2.1  实验动物数量分析  实验选用大鼠72只，分为4组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2  两组大鼠一般状况记录及生存率比较情况  对照组大鼠反应灵敏、总体情况无明显变化；脂多糖组大鼠注射脂多糖 2 h后出现精神萎靡、活动减少、背毛蓬松；6 h后对刺激反应减弱、伴有腹泻等表现；12 h后皮温降低、呼吸短促、鼻孔及眼睑部出现血性分泌物，随时间延续上述症状加重。对照组20只大鼠均存活，10 d生存率为100%；腹腔注射脂多糖后 12-24 h是脓毒症大鼠死亡的高峰期，脂多糖组20只大鼠10 d生存率为10%，明显低于对照组(见图1)。

2.3  各组大鼠心功能比较  与对照组比较，脂多糖6 h组左室射血分数、左室缩短分数差异无显著性意义(P > 0.05)，脂多糖12 h组、脂多糖24 h组左室射血分数、左室缩短分数较对照组明显降低(P < 0.01)；脓毒症大鼠随脂多糖注射时间延长，左室射血分数、左室缩短分数降低更加明显(P < 0.01)，见表1、图2。

2.4  各组大鼠血清肌钙蛋白Ⅰ、脑钠肽水平比较  与对照组比较，脂多糖组各时相点肌钙蛋白Ⅰ水平均增高(均P < 0.01)。脂多糖6 h组血清脑钠肽水平较对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，脂多糖12 h组、脂多糖24 h组血清脑钠肽水平较对照组显著增高(均P < 0.01)；随脂多糖注射时间延长，血清肌钙蛋白Ⅰ、脑钠肽水平逐渐升高(均P < 0.01)，见表2。

2.5  各组大鼠心肌病理形态变化  对照组心肌纤维形态结构无异常，核居中，横纹清楚，心肌细胞无明显水肿、变性及坏死，未见炎性细胞浸润；脂多糖6 h组大鼠可见心肌细胞水肿，心肌纤维排列欠规整；脂多糖12 h组大鼠可见心肌细胞明显水肿、炎性细胞浸润、部分心肌细胞核消失，较脂多糖6 h组心肌损伤加重；脂多糖24 h组心肌细胞变性坏死更加明显、红细胞渗出增多(见图3)。

2.6  各组大鼠心肌超微结构变化  透射电镜下，对照组大鼠心肌纤维排列致密整齐，线粒体嵴排列正常，无溶解、空泡等现象；脂多糖6 h组大鼠心肌纤维排列不整齐，线粒体略肿胀；脂多糖12 h组大鼠心肌线粒体嵴减少，部分出现空泡变性；脂多糖24 h组大鼠心肌肌节排列明显紊乱、线粒体空泡变性，部分线粒体破裂(见图4)。

脓毒症是指机体对感染反应失调导致危及生命的器官功能障碍^[1]。脓毒症心肌功能障碍(sepsis-induced myocardial dysfunction，SIMD)是脓毒症或脓毒症休克最严重的并发症之一，其特征为心脏整体但可逆的功能障碍^[2]，但心功能障碍的严重程度仍是影响脓毒症预后的重要因素之一。研究表明大约50%脓毒症患者有心肌功能障碍的表现，其死亡率高达70%-90%，因此改善脓毒症后的心肌功能障碍和心肌损伤能改善患者的预后^[3-4]。脓毒症心肌功能障碍的发病机制复杂，涉及炎症递质失调、线粒体功能障碍、氧化应激、钙调节紊乱、自主神经系统失调和内皮功能障碍等^[5-6]，但具体的发病机制尚未完全阐明。

近年在脓毒症患者和动物模型研究中发现脓毒症心脏冠脉血流正常或增加，极少发生心肌细胞凋亡和坏死，但存在心肌收缩装置的损伤，目前认为心肌线粒体结构与功能的损伤在脓毒症心肌功能障碍中起着关键作用^[7]。因此创建能够模拟临床脓毒症心肌功能障碍的动物模型对探索脓毒症心肌功能障碍发病机制，寻找有效的治疗手段极其重要。目前已知的应用盲肠结扎穿孔术(CLP)诱导脓毒症大鼠心肌功能障碍，但该技术受肠道内容物的细菌组成和手术操作差异性等影响，存在变异性^[8]。该研究拟采用大鼠腹腔内注射脂多糖建立脓毒症心肌功能障碍模型，通过超声监测大鼠心功能、测定心肌酶学、观察大鼠心肌病理形态和超微结构变化，旨在建立可靠、稳定的脓毒症心肌功能障碍动物模型。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年6月至2019年3月在宁夏医科大学颅脑实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  主要试剂与仪器  脂多糖(LPS，Escherichia coli O55:B5，美国sigma公司，批号：028M4094V)，水合氯醛(天津市大茂化学试剂公司，批号：20170718)，大鼠心肌肌钙蛋白I(cTnI/TNNI3)酶联免疫吸附测定试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号：8UL4XU1N)，大鼠脑钠肽酶联免疫吸附测定试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号：KWXJFZUQAL)。全波长酶标仪(美国Bio-tek公司)，Vivid 7 pro超声诊断扫描仪(美国GE公司)。

1.3.2  实验分组及模型建立  SPF级雄性SD大鼠72只，9至10周龄，体质量260-280 g，购自宁夏医科大学动物实验中心，动物许可证号：SCXK(宁)2015-0001。常规饲养于温度22-25 ℃，湿度(55±5)%，12 h明暗交替，自由摄食、饮水。大鼠实验前12 h禁食，自由饮水。实验经宁夏医科大学总医院伦理审查委员会批准(审批号：2018-320)。

1.4  实验方法

1.4.1  实验分组  将72只大鼠随机分为对照组28只；脂多糖组44只；两组各取20只观察造模后10 d生存率；脂多糖组剩余24只根据腹腔注射内毒素后不同时相又分为脂多糖 6，12，24 h组3个亚组，每组8只。

1.4.2  建立大鼠脓毒症模型  将脂多糖溶于生理盐水，配制成质量浓度为1 g/L的溶液，脂多糖组腹腔注射10 mg/kg 脂多糖建立大鼠脓毒症模型^[9-10]，对照组注射等量的生理盐水。

1.4.3  指标检测方法  对照组腹腔注射生理盐水后6 h，脂多糖各亚组大鼠分别于造模后6，12，24 h相应的时相点，用3 mL/kg体积分数10%水合氯醛腹腔注射麻醉后行超声心动图检查心功能，随后下腔静脉采血并开胸立即摘取心脏放入4 ℃生理盐水漂洗，沿左心室最大横径冠状切面取左心室心肌组织，进行相关指标检测。

(1)动物一般状况和生存率记录：观察对照组和脂多糖组大鼠的精神状态，记录大鼠生存时间并计算生存率，观察至造模后10 d。

(2)大鼠心功能测定：各组大鼠相应的时相点，水合氯醛腹腔注射麻醉后前胸部备皮，使用Vivid 7 pro超声诊断扫描仪，将频率12 MHz超声探头置于胸骨旁左心室长轴切面，M超声模式下测量左室收缩末期内径、左室舒张末期内径，选取3个心动周期测量取平均值，根据Teichholtz公式计算出左室射血分数、左室缩短分数。

(3)鼠心肌酶学指标测定：测定大鼠心功能后立即下腔静脉取血3 mL，4 ℃下3 000 r/min离心5 min制备血清标本，-80 ℃保存，同批检测。按照大鼠血清心肌肌钙蛋白I、脑钠肽检测试剂盒相关说明操作，酶标仪450 nm波长处测A值，通过绘制标准曲线计算出样品浓度。

(4)心肌组织病理学观察：取各组大鼠的心脏放入4 ℃生理盐水漂洗，沿左心室最大横径冠状切面取左心室心肌组织，置入40 g/L多聚甲醛溶液中固定12 h后，脱水、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察心肌病理形态结构变化。

(5)透射电镜观察心肌超微结构：取各组大鼠左室心肌组织迅速放入4 ℃冰戊二醛中固定30 min，然后修成 1 mm×1 mm×1 mm大小，置于冰戊二醛中固定2 h，然后每隔2 h换1次缓冲液，连换3次，梯度乙醇脱水，环氧丙烷浸透、包埋，制作厚度50 nm左右切片，醋酸铀、构椽酸铅染色透射电镜观察心肌组织超微结构。

1.5  主要观察指标  ①大鼠一般状况和生存率；②心功能；③心肌酶学指标；④心肌组织病理学观察；⑤心肌超微结构。

1.6  统计学分析  应用SPSS 22.0软件进行统计学分析。正态分布的计量资料以x(_)±s表示，多个样本均数间的比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 检验；用GraphPad Prism 7.0绘制Kaplan-Meier生存曲线。P < 0.05为差异有显著性意义。

脓毒症心肌功能障碍为脓毒症引起的心脏整体可逆的功能障碍，若不能及时有效地改善其心肌功能障碍将显著增加患者病死率^[11-12]。但目前对于脓毒症心肌功能障碍发病机制尚未完全明了，治疗缺乏有效手段，因此建立脓毒症心肌功能障碍可靠的动物模型对于研究其病理生理机制、衡量诊断标志物的特性及评估新疗法具有重要意义。盲肠结扎穿孔(CLP)是常用的脓毒症模型，由于宿主对感染的反应不同，可能产生脓肿隔离感染区域，使得该模型变异性较大^[13]；注射细菌诱导脓毒症模型，可能会导致一种特定的内毒素中毒模式，而不是真正的多种微生物感染脓毒症模型^[14]。脂多糖是革兰阴性菌重要的致病物质，注射脂多糖方法虽不能完全模拟脓毒症病理生理的复杂性，但该方法致病方式统一、可控，动物产生的临床表现具有同质性，并可导致脓毒症休克等严重病理变化^[15-16]，因此大部分脓毒症临床前研究都基于此方法。此次实验使用脂多糖10 mg/kg腹腔注射制作脓毒症模型，发现大鼠注射脂多糖2 h即出现精神萎靡，继之呼吸急促、出血等表现，随着注射后时间延长，大鼠症状逐渐加重，脂多糖注射后12-24 h为脓毒症大鼠死亡的高峰期。

脓毒症最严重的临床症状是感染性休克，表现为血管扩张和心肌功能障碍^[17-18]。脓毒症心肌功能障碍的发生与死亡率密切相关，其中左心室收缩功能受损且易于用超声心动图来明确诊断，而实验室检查血清心肌肌钙蛋白、脑钠肽水平可反应心肌损伤情况^[12，19]。在脓毒症患者中，肌钙蛋白Ⅰ、脑钠肽水平可预测脓毒症的严重程度，并与患者早期心脏收缩功能障碍和死亡率存在明显的相关性^[20-21]。

目前脓毒症心肌功能障碍制模尚无统一明确的评定标准，通常对制备脓毒症模型后通过检测心功能和心肌标志物，观察心肌组织学形态，综合评价脓毒症心肌功能障碍模型是否成功^[15，22-23]。此次研究选用大鼠作为研究对象，与小鼠相比心脏组织较大且在心脏超声检查操作中可视性更强。研究证实脂多糖10 mg/kg腹腔注射处理大鼠后，注射后12 h开始出现左心室左室射血分数、左室缩短分数降低，心肌酶肌钙蛋白Ⅰ、脑钠肽水平显著增加，表明大鼠出现心肌功能障碍、心肌细胞损伤。观察心肌病理学形态发现脓毒症大鼠心肌组织中炎性细胞浸润增加，心肌细胞水肿，随脂多糖作用时间延长损伤更明显。综合以上评定指标，脂多糖后12 h大鼠脓毒症心肌功能障碍模型即构建成功。ZHAI等^[15]研究发现，通过降低脂多糖诱导的心肌组织中炎性细胞浸润和NF-B活化，可改善左心室收缩功能，表明炎性细胞浸润增加及炎性因子活化在脓毒症心肌功能障碍中起重要作用。

此次研究进一步观察脓毒症大鼠心肌超微结构变化，证实大鼠注射脂多糖6 h即出现心肌线粒体肿胀，心肌纤维排列不规整等表现，随着时间延续损伤逐渐加重，至实验观察期末脂多糖注射后24 h心肌损伤最明显，尤其心肌线粒体损伤尤为显著，提示线粒体功能障碍在脓毒症心肌功能障碍发生发展中起着关键作用，保护心肌线粒体和改善心肌能量代谢可能是改善脓毒症心肌功能障碍的有效手段。研究表明，应用Rho激酶抑制剂法舒地尔可抑制线粒体分裂蛋白P-DRP1的表达和提高线粒体自噬蛋白LC3-II/ LC3-I的比值，进而保护心肌线粒体结构与功能，减轻脓毒症心肌损伤^[9]。XU等^[23]发现，一氧化碳释放分子2可通过提高PGC-1α和NRF-1的表达，促进线粒体生物发生并改善脓毒症心肌功能障碍。此次实验模型也为进一步研究线粒体机制及开发保护性药物提供实验模型基础。

综上所述，作者认为腹腔注射10 mg/kg脂多糖可导致大鼠心肌损伤，且脂多糖注射后12 h大鼠心肌损伤已较明显，尤其是心肌细胞能量代谢的结构基础-线粒体损伤明显，脓毒症心肌功能障碍模型构建成功，可为探讨脓毒症心肌功能障碍的保护措施提供模型基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
脓毒症心肌功能障碍：是脓毒症或脓毒症休克最严重的并发症之一，其特征为心脏整体可逆的功能障碍，但心功能障碍的严重程度仍是影响脓毒症预后的重要因素之一，若不能及时有效地改善脓毒症心肌功能障碍将显著增加脓毒症患者病死率。
脂多糖：是革兰阴性菌重要的致病物质，注射脂多糖方法虽不能完全模拟脓毒症病理生理的复杂性，但该方法致病方式统一、可控，动物产生的临床表现具有同质性，并可导致脓毒症休克等严重病理变化，因此大部分脓毒症临床前研究都基于此方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

目前脓毒症心肌功能障碍制模尚无统一明确的评定标准，通常对制备脓毒症模型后通过检测心功能和心肌标志物，观察心肌组织学形态，综合评价脓毒症心肌功能障碍模型是否成功。此次研究选用大鼠作为研究对象，与小鼠相比心脏组织较大且在心脏超声检查操作中可视性更强。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程