2.1   实验动物数量分析   实验选用SD大鼠30只，分为3组，全部进入结果分析。
2.2   皮瓣大体观察   术后1 d进行大体观察，各组大鼠皮瓣肿胀程度并无明显差别，膨体聚四氟乙烯膜组皮瓣术后(5.4±1.3) d肿胀完全消退；硅胶膜组皮瓣术后(6.3±1.6) d肿胀完全消退；对照组术后(8.7±2.1) d肿胀完全消退；膨体聚四氟乙烯膜组、硅胶膜组肿胀消退时间少于对照组(P < 0.05)，膨体聚四氟乙烯膜组和硅胶膜组肿胀消退时间比较差异无显著性意义。皮瓣术后，硅胶膜组有4只大鼠皮瓣远端部分坏死，伤口愈合差，6只大鼠愈合尚可，术后2周皮瓣再次切开，看到血管再生，轴心血管再生，有1只大鼠皮瓣远端无坏死，但是硅胶出现卷曲，箭头部位也可见明显的血管再生，见图2。膨体聚四氟乙烯膜组大鼠伤口愈合良好，术后2周拆线，皮瓣再次切开，可见明显轴心血管，见图3。







2.3   皮瓣组织苏木精-伊红染色结果    术后第14天，通过苏木精-伊红染色观察各组大鼠皮瓣组织学变化，见图4。膨体聚四氟乙烯膜组大鼠组织坏死明显减少，新生血管明显增多。对照组和硅胶膜组的微血管密度值分别为(19.45±2.24)/mm2和(24.01±3.54)/mm2(P < 0.05)，而膨体聚四氟乙烯膜组的微血管密度值为(30.52±3.87)/mm2，与硅胶膜组相比有所升高(P < 0.05)。




2.4   CD34免疫组化染色结果   CD34是内皮细胞的常见标志物，与血管新生有关，CD34阳性血管数可以反映新生血管密度，见图5。对照组和硅胶膜组大鼠的CD34阳性血管数分别为(13.20±1.96)/mm2和(17.60±2.30)/mm2，膨体聚四氟乙烯膜组CD34阳性血管数显著增加，CD34阳性血管数为(24.67±3.75)/mm2(P < 0.05)。



2.5   血管内皮生长因子免疫组化染色结果   血管内皮生长因子免疫组化染色阳性结果表现为血管内皮细胞及血管周围细胞胞浆染成棕黄色，见图6。对照组和硅胶膜组大鼠血管内皮生长因子蛋白的积分吸光度值分别为42 057.45±3 461.54和52 485.05±4 141.24(P < 0.05)，而膨体聚四氟乙烯膜组为(72 150.44±6 284.18)(P < 0.05)。



2.6   超氧化物歧化酶活性和丙二醛水平   膨体聚四氟乙烯膜组和硅胶膜组大鼠超氧化物歧化酶活性高于对照组(P < 0.05)，膨体聚四氟乙烯膜组超氧化物歧化酶活性高于硅胶膜组(P < 0.05)。膨体聚四氟乙烯膜组、硅胶膜组丙二醛水平均低于对照组，膨体聚四氟乙烯膜组丙二醛水平低于硅胶膜组(P < 0.05)，见图7，表1。

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皮瓣移植是组织缺损修复与再造的主要手段。近年来，随着显微外科技术、计算机辅助设计和预制技术的发展，突破了传统皮瓣技术应用中存在的皮瓣转移后静脉淤血、新血管生成时间长等诸多问题[1]，极大地提高了疗效，是目前修复重建外科发展的前沿问题之一。而预构皮瓣概念的提出，人们即认识到这一技术的巨大优势，预构皮瓣是按一定的设想设计，人为地在非轴型皮瓣的皮下先植入一套轴心血管，经过一段时间，当移植的轴心血管与皮瓣沟通后，可作为轴心皮瓣应用于缺损器官的修复[2-6]。预构皮瓣的历史发展热点一直集中在血管植入如何促进血管再生[7-11]。陈向军等[12]研究发现兔腓肠神经营养血管逆行阻隔延迟皮瓣血运明显强于非阻隔延迟皮瓣，其皮瓣下方放置材料为硅胶膜，阻断了皮瓣垂直血运，皮瓣的毛细血管压力降低，蒂部形成纵轴血运，血液供应增快，因而皮瓣肿胀消除快，可提高皮瓣成活率。可见预构皮瓣通过血管植入已经取得了一定的效果，但是仍然难以避免预构时间较长、预构过程中感染等情况。

一般阻隔用的生物医学材料有硅胶膜等天然高分子材料和医用涤纶片、膨体聚四氟乙烯等人工合成材料等[13]。硅胶膜作为阻隔材料应用较早，排异反应临床常见。膨体聚四氟乙烯是一种新型的医用高分子材料，由聚四氟乙烯树脂经拉伸等特殊加工方法制成，具有良好的生物相容性及特有的微孔结构，无毒、无致癌、无致敏等不良反应。该实验选用硅胶膜、膨体聚四氟乙烯膜阻隔材料，通过阻隔延迟方法在大鼠背部预制皮瓣，术后观察大鼠皮瓣血管再生情况，以期找到更适合的预构皮瓣阻隔材料，加速皮瓣轴心血管再生。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

1.1   设计   随机对照动物实验。整体比较采用方差分析，组间比较采用t检验。
1.2   时间及地点   实验于2018年1-3月在河南中医药大学以及第二临床医学院完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   取SPF级三四月龄的健康成年SD大鼠30只，雌雄不限，体质量(350±50) g，由郑州大学实验动物中心提供，实验动物批号：郑州大学41003100005069，购入后适应环境单笼饲养1周，饲养环境温度为(22±3) ℃、湿度为(50±10)%、明暗周期为12 h/12 h，允许自由进食和饮水。实验方案经河南省中医院实验动物伦理委员会批准(医学伦理批号：PZ-HNSZYY-2017-069)。
1.3.2   阻隔材料   硅胶片(上海威宁整形制品有限公司)；膨体聚四氟乙烯(上海索康医用材料有限公司)。
1.3.3   主要试剂   超氧化物歧化酶活性检测试剂盒(Abcam公司)；丙二醛水平检测试剂盒(Abcam公司)；鼠抗CD34一抗(Sigma公司)；鼠抗血管内皮生长因子一抗(武汉博士德生物公司)；辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG抗体(武汉博士德生物公司)。
1.4   实验方法   
1.4.1   动物分组   将30只SD大鼠随机分为3组，每组10只，分别为对照组、硅胶膜组、膨体聚四氟乙烯膜组。硅胶膜组、膨体聚四氟乙烯膜组采用阻隔延迟方法预制双侧后背任意皮瓣，共40个皮瓣，对照组采用非阻隔延迟方法预制皮瓣，共20个皮瓣。

1.4.2   背部双阻隔延迟皮瓣模型建立   手术前将现配制好的1%戊巴比妥钠按照40 mg/kg注入大鼠腹腔进行麻醉，观察麻醉状态，进行俯卧位固定，剔除背部毛发，术区常规铺碘伏巾。根据大鼠背部局部解剖学结构，观察血管走行，建立背部双阻隔延迟皮瓣模型[14]。以背部两侧旁开1 cm设计皮瓣，用龙胆紫标记，皮瓣长7.5 cm，宽1.5 cm，见图1A；在深筋膜浅层切开皮肤，以皮瓣蒂部无可见穿支血管为宜，沿途结扎从大鼠脊柱动脉发出的血管穿支。按标记范围由近向远切取皮瓣，从深筋膜下方潜行分离皮瓣，尽量保留肌膜。皮瓣解剖过程完成后，掀起皮瓣，硅胶膜组、膨体聚四氟乙烯膜组将硅胶膜、膨体聚四氟乙烯膜分别植入大鼠皮瓣下方，见图1B，C；分层缝合皮下组织和皮肤，术区无菌辅料包扎、固定。对照组皮瓣下方不垫阻隔物，直接原位缝合。术后所有实验动物均肌注青霉素8×104 U。手术及治疗完毕后送回动物室，单笼饲养，保持室温25 ℃左右，并对动物室行紫外线消毒，3次/d，三氯异氰尿酸消毒片溶液地面消毒，防止外源性感染发生。

1.5   主要观察指标   
1.5.1   术后大体观察   皮瓣肿胀程度、血管再生情况。
1.5.2   皮瓣组织学苏木精-伊红染色观察   术后第14天，各组大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠溶液麻醉后处死，解剖取得实验所需血管蒂部组织，立即浸泡于40 g/L多聚甲醛中常温固定24 h，随后依次放入梯度乙醇中脱水，二甲苯中透明，石蜡中浸蜡，包埋机包埋，将蜡块连续切片，切片厚度为5 μm，对切片进行苏木精-伊红染色，置于显微镜下观察拍照。应用Leica Q 500MC显微图像分析系统，每张切片随机计数5个视野中血管断面个数，计算出相同视野下的组织面积，按血管断面均数/视野组织面积，即可知道单位面积内血管密度(个/mm2)。
1.5.3   皮瓣组织CD34阳性血管数及血管内皮生长因子蛋白免疫组化染色检测   将蜡块切成5 μm厚切片，放入二甲苯中脱蜡，在梯度浓度乙醇中复水，放入体积分数3%过氧化氢溶液中室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶，PBS洗3次，5 min/次，加入500 mL枸橼酸盐缓冲液中(pH值6.0)，加热至液体稍沸腾，保持约10 min，再置于室温下冷却，PBS洗3次，3 min/次，加入正常山羊血清(PBS稀释) 室温封闭10 min，倒去血清，不冲洗，加入鼠抗CD34单克隆抗体(1∶100)、鼠抗血管内皮生长因子单克隆抗体(1∶100) 4 ℃孵育过夜，PBS洗3次，5 min/次，加入辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG抗体室温孵育30 min，PBS冲洗3次，5 min/次，加入链霉亲和素-生物素复合物(SABC)室温孵育20 min，PBS冲洗3次，5 min/次，加入二氨基联苯胺(DAB)显色剂孵育10 min，自来水冲洗，苏木素复染10 min，自来水冲洗，盐酸乙醇分化30 s，中性树脂封固，显微镜观察。

CD34免疫组化染色阳性结果表现为在毛细血管腔面、细胞膜突起部位和内皮细胞膜之间交错的部位可见棕黄色颗粒，先在100倍视野下观察确定微血管密度最高的区域，然后在200倍视野(面积为0.075 mm2)下每张切片随机选择5个血管最高密度区域，计数微血管数目。以与背景明显有别的任何一个染成棕色的内皮细胞或细胞群作为1个血管。

血管内皮生长因子免疫组化染色阳性结果表现为血管内皮细胞及血管周围细胞的胞浆染成棕黄色，用Image Pro Plus 6.0图像分析系统在200倍视野下随机选取5个不同区域，检测该区域阳性细胞染色的积分吸光度值。
1.5.4   超氧化物歧化酶活性和丙二醛水平检测   术后第14天，取各组皮瓣组织，称质量，匀浆，以3 500 r/min离心15 min，收集上清液，通过黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶活性，采用改良TBA法检测丙二醛水平。①黄嘌呤氧化酶法：将0.1 mL上清液与1.4 mL黄嘌呤氧化酶混合，然后在37 ℃水浴中孵育40 min，然后在室温下孵育10 min，加入2.0 mL显色剂室温放置10 min，蒸馏水调零，酶标仪检测550 nm处吸光度值；②改良硫代巴比妥酸法：将0.1 mL上清液与0.1 mL无水乙醇、0.1 mL硫代巴比妥酸和4.0 mL显色剂混合，在95℃水浴中放置40 min，然后将该混合溶液在流水中冷却，4 000 r/min离心10 min，收集上清液，酶标仪检测532 nm处吸光度值。
1.6   统计学分析   采用SPSS 17.0 统计软件对数据进行统计学分析。所有计量资料数据均以x±s表示，组间比较采用t检验，P < 0.05表示差异有显著性意义，P < 0.01表示差异有非常显著性意义。统计学方法已经过河南中医药大学生物统计学专家审核。

1966年，Diller等[15]最早提出预构的概念，该实验得出的结论是用狗的含血管回肠片段能维持预构皮瓣及皮下组织成活，之后陆续有学者在大鼠、兔、狗等动物模型上将轴心血管植入到所需供区而创造了新的轴型皮瓣供区[16-20]，植入到新的轴型皮瓣供区的可以是肠系膜血管蒂、单纯血管束、筋膜血管蒂或肌血管蒂[21-27]，预构皮瓣血供良好。

如何加速预构皮瓣形成是目前研究的热点之一。一种预构方式通过皮下植入扩张器扩张皮肤使皮瓣面积增大[28-30]，另一种预构方式阻隔延迟皮瓣(远超正常长宽比例)[31-32]，第一步不进行移植而是将其原位回植，在二期行皮瓣移植，尤其适用于肢体远端创面修复。切开皮瓣周缘皮肤，保留一侧皮瓣与正常组织相连为蒂，或者保留较为细小的穿支，在皮瓣下面垫入乳胶片充当阻隔物以阻断皮瓣和其深面组织之间的血管再生以及皮瓣两侧与周围皮肤的血供。

预构皮瓣阻隔材料是生物医学材料，属于软组织修复和整形外科范畴，对于哪些生物医学材料适合作为阻隔材料，以及哪些阻隔材料对预构皮瓣蒂部血管再生有促进作用，尚缺少系统性专项研究，如果选择不当易导致局部感染、阻隔失败或皮瓣预构时间过长等问题。预制皮瓣的核心问题是重建血运，血运重建不足极易导致预构皮瓣坏死，因此很多学者希望通过施加一些干预手段，促进预构皮瓣的血运重建，提高其成活率。HICKEY等[33]应用了碱性成纤维细胞生长因子证明能加速血管化过程；BAYATI等[34]证明碱性成纤维细胞生长因子、高压氧均加速预构皮瓣的血管化，且两者有叠加作用。成纤维生长因子缓释剂也可促进皮瓣成活和成熟[35]。ZHANG等[36]研究表明自体非活化富血小板血浆可促进预制皮瓣的成活，术中注射可显著提高预制皮瓣的成活率。在预构皮瓣一期手术时使用低氧模拟剂去铁胺，能显著提高预构皮瓣的血管化并增强皮瓣活力[37]。MAITZ等[38]证明在植入血管前1周或植入血管后1周，将皮瓣延迟有助于提高皮瓣的成活。而陈向军等[12]研究发现兔腓肠神经营养血管逆行阻隔延迟皮瓣血运明显强于非阻隔延迟皮瓣，其皮瓣下方放置材料为硅胶膜，实验表明硅胶膜防止血管化向下发展，也有助于皮瓣轴心血管化进程。可见预构皮瓣通过血管植入已经取得了一定的效果，研究比较全面而详细；但是仍然难以避免预构时间较长、预构过程中感染等情况。

由于预构皮瓣阻隔材料植入时间较短，主要表现在其功能性和免疫性方面，相关研究主要集中在诱导血管再生。虽然生物医学前沿研究正在取得重大进展，但是由于技术及其他原因，传统材料至少仍将是未来20-30年内生物医学工程产业的基础和临床应用的重要材料。传统生物医学材料生物学性能的改进和提高，亦是当代生物医用材料发展的另一个重点，硅胶膜作为阻隔材料应用较早，其能提高皮瓣存活率[39-40]，但是排异反应临床常见。此次实验旨在选用硅胶膜和膨体聚四氟乙烯膜作为阻隔材料，通过阻隔延迟方法预制大鼠皮瓣，在术后对皮瓣进行大体观察，硅胶膜组有4只大鼠皮瓣远端部分坏死，伤口愈合差，6只大鼠愈合尚可，术后2周皮瓣再次切开，看到轴心血管再生，有1只大鼠皮瓣远端无坏死，但是硅胶出现卷曲。膨体聚四氟乙烯膜组大鼠伤口愈合良好，术后2周拆线，皮瓣再次切开，可见明显轴心血管。术后第14天取得实验材料血管蒂部的组织切片，进行苏木精-伊红染色和CD34、血管内皮生长因子免疫组化检测，判断阻隔材料对血管再生的影响，血管内皮生长因子染色结果显示膨体聚四氟乙烯膜组通过刺激血管内皮生长因子表达发挥促血管生成作用；而且苏木精-伊红染色和CD34染色的平均微血管密度结果均显示膨体聚四氟乙烯膜组新生血管形成增多。

研究表明皮瓣的存活与减轻氧化应激有关，在氧化应激条件下，受损的线粒体产生活性氧，过量的活性氧氧化损伤其他细胞成分并导致细胞死亡。在以往研究中，超氧化物歧化酶活性和丙二醛水平被用来评估氧化应激状态。丙二醛是脂质过氧化的终产物，是反映自由基水平的指标；超氧化物歧化酶是对抗氧自由基的防御系统，是抗氧化活性的指标。此次研究发现硅胶膜组超氧化物歧化酶活性低于膨体聚四氟乙烯膜组，而丙二醛水平高于膨体聚四氟乙烯膜组，其可能原因是：硅胶材料对组织细胞有一定的刺激性，易出现毛细血管扩张充血等现象，导致局部充血肿胀，使中性粒细胞过度聚集和激活，释放各种蛋白酶和氧自由基，不利于血管生成；而膨体聚四氟乙烯是一种采用特殊工艺制成的多孔材料，其外观洁白，质地柔软，富有弹性，这种材料是由许多微细纤维经节点连接构成的网状结构，具有极微细的孔隙，组织细胞可以向其内生长，因此它的组织相容性非常好，可减轻氧化应激发生，利于血管生成。

结论：研究从预构皮瓣的阻隔延迟材料着手，通过实验设计了硅胶膜和膨体聚四氟乙烯膜对比，研究发现以膨体聚四氟乙烯膜作为阻隔延迟材料，增加了血管生成，减少了氧化应激，为提高皮瓣轴心血管再生速度、提高组织相容性提供了理论依据；但此类材料是否能加快临床预构皮瓣轴心血管的再生速度尚需进一步的实验和临床研究。下一步将指导临床开展预构皮瓣工作，并后续展开相应的组织工程研究，以期找到更适合的预构皮瓣阻隔材料，提高皮瓣成活率，加速皮瓣轴心血管再生和扩大皮肤切取面积。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

文题释义：
预构皮瓣：通过人工的方法，将知名血管或含知名血管的筋膜、大网膜等组织，移植于本来没有知名血管的部位(或区域)的某一层次(常用的是皮下组织层)；或者将游离皮片移植于含有轴型血管的筋膜或大网膜上，经过一段时期重新血管化后形成所需要的轴型皮瓣。
膨体聚四氟乙烯：是一种新型的医用高分子材料，由聚四氟乙烯树脂经拉伸等特殊加工方法制成。白色，富有弹性和柔韧性，具有微细纤维连接而形成的网状结构，这些微细纤维形成无数细孔，使膨体聚四氟乙烯可任意弯曲，其血液相容性好，耐生物老化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

预构皮瓣阻隔材料是生物医学材料，属于软组织修复和整形外科范畴，对于哪些生物医学材料适合作为阻隔材料，以及哪些阻隔材料对预构皮瓣蒂部血管再生有促进作用，尚缺少系统性专项研究，如果选择不当易导致局部感染，阻隔失败或皮瓣预构时间过长等问题。预制皮瓣的核心问题是重建血运，血运重建不足极易导致预构皮瓣坏死，因此很多学者希望通过施加一些干预手段，促进预构皮瓣的血运重建，提高其成活率。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

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