光的纳米微球与红色荧光的溶酶体清晰分离；PC(coBP)Ca_(FITC)组Merge图像显示绿色荧光的纳米微球与红色荧光的溶酶体重叠为黄色荧光，见图3C，说明溶酶体将纳米微球吞噬。溶酶体逃逸实验结果显示，化合物1-2M2ge基于pH值响应可有效避免溶酶体对微球的吞噬。

2.7 PC(coBP)Ca促进巨噬细胞吞噬作用由于微球表面的CD24适配体可结合三阴乳腺癌细胞的膜受体CD24(图4A、B)，NF2敲除联合YAP过表达可降低膜表面CD24及CD47的表达，避免MDA-MB-231细胞发生逃逸，从而促进巨噬细胞的吞噬，并且流式细胞技术检测和免疫荧光实验结果一致(图4C、D)。

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引言

材料方法

1.1 设计观察性实验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。
1.2 时间及地点实验于2019年9月至2022年1月在川北医学院附属医院乳腺癌生物靶向研究室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验材料与试剂铁死亡激动剂Erastin(美国 Selleck)；PEG-CPADB、EDC碳二酰亚胺盐酸盐、偶氮二甲氧基异庚腈V70、环偶氮脒类引发剂V501、PDSMA(美国 Sigma)；氨基聚乙二醇羧基NH2-PEG-COOH、甲基丙烯酸丁酯、二硫苏糖醇(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(西安凯新生物科技有限公司)；链霉亲和素磁珠(苏州海狸纳米科技有限公司)；IQ SYBR Green Supermix试剂盒(Takara，日本)；人外周血中性粒细胞分离试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；CCK8细胞增殖检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；CD24、CD47、CD11b、YAP、NF2抗体(Abcam)；NF2_KO(NF2敲低质粒)、YAP_OV(YAP过表达质粒)、1，2-二羰基化合物1-2M2ge化合物均为课题组前期制备；CD24高表达三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231细胞系)(中国科学院细胞库)；人外周血单核细胞和中性粒细胞由川北医学院附属医院提供，通过川北医学院附属医院医学伦理委员会审核，符合科研项目伦理审查。
1.3.2 实验仪器马尔文纳米粒子测试仪(美国 Malvern)；紫外分光光度计(UV23600，日本Shimadzu)；电子透射显微镜TEM(H7500，日本 Hitachi)；激光共聚焦显微镜(A1R，日本Nikon)；流式细胞仪(FACS Vantage，美国Becton Dickinson)；核磁共振分析仪(Fourier 80，德国)；高效液相色谱(Thermo Fisher Scientific，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 载药纳米递送系统PC(coBP)Ca的制备取纯化过的去离子水2 mL至烧杯中，称取50 mg的CPADB、2 mg的碳二酰亚胺盐酸盐和2 mg的N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐，缓慢搅拌30 min活化羧基，然后加入40 g NH2-PEG-COOH，接着缓慢搅拌10 min，2 mol/L盐酸溶液调节pH值于弱酸性，充分溶解30 min后生成中间产物COOH-PEG-CPADB；向中间产物COOH-PEG-CPADB溶液中加入4 mL无水二氧六环、5 mL 甲基丙烯酸丁酯和5 mg环偶氮脒类引发剂V501，使用隔膜密封反应6 h，再添加N2，在70 ℃的条件下反应18 h，可得产物COOH-PEG-CPADB-[co-BMA]。磁力搅拌COOH-PEG-CPADB-[co-BMA]溶液，称取2.4 mg的PDSMA、3.6 mg的偶氮二甲氧基异庚腈V70至烧杯中搅拌6 h，停止反应；离心，弃上清液，加入pH=7.5的PBS，超声粉碎仪探头进行超声分散，重复2次至上清液清澈，得纳米微球骨架COOH-PEG-CPADB-[co BMA co PDSMA]，通过核磁共振仪及凝胶渗透色谱仪检测多分散指数和质量。
将合成的微球骨架COOH-PEG-CPADB-[co BMA co PDSMA]溶解于20 mL乙醇中，在37 ℃条件下静置30 min；精准称取1 µL铁死亡激动剂Erastin、10 mg的1-2M2ge化合物、2 μg 的NF2敲除质粒和2 μg的YAP过表达质粒，同时加入纳米微球骨架混合溶液中，静置30 min后室温离心(10 000 r/min离心5 min)，弃上清液，再添加3倍体积的乙醇，室温离心(10 000 r/min离心5 min)，弃上清液，加入8倍体积的水，漩涡混合2 min；最后在37 ℃条件下用超声粉碎仪探头进行超声分散，缓慢加入4.7 mg的二硫苏糖醇反应6 h，得到PC(coBP)，至透析袋中(截留相对分子质量为1 000-8 000)透析3次，冻干备用，通过紫外分光光度计或琼脂糖凝胶电泳法检测试剂浓度。

采用SELEX技术筛选CD24适配体后，首先需氨基修饰CD24适配体，然后通过氨基和羧基的缩合反应将CD24适配体与纳米微球交联，形成一个完整的纳米递送系统PC(coBP)Ca。

1.4.2 载药纳米递送系统PC(coBP)Ca的表征分析通过马尔文纳米粒子测试仪检测PC(coBP)Ca的粒径分布和Zeta电位。将未进行CD24适配体修饰的载药纳米微球和载药纳米微球PC(coBP)Ca分别溶解在pH=7.0的PBS中。将纳米递送系统悬液滴在碳支撑膜的铜网上，2%磷钨酸染色30 s后用滤纸吸干，再滴加PBS洗去多余磷钨酸负染剂，过夜自然干燥8 h，透射电镜下观察其形态结构。

将PC(coBP)、YAP过表达质粒和NF2敲除质粒根据不同的摩尔比进行上样，按照YAP_OV∶NF2_KO∶PC(coBP)分为5组，分别为1∶1∶1组、1∶1∶2组、1∶1∶3组、1∶1∶4组、1∶1∶0组(对照)，Maker作为标记定位。应用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测PC(coBP)对YAP过表达质粒和NF2敲除质粒的载药量。采用高效液相色谱仪检测铁死亡激动剂Erastin的包封率与载药量。
载药量(%)=载体中所含药物量(mg)/载体总量(mg)×100%
包封率(%)=载药量(%)/理论载药量(%)×100%
1.4.3 PC(coBP)Ca表面CD24适配体修饰测定将CD24适配体修饰在PC(coBP)表面以增强其靶向能力，形成PC(coBP)Ca。为了确保CD24适配体成功地修饰到PC(coBP)表面需要进行以下测定：首先将生物素通过氨基修饰与CD24适配体共轭，再与PC(coBP)进行氨基和羧基的缩合反应生成PC(coBP)Ca。
实验分为空白对照组、PC(coBP)_Ud组、PC(coBP)Ca_Ud组，空白对照组将纳米微球骨架COOH-PEG-CPADB-[co BMA co PDSMA]溶于去离子水与罗丹明混合溶液中，质量浓度为46.51 µg/L，含10 µg/L罗丹明；PC(coBP)_Ud组将PC(coBP)溶于去离子水与罗丹明混合溶液中，质量浓度为42.74 µg/L，含10 µg/L罗丹明；PC(coBP)Ca_Ud组将PC(coBP)Ca溶于去离子水与罗丹明混合溶液中，质量浓度为31.95 µg/L，含10 µg/L罗丹明。3组分别加入0.5 mg的链霉亲和素磁珠，室温振荡混匀30 min，室温2 000 r/min离心10 min，再置于磁力架上进行磁分离2 min，观察离心前后溶液的颜色及分层情况。
1.4.4 PC(coBP)Ca对谷胱甘肽和pH值的敏感性测定在2 mL PC(coBP)Ca纳米微球悬液中滴加5 mmol/L的谷胱甘肽后，透射电镜下观察微球形态变化。pH值响应检测是向2 mL PC(coBP)Ca纳米微球悬液中逐滴滴加HCl溶液0.5 mL，至pH=6.5，观察气体产生情况，透射电镜下观察微球形态变化。
通过琼脂糖凝胶电泳检测谷胱甘肽和pH值(< 6.8)双重反应后，载药纳米微球中YAP_OV和NF2_KO的释放量。用紫外分光光度计检测铁死亡激动剂Erastin从PC(coBP)Ca的释放百分比。
1.4.5 PC(coBP)Ca逃逸免疫细胞吞噬的性能及靶向性能测定为检测PC(coBP)Ca通过电荷排斥逃避吞噬的能力，将20 µg/L罗丹明试剂分别与PC(coBP)和PC(coBP)Ca进行反应，生成83.5 µg/L的PC(coBP)_(rhd)和63.9 µg/L的PC(coBP)Ca_(rhd)。PC(coBP)_(rhd)组和PC(coBP)Ca_(rhd)组分别与单核细胞(或中性粒细胞)共培养，细胞密度300-400个/共聚焦皿。共培养2 h后，去培养基，终止孵育，按以下步骤进行染色：用PBS洗3遍，加入30 g/L多聚甲醛溶液固定30 min；PBS洗3遍，共聚焦显微镜下观察吞噬细胞的吞噬情况。
将PC(coBP)_(rhd)和PC(coBP)Ca_(rhd)分别与MDA-MB-231细胞共培养，细胞密度300-400个/共聚焦皿，共培养2 h后，激光共聚焦显微镜下观察载药纳米微球靶向情况。
1.4.6 PC(coBP)Ca逃逸溶酶体吞噬和药物突释性能测定为检测化合物1-2M2ge的功能，将MDA-MB-231细胞分别与113.29 µg/L PC(coBP)Ca(含10 µg/L 1-2M2ge)和162.73 µg/L PC(coBP)Ca(不含1-2M2ge)共培养，分别设为加药组、未加药组，以单独培养的细胞为空白对照。37 ℃下共培养36 h后，通过Q-PCR、Western Blot检测检测NF2及YAP的表达情况(n=10)。
溶酶体逃逸实验分为2组：将PC(coBP)Ca_(1M+FITC)(内含20 µg/L FITC荧光标记物和17.31 µg/L 1-2M2ge)、PC(coBP)Ca_(FITC)组(内含20 µg/L FITC荧光标记物)分别与MDA-MB-231细胞共培养，细胞密度300-400个/共聚焦皿。共培养6 h后，细胞溶酶体采用Lyso tracker红染色，激光共聚焦显微镜下观察荧光定位。
Q-PCR实验：将所有样品溶解在Trizol中，置于冰上孵育15 min，4 ℃下10 000 r/min离心10 min，加入20%氯仿中并于冰上孵育10 min；4 ℃下10 000 r/min离心15 min，将上清移动到新试管中并添加等体积的异丙醇，在室温下再孵育10 min；4 ℃下10 000 r/min离心10 min，用体积分数95%乙醇洗涤沉淀，干燥，并用30 µL无酶水中溶解，反转录合成cDNA。根据IQ SYBR Green Supermix说明书进行Q-PCR验证实验。引物设计：①F-NF2：5’-CAA GAC GTT CAC CGT GAG GA-3’，R-NF2：5’-CCT CCC ACA TTT CCG GAG TC-3’；②F-YAP：5’-CAA CTC CAA CCA GCA GCA AC-3’，R-YAP：5’-ACC TGC CGA AGC AGT TCT TG-3’；③内参引物序列：F-GAPDH：5’-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3’，R-GAPDH：5’-TTG ATT TTG GAG GGA TCT CG-3’。
Western Blot检测：使用蛋白质提取试剂盒提取各组细胞蛋白质。10%SDS-PAGE凝胶进行蛋白质上样及跑胶，后转移到PVDF膜上，转膜后用5%脱脂乳在 37 ℃下孵育1 h，然后在4 ℃下加入一级抗体(兔抗YAP，稀释比例为1∶1 000；鼠抗NF2，稀释比例为1∶1 000)过夜，用PBS(1%吐温20)洗涤3 次，加入二级抗体(山羊抗兔IgG H&amp、山羊抗鼠IgG H&amp)在37 ℃下培养1 h，用PBS洗涤3次(1%吐温20)，进行化学发光显影。
1.4.7 PC(coBP)Ca促进吞噬细胞吞噬作用的测定将MDA-MB-231细胞以1×104/孔的密度接种于共聚焦皿中，孵育24 h。用FITC和GFP荧光标记MDA-MB-231细胞后，将PC(coBP)Ca和抗CD24抗体分别加至皿中，在37 ℃下共培育2 h；加647荧光CD11b二抗和罗丹明标记的巨噬细胞共培养2 h，通过流式细胞术分析吞噬率，使用激光共聚焦显微镜观察荧光变化。
1.5 主要观察指标 PC(coBP)Ca激活铁死亡途径并促进巨噬细胞吞噬作用协同治疗三阴性乳腺癌的效果。
1.6 统计学分析采用GraphPadPrism 7统计分析软件。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，两变量之间关系采用线性相关分析。P < 0.05为差异有显著性意义。统计学方法已经由川北医学院生物统计学专家审核。

讨论

化疗易产生耐药和缺乏有效治疗靶点，导致三阴性乳腺癌成为预后最差的亚型，大多数患者并不能从化疗中受益[24]。由于化疗主要是以凋亡途径诱导细胞死亡，而铁死亡途径是一种新的细胞死亡方式[25-26]，为了满足安全稳定、精准有效、毒副作用小、对肿瘤病灶具强杀伤力等条件，需要具有特异性靶向递送系统的加持。纳米递送系统作为目前肿瘤研究领域的新热点，发挥纳米级材料粒径小、性质稳定、生物利用率高等特点应用于药物递送乃至早期检测[27-29]。然而，目前多数靶向递送系统在临床上应用效果较差，其主要原因为无法将药物或试剂精确递送到实体肿瘤的癌细胞胞质中[30-34]，其主要面临：血液系统中免疫细胞的吞噬；肿瘤组织中精确富集；溶酶体异物清除；胞内药物精准突释。
基于此，课题组拟设计了一种携带双质粒系统及铁死亡激动剂的新型多功能靶向纳米递送系统，以实现激活肿瘤细胞铁死亡途径且促进吞噬细胞吞噬作用协同治疗三阴性乳腺癌的目的。载药纳米微球PC(coBP)Ca的骨架是由二硫键网状结构相连的纳米双分子层，这样可有效避免血液的冲刷和碰撞，保持形态稳定。血液系统中的免疫细胞是第一道生物防线，目前应用较多的解决方案是将载药纳米微球表面修饰负电荷，因为巨噬细胞表面带负电荷，这样可利用同电荷相斥原则有效逃逸免疫细胞吞噬[31]。为了实现载药纳米微球能够精准靶向CD24高表达的三阴性乳腺癌细胞，则以仿生肿瘤化为解决方案，筛选出了CD24适配体修饰在载药纳米微球表面，让机体将微球默认为肿瘤细胞，从而实现归巢效应[35-37]。
载药纳米微球PC(coBP)Ca所装载的内容物为NF2敲低质粒、YAP过表达质粒、铁死亡激动剂Erastin和pH值响应化合物1-2M2ge。铁死亡激动剂Erastin可通过直接抑制GPX4，导致肿瘤细胞抗氧化能力下降，最终导致肿瘤细胞铁死亡[38]。研究证明Erastin类药物可有效抑制肿瘤生长，并且毒副作用较小[19]。WU等[39]研究证明，实体瘤内部肿瘤细胞的铁死亡可由NF2-YAP信号通路决定，特异性敲除NF2并过表达YAP可有效提升肿瘤对铁死亡的敏感性。课题组前期研究证明，对三阴性乳腺癌中的CD24高表达细胞进行特异性敲低NF2和过表达YAP后，可降低细胞膜表面CD24和CD47的表达，阻碍免疫逃逸，从而促进巨噬细胞吞噬作用。肿瘤细胞内处于高谷胱甘肽水平和pH < 6.8的环境。PC(coBP)Ca骨架的二硫键网格结构与谷胱甘肽反应发生断裂，微球处于不稳定状态，内含物1-2M2ge在酸性环境中发生电离反应生成H2O和CO2，大量CO2气体可将处于不稳定状态的PC(coBP)Ca和溶酶体撑破，快速释放内容物，通过谷胱甘肽和pH值双重系统同时实现溶酶体逃逸和药物的快速突释[40]。
结论：实验制备了一种谷胱甘肽和pH值双响应性CD24适配体修饰的载铁死亡激动剂Erastin和双质粒的纳米药物递送系统PC(coBP)Ca。PC(coBP)Ca外被CD24适配体修饰，骨架二硫键网格结构具有谷胱甘肽响应，pH值响应的化合物1-2M2ge是此套递送系统的创意内含物，负载启动铁死亡途径的铁死亡激动剂Erastin和NF2-YAP双质粒系统；功能优于其他纳米载体，可有效逃避免疫细胞吞噬精准靶向CD24高表达细胞，逃逸溶酶体，达到药物高效突释，激活铁死亡途径和促进吞噬细胞吞噬。这一设计为三阴性乳腺癌靶向制剂提供了新的方案和实验基础，有望用于三阴性乳腺癌患者的治疗。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

精准靶向CD24高表达三阴性乳腺癌细胞纳米递送系统的制备及体外验证

Preparation and in vitro validation of nanotransmission system for accurate targeting of CD24 high-expression triple negative breast cancer cells

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