基于高通量测序骨质疏松circRNA-miRNA-mRNA网络构建及Hsa_circ_0076906的功能验证

doi:10.12307/2022.355

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (11): 1705-1713.doi: 10.12307/2022.355

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基于高通量测序骨质疏松circRNA-miRNA-mRNA网络构建及Hsa_circ_0076906的功能验证

王海龙1，李龙1，王建元1，闫斌1，西尔艾力1，陈洪涛2，伊力哈木·托合提1

1新疆医科大学第七附属医院骨科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000；2新疆医科大学第六附属医院运动损伤科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830010

收稿日期:2020-11-26 修回日期:2021-01-07 接受日期:2021-05-23 出版日期:2022-04-18 发布日期:2021-12-11
通讯作者: 陈洪涛，硕士，副主任医师，新疆医科大学第六附属医院运动损伤科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830010 伊力哈木·托合提，博士，主任医师，新疆医科大学第七附属医院骨科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000
作者简介:王海龙，男，1988年生，甘肃省兰州市人，汉族，2014年新疆医科大学毕业，硕士，主治医师。
基金资助:
新疆维吾尔自治区自然科学基金(2020D01C198)，项目负责人：陈洪涛；新疆维吾尔自治区自然科学基金(2017D01C263)，项负责人：伊力哈木·托合提

High-throughput sequencing-based osteoporotic circRNA-miRNA-mRNA network construction and Has_ circ_0076906 functional verification

Wang Hailong1, Li Long1, Wang Jianyuan1, Yan Bin1, Xier Aili1, Chen Hongtao2, Yilihamu · Tuoheti1

1Department of Orthopedics, the Seventh Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Department of Sports Injury, the Sixth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830010, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2020-11-26 Revised:2021-01-07 Accepted:2021-05-23 Online:2022-04-18 Published:2021-12-11
Contact: Chen Hongtao, Master, Associate chief physician, Department of Sports Injury, the Sixth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830010, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China Yilihamu Tuoheti, MD, Chief physician, Department of Orthopedics, the Seventh Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Wang Hailong, Master, Attending physician, Department of Orthopedics, the Seventh Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2020D01C198 (to CHT) and 2017D01C263 (YT)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
高通量测序：又称“下一代”测序技术，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。目前应用最多的是人全外显子组捕获测序，因为外显子组测序的数据分析计算量较小，与生物学表型结合更为直接，高通量测序开始广泛应用于寻找疾病的候选基因上。
circRNA：为circular RNAs(环状RNA分子)的简写，是一类不具有5’ 末端帽子和3’ 末端poly(A)尾巴，并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。部分circRNA分子含miRNA应答元件(miRNAresponse element，MRE)，可充当竞争性内源RNA(competing endogenousRNA，ceRNA)，与miRNA结合，在细胞中起到miRNA海绵的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，上调靶基因的表达水平。

背景：研究表明环状RNA(circRNA)是广泛存在于多种组织中的内源性非编码RNA，可充当microRNA(miRNA)的“海绵”调节哺乳动物的基因表达。但circRNA在骨质疏松症中的表达特征和分子机制以及其潜在的circRNA-miRNA-mRNA调控网络尚未有相关报道。
目的：基于骨质疏松相关非编码RNA高通量测序数据，构建互作网络及功能富集分析，筛选可能通过竞争性内源RNA(ceRNA)机制，并对筛选出的参与骨质疏松发生发展的circRNA进行功能和机制验证。
方法：利用GEO数据库中的骨质疏松非编码RNA高通量测序数据，构建circRNA-miRNA -mRNA网络。随后，对miRNA预测的共表达靶基因进行GO和KEGG分析。采用人间充质干细胞诱导成骨细胞分化，qRT-PCR和Western blot检测筛选出的circ_0076906和其靶向的miR-29b及骨糖蛋白mRNA和蛋白的表达，碱性磷酸酶活性和茜素红染色检测骨形成情况，荧光素酶报告实验以检测基因之间的相互作用。
结果与结论：①实验从GEO数据库中最终筛选了5个共表达circRNA(如circ_0076906，circ_0004276和circ_0003060等)、10个共表达miRNA(如miR-183-5p，miR-29b和hsa-miR-15b-3p等)以及241个共表达mRNA(如骨糖蛋白基因、SMARCC1和LRP6等)，并成功构建了骨质疏松相关circRNA-miRNA-mRNA网络；②GO分析结果揭示了78个生物过程，其主要包括成骨细胞增殖、凋亡和迁移等功能；③KEGG分析FoxO信号通路和PI3K-AKT信号通路传导途径与骨质疏松发生发展密切相关；④对筛选出的差异显著同时有靶向关系的circ_0076906、miR-29b和骨糖蛋白验证结果显示，circ_0076906、miR-29b及骨糖蛋白基因在疏松症患者和对照组骨组织和血清中均呈差异表达，circ_0076906可诱导成骨分化，其沉默可抑制人间充质干细胞的成骨相关基因(骨钙素和RUNX2)表达，circ_0076906可充当miR-29b调节的骨糖蛋白基因表达的海绵；⑤上述数据说明，实验成功构建了骨质疏松circRNA-miRNA-mRNA网络，筛选出的circ_0076906和其靶向的miR-29b及骨糖蛋白基因可能在骨质疏松进展中发挥重要作用；实验进一步证实了人间充质干细胞中circ_0076906通过竞争性抑制miR-29b从而促进骨糖蛋白表达，缓解骨质疏松症并促进成骨分化。该研究方案经新疆医科大学第七附属医院伦理委员会批准，批准号：XY20190501-1。

https://orcid.org/0000-0002-0233-2020 (王海龙)；https://orcid.org/0000-0002-7158-0888 (伊力哈木·托合提)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨, 骨质疏松, 高通量测序, 生物学分析, circ_0076906, miR-29b, 骨糖蛋白, 靶向

Abstract: BACKGROUND: Studies have shown that circular RNA (circRNA) is an endogenous non-coding RNA widely present in a variety of tissues, which can act as a "sponge" of microRNA (miRNA) to regulate mammalian gene expression. However, the expression characteristics and molecular mechanism of circRNA in osteoporosis and its potential circRNA-miRNA-mRNA regulatory network have not been reported yet.
OBJECTIVE: Based on the high-throughput and high-throughput sequencing data of osteoporosis-related non-coding RNAs, to construct an interaction network and functional enrichment analysis, screen the possible mechanisms of competitive endogenous RNA (ceRNA), and verify the function and mechanism of circRNAs involved in the development of osteoporosis.
METHODS: The circRNA-miRNA-mRNA network was constructed using the high-throughput sequencing data of liver cancer non-coding RNA in the GEO database. Subsequently, GO and KEGG analyses were performed on the co-expressed target genes predicted by miRNA. Through human mesenchymal stem cells-induced osteoblast differentiation, qRT-PCR and western blot were used to detect the expression of circ_0076906 and its targeted miR-29b and osteoglycoprotein (OGN) at mRNA and protein levels. Alkaline phosphatase activity and alizarin red staining were used to detect bone formation, and luciferase reporter assay used to detect gene interactions.
RESULTS AND CONCLUSION: The experiment finally screened 5 co-expressed circRNAs (such as circ_0076906, circ_0004276 and circ_0003060, etc.), 10 co-expressed miRNAs (such as miR-183-5p, miR-29b and hsa-miR-15b-3p, etc.), and 241 co-expressed mRNAs (such as OGN, SMARCC1 and LRP6, etc.) from the GEO database, to successfully construct a circRNA-miRNA-mRNA network related to osteoporosis. GO analysis results revealed 78 biological processes, mainly including osteoblast proliferation, apoptosis and migration. KEGG analysis results indicated that FoxO signaling pathway and PI3K-AKT signaling pathway were closely related to the occurrence and development of osteoporosis. The verification results of circ_0076906, miR-29b and OGN, which have significant differences and target relationships, showed that circ_0076906, miR-29b and OGN were differentially expressed in the bone tissue and serum of patients with porosity and the control group. circ_0076906 could induce osteogenic differentiation, and its silencing could inhibit the expression of osteogenic genes (OCN and RUNX2) in human mesenchymal stem cells. circ_0076906 could act as miR-29b regulated OGN expression sponge. The above-mentioned data show that the osteoporosis circRNA-miRNA-mRNA network is successfully established in this study, and circ_0076906 and its targeted miR-29b and OGN screened out may play an important role in the progression of osteoporosis. The study further confirms that circ_0076906 in hMSCs promotes OGN expression by competitively inhibiting miR-29b, alleviating osteoporosis and promoting osteogenic differentiation.The study protocol was approved by the Ethics Committee of the Seventh Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University (approval No.XY20190501-1).

Key words: bone, osteoporosis, high-throughput sequencing, biological analysis, circ_0076906, miR-29b, osteoglycoprotein, targeting

中图分类号:

王海龙, 李龙, 王建元, 闫斌, 西尔艾力, 陈洪涛, 伊力哈木·托合提. 基于高通量测序骨质疏松circRNA-miRNA-mRNA网络构建及Hsa_circ_0076906的功能验证[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(11): 1705-1713.

Wang Hailong, Li Long, Wang Jianyuan, Yan Bin, Xier Aili, Chen Hongtao, Yilihamu · Tuoheti. High-throughput sequencing-based osteoporotic circRNA-miRNA-mRNA network construction and Has_ circ_0076906 functional verification[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(11): 1705-1713.

图/表（结果） 6

2.1 差异cricRNA和miRNAs筛选结果对3个健康对照和3个诊断为骨质疏松的患者的外周血样本测序分析。结果共鉴定到192个cricRNA，上调87个，下调105个，见图1A，B。经阈值筛选鉴定到25个miRNA，上调10个，下调15个，见图1C，D。与健康对照组相比，它们在骨质疏松症中表达差异显著。

2.2 circRNA-miRNA-mRNA网络实验预测差异miRNA的靶向circRNA，共得到8 111个靶向的cricRNA，与差异表达的cricRNA取交集筛选得到143个cricRNA，构建miRNA-cricRNA互作网路，见图2A，B。使用RAIDv2.0差异miRNA靶向mRNA鉴定，预测miRNA的靶基因，靶向调控筛选条件(score > 0.9)，共得到了308个靶向调控的基因，并与miRNA-cricRNA网路结合构建了可能存在调控关系的
cricRNA-miRNA-mRNA的ceRNA互作网络，其中由5个circRNAs节点、10个miRNAs节点、241个mRNA节点和307个连线组成，见图3。

2.3 mRNA分子功能和通路预测结果 GO分析结果揭示了78个生物学过程，其主要涉及15个功能，包括成骨细胞增殖、凋亡、迁移和基因表达的正向调控等，暗示这些cricRNA在骨质疏松发展过程中发挥重要作用。通路分析表明这些共表达cricRNA在细胞周期、FoxO信号通路、MAPK信号通路、PI3K-AKT信号通路、干细胞调节信号通路、肿瘤坏死因子信号通路及破骨细胞分化通路等，其中FoxO信号通路和PI3K-AKT信号通路传导途径与骨质疏松发生发展密切相关，见图4。

2.4 Hsa_circ_0076906在成骨分化中的表达变化通过生物信息学分析，选择了差异最显著的hsa_circ_0076906和其靶向的miRNA 29b以及在骨骼发育中起重要作用的OGN基因进行验证。为了阐明hsa_circ_0076906在骨质疏松症中的功能，分析了骨质疏松症患者和对照组中hsa_circ_0076906的相对表达水平，见图5A，B。与对照组相比，骨质疏松症组中hsa_circ_0076906的表达在骨组织和血清中均显著降低(P < 0.05)，这表明hsa_circ_0076906为阴性，是骨质疏松症的调节剂。人间充质干细胞细胞分化为成骨细胞后，成骨标志物骨钙素和RUNX2的表达逐渐增加，同时hsa_circ_0076906的表达也增加，见图5C-E。

2.5 敲除hsa_circ_0076906后人间充质干细胞中成骨相关基因表达 sicirc_0076906#1的抑制效率为75%，si-circ_0076906#2的抑制效率为70%，见图6A。人间充质干细胞诱导成骨后第14天，转染circ_0076906的siRNA，si-circ_0076906#1和si-circ_0076906#2均明显降低了RUNX2和骨钙素的mRNA和蛋白质水平，见图6B，C。与si-NC相比，在si-circ_0076906#1和si-circ_0076906#2均降低了碱性磷酸酶活性，见图6D。人间充质干细胞诱导后第14天进行茜素红染色，circ_0076906 si-RNA转染后，矿化的基质明显减少并且对洗脱的部分进行了量化，见图6E，以上结果表明抑制hsa_circ_0076906也抑制了成骨分化。

2.6 circ_0076906与miR-29b关系验证结果为了进一步研究hsa_circ_0076906在人间充质干细胞中发生成骨的机制，首先分离人间充质干细胞的核和细胞质，并通过qPCR检测hsa_circ_0076906的表达，结果hsa_circ_0076906的表达主要位于细胞质中(70%)，见图7A。由于大多数circRNA都起着竞争内源性RNA(ceRNA)的作用，因此搜索了其靶相互作用miRNA，将microRNA miR-29b与circ_0076906的匹配结合位点进行了配对，见图7B。通过改变一些circ_0076906核苷酸，构建了一个突变体circ_007690 (circ_0076906-mt)，共转染circ_0076906-wt/circ_0076906-mut/带有萤光素酶报告载体的miR-NC到人间充质干细胞后。对miR-29b萤光素酶活性的检测表明，circ_0076906-wt中的荧光素酶活性极低，而circ_0076906-mut中无影响，见图7C，这意味着在细胞质中circ_0076906键合了miR-29b，充当了调节功能的“海绵”。circ_0076906被抑制后，细胞的活性和miR-29b表达量均明显上升，见图7D-E；而过表达circ_0076906后，miR-29b的表达降低，见图7F。miR-29b的表达清楚地证明了circ_0076906能影响miR-29b在人间充质干细胞中的功能。与对照组相比，在成骨病例骨组织和血清中，检测到miR-29b的水平明显更高，见图7G。在成骨细胞诱导的人间充质干细胞中，miR-29b的表达水平也逐渐降低，见图7H。这些结果表明miR-29b在成骨细胞中起着积极的调节作用，并抑制成骨细胞的分化。

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引言

骨质疏松症是一种进行性骨疾病，其特征是骨量和密度降低，该疾病可分为原发性骨质疏松症和继发性骨质疏松症。骨质疏松症和相关的骨折是全世界范围内死亡率和发病率的原因[1]。根据中国卫生部的调查，50-60岁以上的中国人中有9 000万人患有骨质疏松症，特别是中国60岁以上女性患骨质疏松症的概率高达40%。而骨质疏松症给中国患者带来沉重的经济负担[2-3]。骨质疏松症的发生潜在机制是骨吸收与骨形成之间的不平衡，骨质疏松症发展的3个主要机制是峰值骨量不足、骨吸收过度以及在重塑过程中新骨形成不足。据报道，老年妇女的骨形成和骨吸收的总体比率仍然很高[4]。同时，雌激素在维持骨骼稳态中起着根本作用[5]，老年妇女中的雌激素缺乏会导致骨质流失，从而引起骨质疏松[6]。雌激素及其受体被认为是骨质疏松症发病机制的主要因素[7]。此外，峰值骨量(骨骼成熟结束时存在的骨量)是在成年初期获得的，然后随着年龄的增长骨质丢失会加剧[8]。脂肪和骨骼的连接也参与了与年龄有关的骨质流失的病理生理过程[9-11]。在骨质疏松症中观察到与年龄有关的胶原蛋白交联，这可能通过影响矿化过程和微损伤形成而影响骨的力学性能[12]。衰老会引起骨质疏松过程的一系列变化，这使基因组和转录组学成为揭示复杂分子机制的理想方法。
环状RNA(circular RNA，circRNA)是近年来被鉴定为广泛存在于多种细胞中内源性非编码RNA，可调节哺乳动物的基因表达[10]。它们是在特定细胞类型或发育阶段中具有特异性表达模式的RNA分子，开展circRNA的研究扩展了人类基因组中遗传信息在疾病中的作用机制研究思路[11-12]。最早在人类和啮齿动物中发现了一些circRNA，发现它们是在前体mRNA(pre-mRNA)的反向剪接中产生。但是，这些circRNA含量低，被认为是剪接的副产物。近年来，高通量测序和新的计算方法表明，circRNA在组织中是广泛表达的。此外，在人类上皮-间充质转化期间，数百种circRNA被调控[13-14]，这些发现表明，高度表达的circRNA不仅是剪接的副产物，而且还发挥了重要的功能。许多研究已经证明circRNA可以充当微小(RNA microRNA，miRNA)的海绵或与蛋白质结合[15]。改变circRNA水平可以导致基因产物的异常表达，这可能有助于癌症生物学的研究。利用差异表达(DE) circRNA-miRNA-mRNA构建三维网络筛选出的ceRNA关系，可为深入研究相关circRNA 海绵效应机制在疾病中的作用方式提供重要参考。circRNA在骨质疏松症中的表达特征和分子机制尚未有相关报道。人间充质干细胞具有多方向分化的能力，可以分化为软骨细胞、成骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞和神经元细胞。人间充质干细胞易于获得并且在体外具有较高的扩增速率，这些多重优势使其在基因治疗中具有深远的临床意义。人间充质干细胞易于获得并且在体外具有较高的扩增速率，这些多重优势使其在基因治疗中具有深远的临床意义。为了进一步研究circRNA在骨质疏松的潜在作用，文章拟根据网络平台数据构建circRNA、miRNA和mRNA的表达谱，进一步将筛选出的circRNA在人间充质干细胞中进行验证，为circRNA在骨质疏松中的精准诊疗提供新方向。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计基因信息学实验结合病例-对照临床试验结果验证，单因素方差分析与Bonferroni事后检验。
1.2 时间及地点于2018年10月至2020年4月在新疆医科大学第七附属医院骨中心重点实验室完成。
1.3 资料文章数据分析中的患者资料来源为美国国立生物技术信息中心公共数据库，共包括哈尔滨医科大学第二附属医院6个外周血样本，其中3个健康对照者(NORM1，NORM2，NORM3)和3个诊断为骨质疏松的患者(OP1，OP2，OP3)，该研究获得哈尔滨医科大学医学伦理委员会批准，患者及家属阅读并签署了知情同意书。每例患者入院后48 h内取外周血，提取RNA进行基因表达谱分析和比较分析。

1.4 对象连续纳入了2019年3月至2020年4月在新疆医科大学第七附属医院就诊的20例骨质疏松症患者和20例健康体检者为研究对象。
该研究已得到新疆医科大学第七附属医院医院伦理委员会的批准(伦理批准号：XY20190501-1，批准时间：2019-05-01)。研究对象的详细临床特征，见表1。

在手术过程中收集了骨质疏松症患者血液和骨骼样本，以确定circ_0076906、miR29b和RUNX2等的表达。
骨质疏松症患者纳入标准：①均符合骨质疏松症诊断标准[16]；②患者对试验方案知情，并签署书面知情同意书。
骨质疏松症患者排除标准：①伴压缩性骨折、风湿关节炎患者；②由糖尿病、甲状腺功能亢进、营养代谢性骨病及严重肝肾疾病等所致的继发性骨质疏松者；③经6个月接受抗骨质疏松治疗及皮质类固醇激素等使用史者；④伴强直性脊柱炎和腰椎间盘突出等致痛疾病者；⑤伴肢端肥大症者和伴恶性肿瘤者；⑥有长期免疫抑制剂服用史者。
1.5 方法
1.5.1 基因信息学检测
基因芯片GSE159121数据集下载：首先从美国国立生物技术信息中心公共数据平台GEO(https://www.ncbi. nlm.nih.gov/gds/?term=)下载基因芯片GSE159121数据集，下载完成后借助limma包对上述所查询出的数据进行标准化处理。
差异靶点基因的筛选及数据处理：为筛选骨质疏松患者与健康对照组差异表达的非编码RNA。首先，使用背景Correct函数对数据进行背景校正和标准化。其次，用Between Arrays函数对数据归一化处理后过滤出对照探针和低表达的探针。然后，使用R语言DESeq2包基于贝叶斯函数鉴定数据集的差异表达cricRNA和miRNA。差异基因需满足以下条件：logFC绝对值>1，P < 0.05，所得的差异基因用火山图进行可视化处理。
circRNA-miRNA-mRNA网络的构建：使用starbase数据库预测差异miRNA的靶向circRNA得到靶向的cricRNA，与差异表达的cricRNA取交集筛选得到的cricRNA构建miRNA-cricRNA互作网路。使用RAIDv2.0，预测miRNA的靶基因，靶向调控筛选条件(score > 0.9)，得到靶向调控的基因，并与miRNA-cricRNA网络结合构建了可能存在调控关系的cricRNA-miRNA-mRNA的ceRNA互作网络。处理过程中所需RNA序列从miRBase和circular RNA Interactome上获取。
差异基因功能富集和通路分析：使用R语言Clusterprofiler包对差异表达基因进行基因本体论(GO)和和京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析评估共表达网络中RNA 分子的潜在功能。利用Cytoscape的CluGO应用对差异表达进行KEGG 通路富集分析。此外，通过GSEA软件分析差异基因参与的Go功能和KEGG信号通路。设置筛选阈值P < 0.05。
1.5.2 临床试验结果验证
人间充质干细胞细胞系培养和分化：人骨髓来源的间充质干细胞系购自ATCC(Manassas，VA，USA)，该细胞由北美临床试验注册中心(www.clinicaltrials.gov)的人群中分离，所有程序均获得了对应机构的医学伦理委员会审核和同意。在基础培养基中适应性培养后，以每孔2×104个细胞培养在24孔板中。当细胞融合度达到80%-90%时，用胰蛋白酶消化后传代，并在新的75 cm培养瓶中扩增，扩增比例为1∶3。每隔两三天更换1次培养基。对于人间充质干细胞的分化，将细胞接种在含改良的培养基的6孔板或24孔板中，该培养基包含体积分数10%的胎牛血清(美国Gibco公司)、1% L-葡萄糖、2%谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素、
0.25 mmol/L抗坏血酸、10 mmol/L磷酸甘油和10 nmol/L地塞米松，并在体积分数5%CO2，37 ℃培养箱中培养，培养14 d后，认为人间充质干细胞已分化[17]，诱导成功标准为茜素红染色明显增加。诱导分化的人间充质干细胞立即用于后续实验。
实时荧光定量PCR：用以骨质疏松症患者和对照组中骨和血清样品circ_0076906及人间充质干细胞中Hsa_circ_0076906、成骨相关基因和miR-29b表达分析。具体步骤如下：使用AllPrep RNA试剂盒(美国QIAGEN公司)提取患者骨骼组织的总RNA。使用iScript反转录试剂盒(美国Bio-Rad公司)合成cDNA。根据相关参考文献设计引物，由上海生工公司合成。引物序列信息，见表2。

使用SYBR Green Supermix(北京全式金公司)进行相关基因表达的qRT-PCR分析。扩增程序95 ℃下运行3 min；95 ℃持续5 s和60 ℃持续30 s，共40个循环。基因的相对表达量以2-ΔΔct方法计算。
Western blot检测：将人间充质干细胞在含20 mmol/L Tris·HCl缓冲液，pH 7.5，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L Na2EDTA，1 mmol/L EGTA，2.5 mmol/L焦磷酸钠，1 mmol/L β-甘油磷酸，1 mmol/L的Na3VO4和1×裂解缓冲液中的冰上裂解提取总蛋白。将处理后的样品定量后按照20 μg总蛋白上样至8%-12%的SDS聚丙烯酰胺凝胶中电泳1 h，然后在4℃下将其转移至0.2 μm PVDF膜(Bio-Rad)上，放置于5%脱脂奶粉中孵育1h。用体积分数5%脱脂奶粉配制一抗[RUNX2(小鼠单抗，英国Abcam公司)，1∶1 000；骨钙素(小鼠多克隆抗体，英国Abcam公司)，1∶1 000；β-actin(内参，小鼠单克隆抗体，江苏碧云天公司)，1∶2 000]后分别过夜孵育。1×PBS清洗5次(每次5 min)后辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(1∶2 000)孵育40 min后清洗，通过化学发光观察蛋白表达量，根据ImageJ软件计算灰度值与对照组比较判断相对灰度值。
RNA干扰(siRNA)和过表达片段合成和转染：circ_0076906 siRNA(si-circ_0076906#1和sicirc_0076906#2)和阴性对照siRNA(si-NC)购自上海吉玛生物。使用Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)转染SiRNA。在诱导的第14天将人间充质干细胞细胞接种到6孔板中，当它们在转染时达到80%-90%融合时，分别在5 min后将无血清培养基稀释的85 pmol/L siRNA和8.5 μL的Lipofectamine 2000混合在一起。孵育20 min后向人间充质干细胞中添加复合物。细胞连续孵育24 h并收集RNA和蛋白质。通过qPCR获得Hsa_circ_0076906 DNA片段，将这些DNA克隆到表达载体中，并用Lipofectamine转染到人间充质干细胞中实现Hsa_circ_0076906的过表达。
碱性磷酸酶活性测定：在人间充质干细胞分化诱导的第14天和circ_0076906沉默后，将细胞接种在6孔板中，然后用体积分数1%的Triton X-100的裂解缓冲液处理15 min，并以10 000×g 离心5 min收集上清液。使用碱性磷酸酶测定试剂盒(Abcam公司，美国)，在光学显微镜下(Promega，美国)及紫外线波长450 nm进行测量和计算吸光度值。
茜素红染色(ARS)：人间充质干细胞成骨分化14 d后，将细胞用hsa_circ_0076906 siRNA(si-circ_0076906#1和sicirc_0076906#2)或阴性对照siRNA(si-NC)转染，细胞用PBS洗涤3次，转染后24 h，在体积分数60%异丙醇中固定60 s，并用PBS洗涤2次，每次2 min。将人间充质干细胞置于体积分数10%ARS中10 min在紫外线分光光度计下定量(A570 nm)。
人间充质干细胞的细胞质和细胞核的分离：为了检测基因在人间充质干细胞的细胞质或核中的表达情况。按照说明书的流程，用NE-PER核和细胞质提取试剂(Thermo公司)进行人间充质干细胞的细胞质和核的分离。将提取的细胞质或细胞核裂解液保存在-80 ℃以便进一步使用。
双荧光素酶报告基因分析：实验首先在人间充质干细胞 cDNA中分离扩增了circ_0076906-wt和circ_0076906 -mut的DNA片段，引物序列见表2。然后构建了荧光素酶报告载体miR-29bmimic或miR-NC，miR-29b /circ_0076 906-wt或miR-NC/circ_0076906-wt或miR-29b/circ_0076906-mut或miR-NC/circ_0076906-mut转染到人间充质干细胞或HEK-293 T细胞系中。用双重荧光素酶报告基因检测法进行报告基因检测系统(美国Promega公司)。实验还用OGN 3’UTR wt构建了OGN 3’UTR突变体。然后构建为萤光素酶报告载体。转染HEK293T细胞或人间充质干细胞和荧光素酶活性进行了检测，用Firefly/Renilla荧光素酶读数即得到样品的相对荧光素酶活性。
1.6 主要观察指标骨组织和血清中hsa_circ_0076906表达，人间充质干细胞成骨诱导后成骨相关基因RUNX2和骨钙素表达水平变化，人间充质干细胞成骨诱导后circ_0076906变化趋势，转染circ_0076906 siRNA后RUNX2和骨钙素的mRNA和蛋白表达水平变化，转染circ_0076906 siRNA后碱性磷酸酶活性，circ_0076906与miR-29b靶向关系。
1.7 统计学分析使用SPSS 22.0软件统计和分析数据，所有的qPCR实验均重复3次。计量数据用x±s表示，多组间数据差异采用单因素方差分析与Bonferroni事后检验进行统计分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

circRNA由于在组织中表达稳定、不易降解的特点，近年来作为生物标志物在骨代谢相关疾病的筛选中越来越引起重视。骨质疏松是最常见的代谢性骨病，作为最常见且治疗费用最高的疾病之一，其特点是具有低创伤性骨折的风险。全球60岁以上老年人近1/2女性和1/4男性都会受骨质疏松性骨折的影响，其中最严重的是髋部骨折，50%的患者骨折后不能恢复到骨折前的状态，25%的患者需长期家庭护理，还有25%患者在12个月内死亡[18]。骨质疏松是一种多基因控制的家族性疾病。体内成骨细胞与破骨细胞在骨重塑过程中扮演着重要角色，骨吸收与形成的不平衡导致了骨质疏松的形成。
目前已知的多种信号通路可以调节成骨细胞和破骨细胞分化和形成。随着高通量测序技术的发展，给骨质疏松等复杂疾病的研究提供了强大的技术支撑。随着精准医疗计划的提出，疾病的研究也迎来了更大的挑战。
circRNA是一类今年重新被引起关注的非编码RNA。随着微阵列技术、测序技术和生物信息学的发展，人们已经确定了circRNA在人组织中广泛表达。在最近几年的研究中已证实，circRNA在组织中以特殊的方式调节各种病理生理事件，例如器官发生、肿瘤发生和器官发育[19]。
有研究表明circRNAs表达谱在破骨细胞形成过程中会发生变化[20]，但circRNA不同于其他的非编码RNA，它有着不受核酸外切酶影响的特性，表达稳定、不易降解，可以与疾病相关的miRNA相互作用，而在疾病中发挥重要的调控作用，那么cireRNA是否在骨质疏松症中发挥重要的调控以及是否可以作为新型生物标记物目前还没有相关报道。此次实验根据网络平台数据对健康对照组和骨质疏松患者外周血样本进行测序结果分析，构建circRNA、miRNA 和mRNA 的表达谱，结果共鉴定到差异表达的192个cricRNA，提示这些circRNA在骨质疏松症中可能起重要作用。这些差异表达的circRNA的基因组分布表明，大多数circRNA都是从chr1，chr2，chr3和chr6转录所得的。由于循环miRNAs的水平测量受很多因素的影响，miRNAs水平测量极其不稳定。那么，具有较强的稳定性及丰富的含量可作为miRNAs的海绵体的circRNA有望成为一种新型骨质疏松症早期诊断和骨代谢的标志物。
生物信息学分析利用网络数据快速分析和选择，可帮助科研工作者在浩瀚的数据中发现和确定新的药物靶点和疾病生物标志物。目前已有研究证实了cricRNA在许多疾病中可能起重要作用，包括癌症/糖尿病和痰菌病[21]。例如，发现源自肿瘤抑制基因Foxo3的circRNA可以促进癌细胞凋亡[22]。以往的研究发现，hsa_circ_0001275可以作为绝经后骨质疏松症患者的潜在诊断生物标志物[23]。但是，仍然没有很好地说明circRNA在骨质疏松症中的表达特征和潜在功能。实验通过构建circRNA-miRNA-mRNA网络和分子功能和通路预测，最终推测环状RNA circ_0076906可能与骨糖蛋白基因竞争miR-29b结合位点，以延缓骨质疏松症的进展。同时还分析出FoxO信号通路和PI3K-AKT信号通路传导途径与骨质疏松发生发展密切相关。circRNA成为热点研究领域由来已久，但在骨代谢方面的研究还很少。仅有的研究证实，circ_0006873和circ_0002060的表达与骨密度和T评分相关，而与年龄、身高、体质量和其他骨标志物无关。此外，circ_0002060的水平显示出对骨质疏松症的潜在诊断价值，可以通过ROC曲线分析来区分骨质疏松症的患者[15]。这些研究都证实了circRNA成为诊断骨质疏松生物标志物的潜能。
miRNA及circRNA在骨质疏松中的作用近年来引起了越来越多的重视，文章对通过高通量数据筛选出的基因进行了初步验证。miRNA属于非编码RNA家族，可负向调节靶基因的转录和表达[23]。最近的研究表明，miRNA可调节间充质干细胞的分化和决定细胞命运，例如miR-224通过Rac1增强人间充质干细胞的成骨细胞分化[24]；miR-19a-3p通过结合HDAC4的3’UTR抑制HDAC4的表达，从而促进人间充质干细胞的成骨分化，从而减轻了骨质疏松的进展[25]。
另一方面，一些miRNA在人间充质干细胞分化中抑制成骨细胞或促进破骨细胞增殖。如miR-29b通过抑制其靶基因Jagged1(人间充质干细胞的成骨细胞分化增强剂)而对骨形成负调控。circRNA被发现为非编码RNA家族，其环状结构使其缺乏3’和5’极性或聚腺苷酸化尾巴[26]。circRNA可结合microRNA并充当海绵来抑制mRNA翻译，这意味着circRNA通过互补配对与种子区域中的miRNA结合，并完全抑制其目标mRNA的功能。人间充质干细胞具有强大的自我更新能力，并有可能分化为多种类型的细胞，包括成骨细胞和软骨细胞，它们很容易从骨髓或脂肪细胞及其他组织中获得，并具有在体外扩增并向成骨细胞和软骨细胞稳定分化的特征。实验在分析了通过转录组数据筛选的circ_0076906在骨质疏松患者血清和骨组织中差异表达后，进一步在分析了人间充质干细胞中circ_0076906的表达变化，发现随着人间充质干细胞的成骨诱导，表达水平逐渐升高，这表明circ_0076906是骨质疏松症的负调节剂。进一步的实验证明了circ_0076906抑制人间充质干细胞中的成骨分化。当circ_0076906的siRNA沉默时，成骨细胞分化相关基因RUNX2和骨钙素明显下调，矿化基质的碱性磷酸酶活性和茜素红染色也明显下调。
circRNA在细胞生长发育过程中起到调控作用，在人间充质干细胞成骨分化过程中会发生规律变化，其所调控的miRNA的表达水平也会发生相应变化[27]。为了研究人间充质干细胞中circ_0076906调控的机制，进行了一系列实验。circ_0076 906敲低或过表达明显地上调或下调了人间充质干细胞中miR-29b的表达。由于与非骨质疏松症患者相比，骨质疏松症患者中miR-29b的表达水平高得多，因此实验预测它可能是骨质疏松症的促进调节剂。数据证明了实验的假设，即在成骨诱导人间充质干细胞的过程中miR-29b的表达降低，并抑制了成骨细胞的分化。microRNA通常通过结合其3’UTR来调节其靶基因，并下调其转录，因此后续应通过进一步的实验探讨miR29b和其靶基因OGN的关系。其他研究也表明，circRNA通过miRNA抑制参与了骨质疏松症的发病。例如，研究证实环状RNA circFOXP1通过抑制其靶miRNA(miR-17-3p/miR-127-5p充当人间充质干细胞分化的促进因子[28]。circRNA_00166 24结合miR-98，随后通过增强其靶标骨形态发生蛋白2的表达来预防骨质疏松症[29]。其他环状RNA，例如circ_0002060，circ_0001275也参与了骨质疏松症的调控[30-31]。此次实验首次表明Hsa_circ_0076906是骨质疏松症的负调节剂，可能是疾病诊断和治疗的生物标志物。
骨质疏松症的机制很复杂，除circRNA，microRNA和mRNA调节外还可能涉及许多其他调节途径。文章通过对质疏松患者外周血样本测序分析，并构建circRNA-miRNA-mRNA网络，最终筛选出hsa_circ_0076906可能作为“海绵”竞争性抑制miR-29b影响下游靶基因的表达，进而影响骨质疏松的进展。文章的局限性在于miR-29b和骨钙素的靶向关系未通过进一步实验验证；同时仅在20例样本中进行了基因表达的验证，circ_0076906、miR-29b和骨钙素是否可以作为骨质疏松症的生物标志物还需要扩大样本量进一步进行分析。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

基于高通量测序骨质疏松circRNA-miRNA-mRNA网络构建及Hsa_circ_0076906的功能验证

High-throughput sequencing-based osteoporotic circRNA-miRNA-mRNA network construction and Has_ circ_0076906 functional verification

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