神经营养因子3-壳聚糖载体诱导神经干细胞分化为神经元的亚型及其电生理特性

doi:10.12307/2023.081

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (25): 4020-4027.doi: 10.12307/2023.081

• 药物控释材料 drug delivery materials • 上一篇下一篇

神经营养因子3-壳聚糖载体诱导神经干细胞分化为神经元的亚型及其电生理特性

张博雅1，段红梅1，白天宇2，郝飞3，郝鹏1，赵文1，高钰丹1，李晓光1，杨朝阳1

1首都医科大学神经生物学系，北京市 100069；北京航空航天大学，2生物与医学工程学院，3医工交叉创新研究院，生物医学工程高精尖创新中心，北京市 100191

收稿日期:2022-01-19 接受日期:2022-03-03 出版日期:2023-09-08 发布日期:2023-01-17
通讯作者: 杨朝阳，博士，教授，首都医科大学基础医学院神经生物学系，北京市 100069
作者简介:张博雅，女，1995年生，青海省西宁市人，汉族，2022 年首都医科大学毕业，硕士，主要从事神经干细胞分化及电生理研究。
基金资助:
国家自然科学基金(31670988，31971279)，项目负责人：杨朝阳；国家自然科学基金(81941011，31730030)，项目负责人：李晓光；北京市自然科学基金(7222004)，项目负责人：段红梅；国家自然科学基金(31900749)，项目负责人：郝鹏；国家自然科学基金(31771053)，项目负责人：段红梅；国家重点研发计划(2017YFC1104002)，项目负责人：杨朝阳；国家重点研发计划(2017YFC1104001)，项目负责人：李晓光；北京市科技计划(Z181100001818007)，项目负责人：杨朝阳；北京市自然科学基金青年项目(7214301)，项目负责人：郝飞

Neurotrophic factor 3-chitosan carrier induces neural stem cells to differentiate into neuronal subtypes and their electrophysiological properties

Zhang Boya1, Duan Hongmei1, Bai Tianyu2, Hao Fei3, Hao Peng1, Zhao Wen1, Gao Yudan1, Li Xiaoguang1, Yang Zhaoyang1

1Department of Neurobiology, Capital Medical University, Beijing 100069, China; 2School of Biological and Medical Engineering, Beihang University, Beijing 100191, China; 3Institute of Medical-Engineering Interdisciplinary Innovation of Beihang University, Beijing Advanced Innovation Center for Biomedical Engineering, Beijing 100191, China

Received:2022-01-19 Accepted:2022-03-03 Online:2023-09-08 Published:2023-01-17
Contact: Yang Zhaoyang, MD, Professor, Department of Neurobiology, Capital Medical University, Beijing 100069, China
About author:Zhang Boya, Master, Department of Neurobiology, Capital Medical University, Beijing 100069, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 31670988, 31971279 (to YZY); National Natural Science Foundation of China, No. 81941011, 31730030 (to LXG); Natural Science Foundation of Beijing, No. 7222004 (to DHM); National Natural Science Foundation of China, No. 31900749 (to HP); National Natural Science Foundation of China, No. 31771053 (to DHM); National Key Research & Development Program, No. 2017YFC1104002 (to YZY); National Key Research & Development Program, No. 2017YFC1104001 (to LXG); Beijing Science and Technology Program, No. Z181100001818007 (to YZY); Natural Science Foundation of Beijing (Youth Program), No. 7214301 (to HF)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

神经营养因子3-壳聚糖：使用壳聚糖作为基质支架来加载神经营养因子3，以便这种关键的神经营养因子可以在使用时以相对长期的方式逐渐和持续地释放到环境中。
神经干细胞：是一类具有自我更新和多方向分化潜能的干细胞，可通过对称分裂和不对称分裂产生中枢神经系统内大多数的细胞类型，包括神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。

背景：前期研究已证实神经营养因子3-壳聚糖载体可支持神经干细胞的存活和增殖，同时可高效诱导神经干细胞向神经元方向分化。
目的：观察神经营养因子3-壳聚糖载体对神经元发育进程、发育各阶段电生理特性及发育成熟神经元亚型的影响。
方法：取第3代新生大鼠脊髓神经干细胞，分4组培养：空白对照组加入神经干细胞培养基，壳聚糖组加入含壳聚糖的神经干细胞培养基，NT3组加入含神经营养因子3的神经干细胞培养基，NT3-壳聚糖组加入含神经营养因子3-壳聚糖载体的神经干细胞培养基。利用免疫荧光染色观察神经干细胞发育各阶段标志物表达情况，借助全细胞膜片钳技术评价神经干细胞发育过程中电生理特性的变化情况，利用免疫荧光染色观察神经干细胞分化21 d后中间神经元的亚型。

结果与结论：①Nestin、DCX、Tuj1及MAP2免疫荧光染色显示，神经营养因子3-壳聚糖载体维持了神经干细胞池的稳态，并且通过加速神经母细胞的发育进程来促进神经元发育成熟；②全细胞膜片钳记录发育过程中的细胞发现，营养因子神经营养因子3和神经营养因子3-壳聚糖在发育早期对神经干细胞膜功能以及细胞膜上离子通道的发育成熟具有一定的促进作用，但是仅有神经营养因子3-壳聚糖可将这一优势维持到发育中后期，即分化后7-14 d；③免疫荧光染色显示，神经干细胞分化21 d后，NT3-壳聚糖组成熟神经元可表达运动神经元特异性标记物HB9、V1类型中间神经元FOXP1、V2类型中间神经元特异性标记物LHX3，以及调控机械性痛觉感觉中间神经元的特异性标记物VGLUT3；④结果显示，神经营养因子3-壳聚糖载体促进了神经干细胞向神经母细胞的发育，在发育早期对细胞膜功能及细胞膜上的离子通道发育成熟具有一定的促进作用，可诱导发育成熟的神经元亚型多样化。

https://orcid.org/0000-0001-7563-4639 (张博雅)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 神经营养因子3, 壳聚糖载体, 神经干细胞, 发育, 神经元, 膜片钳, 分化, 离子通道, 电生理, 中间神经元

Abstract: BACKGROUND: Previous studies have confirmed that the neurotrophic factor 3-chitosan carrier can support the survival and proliferation of neural stem cells, and can efficiently induce neural stem cells to differentiate into neurons.
OBJECTIVE: To observe the effects of neurotrophic factor 3-chitosan carrier on neuronal development and its electrophysiological properties at various stages of development and the subtypes of mature neurons.
METHODS: Passage 3 spinal cord neural stem cells of neonatal rats were collected and cultured in four groups. The blank control group was added with neural stem cell culture medium. Chitosan group was added with neural stem cell culture medium containing chitosan. Neurotrophic factor 3 group was added with neural stem cell medium containing neurotrophic factor 3. Neurotrophic factor 3-chitosan group was added with neural stem cell medium containing neurotrophic factor 3-chitosan carrier. Immunofluorescence staining was performed to observe the development of neurons at various stages. The changes in electrophysiological properties during neural stem cell development were evaluated by whole-cell patch-clamp technology. Interneuron subtypes were visualized by immunofluorescence staining 21 days after neural stem cell differentiation.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Immunofluorescence staining for Nestin, DCX, Tuj1 and MAP2 showed that the neurotrophic factor 3-chitosan carrier maintained the homeostasis of the neural stem cell pool and promoted neuronal maturation by accelerating the developmental process of neuroblasts. (2) Whole-cell patch-clamp technology results demonstrated that the neurotrophic factor 3 and neurotrophic factor 3-chitosan promoted cell membrane function and the maturation of ion channels on the cell membrane early in development. However, only neurotrophic factor 3-chitosan can maintain this advantage to the middle and late stages of development, that is, 7-14 days after differentiation. (3) Immunofluorescence staining exhibited that after 21 days of neural stem cell differentiation, mature neurons in the neurotrophic factor 3-chitosan group could express the motor neuron specific marker HB9, V1 type interneuron FOXP1, V2 type interneuron specific marker LHX3, and regulate a specific marker VGLUT3 that regulates mechanical pain sensory interneurons. (4) These results have verified that the neurotrophic factor 3-chitosan carrier can promote the development of neural stem cells to neuroblasts, and the function of the cell membrane and the maturation of ion channels on the cell membrane in the early stage of development to a certain degree, and can induce the diversification of mature neuronal subtypes.

Key words: neurotrophic factor 3, chitosan carrier, neural stem cell, development, neuron, patch clamp, differentiation, ion channel, electrophysiology, interneuron

中图分类号:

张博雅, 段红梅, 白天宇, 郝飞, 郝鹏, 赵文, 高钰丹, 李晓光, 杨朝阳. 神经营养因子3-壳聚糖载体诱导神经干细胞分化为神经元的亚型及其电生理特性[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(25): 4020-4027.

Zhang Boya, Duan Hongmei, Bai Tianyu, Hao Fei, Hao Peng, Zhao Wen, Gao Yudan, Li Xiaoguang, Yang Zhaoyang. Neurotrophic factor 3-chitosan carrier induces neural stem cells to differentiate into neuronal subtypes and their electrophysiological properties[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(25): 4020-4027.

图/表（结果） 7

2.1 神经干细胞球的鉴定传至第3代的神经干细胞随着细胞的增殖球体增大，细胞边界清楚，折光性强，且最外层细胞伸出“毛刺”样突起，见图1A。使用Nestin免疫荧光染色鉴定纯化的神经干细胞，培养的神经干细胞表达干细胞标记物Nestin，见图1B-D。

2.2 神经营养因子3-壳聚糖载体对神经干细胞发育进程的影响见图2。

使用Nestin标记神经干细胞，DCX特异性标记神经母细胞，Tuj1标记未成熟神经元，MAP2标记成熟神经元。在整个细胞发育过程中，NT3-壳聚糖组中Nestin阳性神经干细胞数量虽然有所下降，但相较于同一时间节点的其他组来说神经干细胞数量仍旧保持在一个较高的水平。在发育初期(分化后1-3 d)尤其是在分化后1 d，NT3组和NT3-壳聚糖组的DCX阳性细胞明显高于空白对照组(P < 0.05)，并且在分化后3 d时，空白对照组神经母细胞数量才达到较高水平。NT3-壳聚糖组Tuj1阳性细胞在分化后3 d显著升高，高于其他组(P < 0.05)。在分化早期，NT3-壳聚糖组相较于空白对照组和空载体组成熟神经元数量明显增多，并且可将这一优势维持至发育后期(即分化后14 d)，说明神经营养因子3-壳聚糖载体具有促进神经元成熟的能力。
2.3 神经营养因子3-壳聚糖载体对神经干细胞发育过程中电生理功能的影响
2.3.1 神经干细胞在发育过程中的被动膜特性变化见图3。
采用全细胞电流钳和电压钳模式研究神经干细胞向神经元分化过程中各时期神经元的被动膜特性，见图3A、B，结果显示，分化后第3天，NT3组和NT3-壳聚糖组的静息膜电位相较于另外两组显著增大(P < 0.05)，见图3C-F；分化后第1天，NT3组和NT3-壳聚糖组膜电阻与另外两组相比显著下降(P < 0.05)，见图3G-J；神经元各组之间的膜电容并未随着发育时间的延长而变化，见图3K-N。

2.3.2 诱导分化的神经干细胞上 K+通道发育情况见图4。
为了观察细胞膜上K+通道发育情况，首先通过对分化后1 d的细胞进行免疫荧光染色观察， MAP2阳性的神经元上可表达K+通道蛋白KV4.2，见图4A，说明诱导的细胞膜上可以产生K+电流电压的变化，因此可以在接下来的膜片钳实验中，通过记录K电流的变化从功能上反映出 K+通道的发育情况。采用全细胞电压钳模式，钳制电压-70 mV给予细胞去激化步阶刺激，从-80 mV以10 mV的增幅去极化至
+100 mV，记录到全细胞外向K电流(IK)，见图4B。对IK的最大幅值进行观察统计分析，见图4C，E，G，I，分化后1 d，NT3组的IK相高于其他3组(P < 0.05)，见图4D；分化后3 d，NT3组和NT3-壳聚糖组IK高于空白对照组(P < 0.05)，见图4F；分化后14 d，仅NT3-壳聚糖组IK维持了较高水平，高于其他3组(P < 0.05)，见图4J。

2.3.3 诱导分化的神经干细胞上Na+通道发育情况见图5。
为了观察细胞膜上Na+通道发育情况，首先对分化后1 d的细胞进行免疫荧光染色观察，MAP2阳性的神经元上可表达Na+通道蛋白NaV1.6，见图5A，说明诱导的细胞膜上可以产生Na+电流电压的变化，因此可以在接下来的膜片钳实验中，通过记录Na电流的变化从功能上反映出Na+通道的发育情况。采用全细胞电压钳模式，钳制电压-70 mV给予细胞去激化步阶刺激，从-50 mV以10 mV的增幅去极化至+30 mV，记录到全细胞内向Na电流(INa)，见图5B。对INa的最大幅值进行观察统计分析，见图5C，E，G，I，分化早期，各组之间INa比较无明显差异，见图5D，F；分化后7，14 d，NT3-壳聚糖组INa显著增高，见图5H，J。

2.3.4 诱导分化的神经干细胞动作电位变化情况见图6。
为了观察神经干细胞在诱导分化过程中动作电位的变化，采用全细胞电流钳模式，对细胞注入超过基强度的脉冲去极化电流，对于可诱发动作电位的细胞，通过电极胞内注射生物素标记细胞，再与MAP2染色确认细胞神经元身份，见图6A。分化后3 d，NT3组和NT3-壳聚糖组动作电位频率高于空白对照组(P < 0.05)，见图6D；分化后14 d，NT3-壳聚糖组动作电位频率高于其他3组(P < 0.05)，见图6F。分化后1 d，NT3组和NT3-壳聚糖组动作电位幅值显著升高，见图6G；随着神经元的发育，分化后14 d，NT3-壳聚糖组的动作电位幅值依然维持着变大的趋势，高于其他3组(P < 0.05)，NT3组的动作电位幅值在经历了第7天的显著升高后，于第14天降低至与空白对照组无明显差异，见图6I-J。在分化后1 d，NT3组和NT3-壳聚糖组阈电流低于其他两组(P < 0.05)，见图6K；NT3-壳聚糖组的阈电流在接下来的分化过程中一直维持相对较低的水平，低于其他3组(P < 0.05)，见图6L-N。NT3组的动作电位半波宽在分化后1 d显著低于空白对照组(P < 0.05)，见图 6O，此时NT3-壳聚糖组的半波宽无明显变化；从分化后3 d开始，NT3-壳聚糖组半波宽持续下降，见图6P-R。

2.4 神经营养因子3-壳聚糖载体对神经干细胞衍生神经元的亚型的影响见图7。
为了探究神经元亚型的多样性，对NT3-壳聚糖诱导分化21 d且表达MAP2的成熟神经元进行进一步亚型鉴定，可观察到：成熟神经元可表达运动神经元特异性标记物HB9[14]；协同运动，决定运动神经元连接性的V1类型中间神经元FOXP1[15-16]，协调左右交替运动的V2类型中间神经元特异性标记物LHX3[17-19]，以及调控机械性痛觉的感觉中间神经元特异性标记物VGLUT3[20]。

参考文献

[1] REYNOLDS BA, WEISS S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science (New York, NY). 1992;255(5052):1707-1710.
[2] LI L, CLEVERS H. Coexistence of Quiescent and Active Adult Stem Cells in Mammals. Science. 2010;327(5965):542-545.
[3] NAIK PP, BIRBRAIR A, BHUTIA SK. Mitophagy-driven metabolic switch reprograms stem cell fate. Cell Mol Life Sci. 2019;76(1):27-43.
[4] DUAN H, LI X, WANG C, et al. Functional hyaluronate collagen scaffolds induce NSCs differentiation into functional neurons in repairing the traumatic brain injury. Acta Biomater. 2016;45:182-195.
[5] ZHU Y, UEZONO N, YASUI T, et al. Neural stem cell therapy aiming at better functional recovery after spinal cord injury. Dev Dyn. 2018; 247(1):75-84.
[6] LIPPERT T, GELINEAU L, NAPOLI E, et al. Harnessing neural stem cells for treating psychiatric symptoms associated to fetal alcohol spectrum disorder and epilepsy. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 2017;30(Pt A):10-22.
[7] SUZUKI H, AHUJA CS, SALEWSKI RP, et al. Neural stem cell mediated recovery is enhanced by Chondroitinase ABC pretreatment in chronic cervical spinal cord injury. PLoS One. 2017;12(8):e0182339.
[8] KOUTSOUDAKI PN, PAPASTEFANAKI F, STAMATAKIS A, et al. Neural stem/progenitor cells differentiate into oligodendrocytes, reduce inflammation, and ameliorate learning deficits after transplantation in a mouse model of traumatic brain injury. Glia. 2016;64(5):763-779.
[9] SHETTY AK. Hippocampal injury-induced cognitive and mood dysfunction, altered neurogenesis, and epilepsy: Can early neural stem cell grafting intervention provide protection? Epilepsy Behav. 2014;38:117-124.
[10] ZHANG ML, ZHANG XJ, KANG J, et al. Matrine promotes NT3 expression in CNS cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. Neurosci Lett. 2017;649:100-106.
[11] YANG Z, ZHANG A, DUAN H, et al. NT3-chitosan elicits robust endogenous neurogenesis to enable functional recovery after spinal cord injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015;112(43):13354-13359.
[12] YANG Z, DUAN H, MO L, et al. The effect of the dosage of NT-3/chitosan carriers on the proliferation and differentiation of neural stem cells. Biomaterials. 2010;31(18):4846-5448.
[13] LI X, YANG Z, ZHANG A. The effect of neurotrophin-3/chitosan carriers on the proliferation and differentiation of neural stem cells. Biomaterials. 2009;30(28):4978-4985.
[14] CALDEIRA V, DOUGHERTY KJ, BORGIUS L, et al. Spinal Hb9::Cre-derived excitatory interneurons contribute to rhythm generation in the mouse. Sci Rep. 2017;7:41369.
[15] MORIKAWA Y, KOMORI T, HISAOKA T, et al. Detailed Expression Pattern of Foxp1 and Its Possible Roles in Neurons of the Spinal Cord during Embryogenesis. Dev Neurosci. 2009;31(6):511-522.
[16] MORIKAWA Y, HISAOKA T, SENBA E. Characterization of Foxp2-expressing cells in the developing spinal cord. Neuroscience. 2009; 162(4):1150-1162.
[17] LEE B, LEE S, AGULNICK AD, et al. Single-stranded DNA binding proteins are required for LIM complexes to induce transcriptionally active chromatin and specify spinal neuronal identities. Development. 2016;143(10):1721-1731.
[18] FRANCIUS C, HIDALGO-FIGUEROA M, DEBRULLE S, et al. Vsx1 Transiently Defines an Early Intermediate V2 Interneuron Precursor Compartment in the Mouse Developing Spinal Cord. Front Mol Neurosci. 2016;9:145.
[19] SHARMA K, SHENG HZ, LETTIERI K, et al. LIM homeodomain factors Lhx3 and Lhx4 assign subtype identities for motor neurons. Cell. 1998; 95(6):817-828.
[20] SAKAI K, SANDERS KM, LIN SH, et al. Low-Threshold Mechanosensitive VGLUT3-Lineage Sensory Neurons Mediate Spinal Inhibition of Itch by Touch. J Neurosci. 2020;40(40):7688-7701.
[21] LU H, LI M, SONG T, et al. Retrovirus delivered neurotrophin-3 promotes survival, proliferation and neuronal differentiation of human fetal neural stem cells in vitro. Brain Res Bull. 2008;77(4):158-164.
[22] YUAN SH, MARTIN J, ELIA J, et al. Cell-Surface Marker Signatures for the Isolation of Neural Stem Cells, Glia and Neurons Derived from Human Pluripotent Stem Cells. PloS One. 2011;6(3):e17540.
[23] ZHANG J, JIAO J. Molecular Biomarkers for Embryonic and Adult Neural Stem Cell and Neurogenesis. Biomed Res Int. 2014;2015:727542.
[24] FRIOCOURT G, KOULAKOFF A, CHAFEY P, et al. Doublecortin Functions at the Extremities of Growing Neuronal Processes. Cerebral Cortex. 2003;13(6):620-626.
[25] GUPTE RP, KADUNGANATTIL S, SHEPHERD AJ, et al. Convergent Phosphomodulation of the Major Neuronal Dendritic Potassium Channel Kv4.2 by Pituitary Adenylate Cyclase-activating Polypeptide. Neuropharmacology. 2016;101:291-308.
[26] KIM DM, NIMIGEAN CM. Voltage-Gated Potassium Channels: A Structural Examination of Selectivity and Gating. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2016;8(5):a029231.
[27] XIAO F, ZHANG X, NI P, et al. Voltage-dependent potassium channel Kv 4.2 alleviates the ischemic stroke impairments through activating neurogenesis. Neurochem Int. 2021;150:105155.
[28] O’BRIEN JE, MEISLER MH. Sodium channel SCN8A (Nav1.6): properties and de novo mutations in epileptic encephalopathy and intellectual disability. Front in Genet. 2013;4:213.
[29] WANG X, ZHANG XG, ZHOU TT, et al. Elevated Neuronal Excitability Due to Modulation of the Voltage-Gated Sodium Channel Nav1.6 by Aβ1−42. Front Neurosci. 2016;10:94.
[30] ZYBURA AS, BAUCUM AJ 2ND, RUSH AM, et al. CaMKII enhances voltage-gated sodium channel Nav1.6 activity and neuronal excitability. J Biol Chem. 2020;295(33):11845-11865.
[31] BEAN BP. The action potential in mammalian central neurons. Nat Rev Neurosci. 2007;8(6):451-465.
[32] KIEHN O. Decoding the organization of spinal circuits that control locomotion. Nat Rev Neurosci. 2016;17(4):224-238.
[33] ZHOLUDEVA LV, ABRAIRA VE, SATKUNENDRARAJAH K, et al. Spinal Interneurons as Gatekeepers to Neuroplasticity after Injury or Disease. J Neurosci. 2021;41(5):845-854.
[34] KUMAMARU H, LU P, ROSENZWEIG ES, et al. Regenerating Corticospinal Axons Innervate Phenotypically Appropriate Neurons within Neural Stem Cell Grafts. Cell Rep. 2019;26(9):2329-2339.e4.

引言

中枢神经系统神经干细胞是一类具有自我更新和多方向分化潜能的干细胞，可以通过对称分裂和不对称分裂产生中枢神经系统内大多数的细胞类型，包括神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞[1]。神经干细胞能够长期保持休眠状态，当受到一定的损伤刺激时可用于组织再生和细胞终生更换[2-3]。神经干细胞移植的各种特性为治疗多种疾病提供了广阔的前景，例如神经系统疾病，包括脊髓损伤、创伤性脑损伤及癫痫等[4-9]。由于移植干细胞产生较大的致瘤风险以及对移植干细胞是否能在宿主体内获得成熟神经元的命运的不确定性，再生疗法的使用仍然有限。
神经营养因子3是一种有效的神经营养因子，可促进神经元突触再生和神经元功能的恢复，进而改善神经元回路，因此其在中枢神经系统中表达的上调对于神经功能缺损具有重要的治疗意义[10]。有研究报告了神经营养因子3偶联的壳聚糖生物材料，会引起受伤脊髓中内源性神经干细胞的强烈激活[11]。通过缓慢释放神经营养因子3，生物材料吸引神经干细胞迁移到病变区域并分化为神经元，形成功能性神经网络，它将上升和下降的轴突相互连接起来，促进感觉和运动行为恢复。研究表明，增强内源性神经发生可能是治疗脊髓损伤的一种新策略。
前期研究已证实神经营养因子3-壳聚糖载体可支持神经干细胞的存活和增殖，同时可高效诱导神经干细胞向神经元方向分化[12]，但是并未对神经营养因子3-壳聚糖载体诱导的神经元电生理功能进行探究，同时忽视了对脊髓神经干细胞向中间神经元分化的神经元亚型的研究。此次实验旨在探究神经营养因子3-壳聚糖载体对神经元发育进程以及其发育各阶段电生理特性的影响，同时对于发育成熟神经元的亚型进行进一步探究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞实验，组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2020年9月至2021年12月在首都医科大学基础科研楼完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物新生24 h Wistar大鼠6只，SPF级，雌雄不拘，由首都医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(京)2016-0006。所有实验均由首都医科大学实验动物中心批准，并按照首都医科大学实验动物中心和北京实验动物协会的标准执行。
1.3.2 实验仪器和试剂神经营养因子3-壳聚糖(实验室自制)；膜片钳放大器(德国HEKA)；电极拉制仪(美国Sutter)；壳聚糖、神经营养因子3、兔抗FOXP1多克隆抗体、Hoechst 33258(美国Sigma公司)；DMEM-F12干粉培养基(美国Gibco公司)；B27 无血清添加剂(50×)、Alexa Fluor 555链霉亲和素偶联物(美国Invitrogen公司)；兔抗Nestin多克隆抗体、兔抗DCX多克隆抗体、兔抗β-Ⅲ-tubulin单克隆抗体、兔抗HB9多克隆抗体(Abcam公司)；兔抗MAP2多克隆抗体(Proteintech公司)；小鼠抗MAP2单克隆抗体(Millipore公司)；兔抗Kv4.2多克隆抗体、兔抗Nav1.6多克隆抗体(Alomone labs公司)；兔抗LHX3多克隆抗体(Gene Tex公司)；兔抗VGLUT3多克隆抗体(Synaptic Systems公司)；Alexa Fluor488标记山羊抗小鼠荧光二抗、Alexa Fluor594标记山羊抗兔荧光二抗(Molecular Probes公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 神经干细胞的获取、分化[13] 取新生大鼠的脊髓，除去脊髓硬脊膜和血管，分别使用0.01 mol/L PBS和DMEM-F12基础培养基清洗3遍，去除可能附着于脊髓表面的血液或组织，使用玻璃吸管吹打至无明显组织块后，使用10%木瓜蛋白酶消化15 min，将获得的单细胞悬液加入新鲜的神经干细胞增殖培养基(DMEM-F12+2%B27+碱性成纤维细胞生长因子+表皮生长因子)进行悬浮培养。细胞悬液每3 d半量换液1次，培养至1周左右进行传代，即使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化后机械分离，将单细胞重悬并加入新鲜培养基中，传至第3代使用，然后将细胞接种于多聚赖氨酸包被的玻片使其贴壁分化。取第3代神经干细胞球贴壁12 h内，利用免疫荧光染色观察神经干细胞标志物Nestin的表达。
1.4.2 实验分组将培养的第3代神经干细胞随机分为4组，分别为空白对照组、壳聚糖组、NT3组及NT3-壳聚糖组，每组4皿，细胞密度为350个/cm2。空白对照组加入2%B27+DMEM-F12培养基2 mL，壳聚糖组加入含10 g/L壳聚糖的2%B27+DMEM-F12培养基2 mL，NT3组加入含20 µg/L神经营养因子3的2%B27+DMEM-F12培养基2 mL，NT3-壳聚糖组加入含10 g/L神经营养因子3-壳聚糖的2%B27+DMEM-F12培养基2 mL。以上各组培养基均在神经干细胞贴壁后30 min加入，即仅在细胞分化开始时加入不同培养基，每3 d半量换液一次，更换的培养基均为基础培养基(2%B27+DMEM-F12)。分化后1，3，7，14 d，利用免疫荧光染色观察细胞Nestin、DCX、Tuj1及MAP2的表达，借助全细胞膜片钳技术评价细胞电生理特性的变化情况；分化后1 d，免疫荧光染色观察细胞膜上Na+通道和K+通道的相关蛋白表达；分化21 d后，利用免疫荧光染色观察中间神经元的亚型。
1.4.3 免疫荧光染色取出贴壁细胞培养皿，PBS洗涤5 min×3，4%PFA固定40 min，PBS洗涤5 min×3，0.1%PBST处理5 min，PBS再次洗涤5 min×3，5%NGS封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜；PBS洗涤5 min×3，二抗室温避光孵育1 h，PBS洗涤5 min×3，Hochest(稀释1∶1 000)孵育10 min，PBS洗涤3次，封固，荧光显微镜下观察。
神经干细胞鉴定取第3代神经干细胞球贴壁12 h内，使用兔抗Nestin多克隆抗体(稀释比例1∶200)，二抗为Alexa Fluor594标记山羊抗兔荧光二抗(稀释比例1∶200)。
分化后1，3，7，14 d，利用免疫荧光染色观察细胞Nestin、DCX、Tuj1及MAP2的表达，一抗分别为兔抗Nestin多克隆抗体(稀释比例1∶200)、兔抗DCX多克隆抗体(稀释比例1∶500)、兔抗β-Ⅲ-tubulin单克隆抗体(稀释比例1∶500)和兔抗MAP2多克隆抗体(稀释比例1∶500)，二抗为Alexa Fluor594标记山羊抗兔荧光二抗(稀释比例1∶200)。
对于神经元亚型的分类使用分化后21 d的成熟神经元进行染色，使用的一抗为兔抗HB9多克隆抗体(稀释比例 1∶200)、兔抗FOXP1多克隆抗体(稀释比例1∶500)、兔抗LHX3多克隆抗体(稀释比例1∶200)、兔抗VGLUT3多克隆抗体(稀释比例1∶500)以及小鼠抗MAP2单克隆抗体(稀释比例1∶500)，二抗为Alexa Fluor488标记山羊抗小鼠荧光二抗(稀释比例1∶200)、Alexa Fluor594标记山羊抗兔荧光二抗(稀释比例1∶200)。
对于细胞膜上Na+通道和K+通道相关蛋白的表达，使用的一抗为兔抗Nav1.6多克隆抗体(稀释比例1∶500)、兔抗Kv4.2多克隆抗体(稀释比例1∶500)以及小鼠抗MAP2单克隆抗体(稀释比例1∶500)，二抗为Alexa Fluor488标记山羊抗小鼠荧光二抗(稀释比例1∶200)、Alexa Fluor594标记山羊抗兔荧光二抗(稀释比例1∶200)。
对免疫荧光染色后的细胞爬片用甘油封固后，利用倒置荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜观察细胞，用Lecia LAS AF采集及分析软件随机拍照获得荧光图像，用iMaris 8.2.0软件处理荧光图像，利用Image J进行荧光染色细胞计数。
1.4.4 全细胞膜片钳记录首先拉制玻璃微电极，阻抗为5.5-7 MΩ。然后在倒置显微镜下选取细胞膜完整、胞体折光性好的神经干细胞，将玻璃微电极尖端吸附目标细胞，并将钳制电位设定为-70 mV，形成高阻封接，给予电容补偿，再给予短促负压破膜，形成全细胞记录模式。从微电极处记录的细胞电流电压变化情况通过膜片钳放大器(HEKA，GER)输入计算机，应用Patch Master软件进行采样记录，记录到的信号使用Clampfit 10.0进行分析处理。
1.5 主要观察指标 ①分化不同时间点神经干细胞向神经元的发育情况；②分化不同时间点，通过全细胞膜片钳记录细胞膜的静息膜电位、膜电容、电流-电压曲线、电压-电流曲线以及动作电位等指标来反映细胞膜上的电生理变化情况；③免疫荧光染色检测发育成熟神经元的亚型。
1.6 统计学分析实验数据使用HEKA EPC10放大器及Patch Master软件采集记录，使用Clampfit 10.0软件分析处理，采用SPSS 17.0软件进行统计分析。所有计量资料均表示为x±s，组间比较采用单因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)，P < 0.05时为差异有显著性意义。文章统计学方法已经宁夏医科大学公共卫生学院生物统计学专家乔慧教授审核。

讨论

神经营养因子3可促进神经干细胞的存活以及诱导其分化为神经元，被认为是临床治疗的最佳候选因子[21]，然而，由于神经营养因子3的可溶性其半衰期短、易分散，难以固定在神经损伤部位发挥其生物学功能。基于以上问题，课题组在前期实验中使用壳聚糖载体搭载神经营养因子3与可溶性神经营养因子3进行相关对比实验，发现负载神经营养因子3的壳聚糖载体延长了神经营养因子3的功能持续时间并提高了效率，并可以提高神经干细胞的长期存活以及增加了神经干细胞向神经元的分化百分比[12]。
神经干细胞在发育过程中主要经历神经祖细胞、神经母细胞、幼稚神经元以及成熟神经元等不同阶段，分别通过Nestin、DCX、Tuj1以及MAP2来特异性标记[22-24]。此次实验分析神经营养因子3-壳聚糖对神经元发育进程的影响均以此为发育不同阶段的划分。
实验结果显示，随着发育的进行，可溶性NT3组Nestin标记的神经干细胞数量逐渐下降，而与神经营养因子3-壳聚糖共培养的神经干细胞数量虽略微下降，但仍然保持在一个相对较高的水平，这说明随着发育的进行，神经营养因子3-壳聚糖维持了神经干细胞池的稳态。神经营养因子3-壳聚糖诱导的神经母细胞则在分化后1 d数量就达到了空白对照组分化3 d的水平，说明神经营养因子3-壳聚糖促进了神经干细胞向神经母细胞发育这一进程。分化后3 d，神经母细胞数量显著下降，Tuj1阳性的幼稚神经元显著上升，这提示在细胞发育的第3天，神经营养因子3-壳聚糖诱导大量神经母细胞向幼稚神经元阶段发育。神经营养因子3-壳聚糖诱导的成熟神经元在分化后3 d显著升高，并且将这一优势维持到了发育后期，相比之下可溶性神经营养因子3诱导的成熟神经元仅维持到发育中期，对发育后期的神经元并未起到良好的促进维持作用。可溶性神经营养因子3在发育早期显示出更好的促进细胞发育效果，是因为早期培养基中神经营养因子3含量较高，而神经营养因子3-壳聚糖具有缓释性，效果持续且稳定，对神经元的长期发育具有更好的维持及促进作用。以上结果说明，神经营养因子3-壳聚糖可维持神经干细胞池的稳态，并且通过加速神经母细胞的发育进程来促进神经元发育成熟。
神经营养因子3-壳聚糖对神经元发育过程中细胞膜上的离子通道等电生理功能的发育也具有一定的影响。细胞膜的被动膜特性主要有静息膜电位、膜电容(Cm)及膜电阻(Rin)。静息膜电位随着细胞膜发育的进行逐渐趋近于成熟神经元的静息膜电位(-70 mV)，在分化3 d时，神经营养因子3-壳聚糖对静息膜电位有一定的促进作用。在可溶性神经营养因子3和神经营养因子3-壳聚糖的作用下，神经元的膜电阻在分化1 d时显著降低，而分化3 d时各组的神经元膜电阻均有明显下降，但是不同组之间的差异较不明显，膜电阻减小反映了细胞膜上的离子通道逐渐成熟，这说明可溶性神经营养因子3和神经营养因子3-壳聚糖可以在分化后第1天就对细胞膜电阻产生影响，相比其他组更早的呈现出成熟神经元的膜电阻特性。
电压门控钾(KV)通道是一大类 K+选择性通道，可响应膜电压的变化而打开和关闭。在神经细胞中，电压依赖性K+通道负责的跨膜转运钾离子，并且是调节动作电位振幅频率以及神经元兴奋性持续时间的关键[25]。KV4.2在中枢神经系统中广泛表达，尤其是在神经元的树突和胞体中。KV4.2在神经元兴奋性和树突状信号整合在调控中发挥了至关重要的作用[26-27]。因此，通过免疫荧光染色观察了神经元上K+通道的发育情况，同时通过全细胞膜片钳记录外向K电流的变化情况，发现在细胞分化的第1天，可溶性神经营养因子3作用的K+电流幅值明显增加，而到了分化的第3天，NT3-壳聚糖组的K+通道电流幅值明显增加，并且一直维持到了发育晚期。这从一定程度上说明在分化的第1天，营养因子的加入对K+通道的发育有一定的促进作用，而到了第3天时，由于神经营养因子3-壳聚糖对于营养因子的缓释作用导致培养基中的营养因子含量维持在一个稳定的浓度，并可以促进细胞膜上的K+通道的发育。
电压门控钠通道(NaV)家族是一类对产生和传播动作电位至关重要的离子通道。NaV1.6 是在成熟轴突初始段和节点中表达的主要电压门控钠通道亚型，对神经元冲动的启动和传播至关重要[28-30]。通过免疫荧光染色观察了神经元上Na+通道的发育情况，同时通过全细胞膜片钳记录内向Na电流的变化情况，发现神经营养因子3-壳聚糖对于Na+通道的促进作用在神经元发育中晚期(即分化后7-14 d)逐渐显现，这进一步说明神经营养因子3-壳聚糖的缓释作用为神经元提供了一个稳定细胞外环境。
动作电位在神经元细胞体中以频率和模式编码信息，而在轴突中负责信号的远端快速传播[31]。此次实验主要分析了动作电位发放频率、幅值、阈电流及半波宽，结果表明可溶性神经营养因子3和神经营养因子3-壳聚糖在发育早期以及中期对动作电位幅值有一定的促进作用，而发育晚期仅神经营养因子3-壳聚糖的促进作用继续维持。NT3-壳聚糖组神经元的动作电位半波宽减小，意味着动作电位时程减小，发放速度加快，反映了细胞的兴奋性在一定程度上有所增加。同样地，神经营养因子3-壳聚糖促使神经元的阈电流降低，而阈电流与细胞兴奋性相关，这进一步说明了在神经营养因子3-壳聚糖的作用下细胞兴奋性增强。以上结果证实了神经营养因子3-壳聚糖促进并维持了神经元上膜离子通道的发育。
此次实验使用脊髓来源的神经干细胞，脊髓由2种主要类型的神经元群组成：脊髓中间神经元和投射神经元。投射神经元是那些细胞体在脊髓内但投射到脊髓外(到中枢神经系统的其他部分或外周)的神经元。脊髓中间神经元是脊髓内的细胞投射到脊髓内的其他细胞，其包含大量具有独特属性和连接性的神经元类型，并且拥有完整中枢神经系统中运动、感觉和自主神经功能的重要促进剂和调节剂[32-33]。基于此，对发育成熟的神经元亚型进行免疫染色分析，发现神经营养因子3-壳聚糖可诱导获得运动神经元；协同运动决定运动神经元连接性的V1类型中间神经元；协调左右交替运动且参与运动神经元和V2中间神经元产生的V2类型中间神经元；以及调控机械性痛觉感觉中间神经元。以上研究结果表明，神经营养因子3-壳聚糖使发育成熟的神经元亚型多样化。
此次实验通过形态和电生理等方面对神经营养因子3-壳聚糖载体诱导神经干细胞向神经元发育进行了更深一步的探究，但是对于神经营养因子3-壳聚糖载体诱导的成熟神经元中间神经元亚型的研究较浅薄。在KUMAMARU等[34]的研究中报道过神经干细胞可以诱导分化为多种中间神经元亚型，而此次实验只是初步观察到神经营养因子3-壳聚糖载体诱导神经干细胞分化为中间神经元亚型的现象，对于神经营养因子3-壳聚糖载体诱导的多种神经元亚型的形态、数量及其优势等在下一步的工作中会做更为详尽的研究。脊髓中间神经元的类型多样、功能复杂，具有极高的可塑性，随着对脊髓中间神经元亚型的不断认识和对其在损伤后功能贡献的进一步了解，可以定制治疗方案，以最大限度地减少不良后果，并更好地利用其恢复神经可塑性的潜力。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

神经营养因子3-壳聚糖载体诱导神经干细胞分化为神经元的亚型及其电生理特性

Neurotrophic factor 3-chitosan carrier induces neural stem cells to differentiate into neuronal subtypes and their electrophysiological properties

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 7

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	贺垠皓, 李晓声, 陈宏文, 陈铁柱. 3D打印多孔钽金属治疗发育性髋关节发育不良：现状及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1455-1461.
[2]	龙桂月, 李冬冬, 廖红兵. 磷酸钙骨水泥/聚乳酸羟基乙酸降解产物促进小鼠单核细胞破骨向分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1193-1198.
[3]	杨九杰, 李治, 王树杰, 田野, 赵伟. 神经电生理监测硬脊膜切开减压治疗急性脊髓损伤过程中脊髓的功能变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1232-1236.
[4]	杨芷姗, 唐正龙. Hippo信号通路中的核心因子YAP/TAZ参与骨形成的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1264-1271.
[5]	柳晓琳, 穆新月, 马子雨, 刘树泰, 王文龙, 韩晓谦, 董志恒. 水凝胶复合载辛伐他汀蛋白微球对成骨细胞增殖分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 998-1003.
[6]	刘文涛, 冯兴超, 杨毅, 白生宾. M2型巨噬细胞外泌体诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 840-845.
[7]	龙燕鸣, 谢梦生, 黄加洁, 薛文利, 荣慧, 李晓捷. 酪蛋白激酶2相互作用蛋白1调控骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 878-882.
[8]	李欣悦, 李熙恒, 毛天娇, 唐亮, 李江. 三维培养人牙周膜干细胞的形态、活性及成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 846-852.
[9]	袁维, 刘静东, 徐广辉, 康健, 李富平, 王英杰, 支中正, 李冠武. 人血管周围干细胞成骨分化及Wnt/β-catenin信号通路的调控[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 866-871.
[10]	乔鲁卉, 马子雨, 郭浩宇, 侯玉东. 葛根素与淫羊藿苷对小鼠前成骨细胞生物学性能影响的比较[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 872-877.
[11]	廖益东, 明江, 宋文学, 王梓力, 张宇, 廖一飞, 徐卡娅, 杨华. 一种同时培养原代皮质及海马神经元的实验方法[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 897-902.
[12]	郝柳芳, 段红梅, 王子珏, 郝飞, 郝鹏, 赵文, 高钰丹, 杨朝阳, 李晓光. 转基因小鼠脊髓损伤后室管膜细胞的时空动态变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 883-889.
[13]	李晓寅, 杨晓青, 陈淑莲, 李正超, 王梓琪, 宋震, 朱达仁, 陈旭义. 胶原/丝素蛋白支架联合神经干细胞治疗创伤性脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 890-896.
[14]	陈国栋, 郑美妍, 张鹏, 王振超, 金利新. 脊神经后根切断大鼠脊髓后角神经元和星形胶质细胞变化及白细胞介素1β和胶质纤维酸性蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 726-731.
[15]	代香林, 张文凤, 姚喜军, 商佳琪, 黄秋瑾, 任怡帆, 邓久鹏. 钛酸钡/聚乳酸复合压电薄膜材料对MC3T3-E1细胞黏附、增殖和成骨分化能力的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(3): 367-373.