2.1  骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定  刚接种的细胞呈球形悬浮于培养液中，培养24-48 h细胞开始贴壁生长，镜下可见少量贴壁细胞，呈成纤维细胞样外形，经过数次换液，造血细胞被逐渐清除。原代培养7 d的细胞部分区域形成细胞团簇，形成明显的克隆中心，细胞开始增殖呈克隆生长，贴壁细胞呈梭形、多角形，可见明显的细胞突起(图2)。

经过成骨诱导培养液培养，细胞涡旋状生长趋势更加明显，细胞突起互相连接。成骨诱导14 d后，倒置相差显微镜下可见某些局部细胞可重叠生长而不发生细胞间的接触抑制现象，重叠生长的细胞形成结节状，随着胶原堆积及钙盐沉积，逐渐形成不透光的钙化结节。随着培养时间延长，钙化结节逐渐增多增大。茜素红染色可见橙红色钙化结节(图3)，表明细胞向成骨细胞分化。

通过成脂诱导培养液培养，细胞形态呈梭形，部分细胞胞质内出现散在小脂滴，主要分布细胞核周围。随着培养时间的延长，出现脂滴的细胞逐渐增多，可见细胞内从胞膜到胞核之间充满大小较均一的脂滴，部分细胞胞质内的脂滴逐渐融合成高折光性的大脂滴，细胞核被挤向一侧。油红O染色后可见胞质内有大小不等的橙红色脂滴(图4)，细胞核呈蓝色，被脂滴挤向一侧，表明细胞向成脂细胞分化。

2.2  RT-PCR检测材料诱导细胞后碱性磷酸酶mRNA的表达  骨髓间充质干细胞与nHAC和P17-BMP- 2/nHAC材料共培养第7天，实验组碱性磷酸酶mRNA相对表达结果明显高于对照组(P < 0.05)，见图5。实验结果表明复合材料中的P17-BMP-2具有生物活性，可以上调碱性磷酸酶mRNA的相对表达，具备促进成骨的能力。

2.3  材料皮下埋植生物相容性实验结果  组织切片Masson染色结果显示，P17-BMP-2/nHAC和nHAC皮下植入后在材料和组织界面均未引起明显的急性炎症反应。植入后第35天与对照组相比，实验组有更多的纤维细胞与材料嵌合，显示其具有更好的组织相容性和生物活性，见图6。

2.4  材料修复兔下颌骨箱状骨缺损的成骨性能  观察大体标本可以看出两种材料均具有良好的骨修复能力，见图7；植入5周时缺损区已有缩小趋势，植入15周时缺损表面比较平整。X射线片观察结果显示与对照组相比，实验组缺损区缩小趋势更明显，见图8，说明P17-BMP-2/nHAC增强了缺损区骨再生能力。

长期以来，骨组织缺损是困扰人们健康生活的难题之一。在口腔临床中，骨缺损、骨损伤、修复区骨量不足等问题的患者数量日益增多。面对自体骨、异体骨及原有人工骨矿化物在应用方面存在的问题，骨组织工程的快速发展为临床医学解决这些问题带来了希望^[1]。当前，骨组织工程修复材料研究亟待解决的关键问题就是研制具有良好生物相容性和力学强度、适当生物可降解性、具有骨诱导活性的骨组织再生修复材料^[1-4]。胶原基质矿化磷灰石(nano-hydroxyapatite/collagen，nHAC)作为具有良好生物相容性的骨组织工程支架材料应运而生。近年来为了解决nHAC由于缺乏骨诱导因子、干细胞等生物活性物质使其诱导成骨效果不如自体骨的问题，学者们对nHAC复合生物活性物质进行了大量研究。骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)具有较强诱导成骨活性，成为骨组织工程研究的热点^[5-6]。有文献报道天然的BMP-2存在数量有限、活性稳定性差、混入载体的不良反应等问题，基因重组BMP-2存在转染时效不理想及病毒载体致癌性风险^[7]，使其临床大量应用受到一定程度限    制^[8-10]。鉴于此，许多学者致力于BMP-2相关肽的研究，针对不同活性位点的BMP-2相关肽的成骨诱导活性已经得到证实，因其具备增强材料骨诱导性和生物相容性等特性，具有良好的应用前景。清华大学材料系崔福斋针对BMP-2的活性位点合成具有17个氨基酸的新型活性短肽(P17- BMP-2，IVAPPGYHAFYCHGECP)^[11]，对骨组织工程的发展起到了积极的推进作用。

实验尝试将新型活性短肽与nHAC复合成新型P17- BMP-2/nHAC材料，旨在通过体外细胞培养法、SD大鼠皮下埋植及兔下颌骨箱状缺损修复实验初步探讨P17-BMP- 2/nHAC的生物相容性及生物活性，为P17-BMP-2/nHAC的进一步研究提供生物学依据，推进骨组织工程骨填充复合材料的发展。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1  设计  随机分组，对比观察动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2011年1月至2012年12月在中国医科大学附属口腔医院和沈阳军区总医院完成。

1.3  材料  P17-BMP-2/nHAC(北京奥精医药科技有限公司)；nHAC(清华大学材料系)，见表1。

实验动物：选用1只1月龄新西兰大耳白兔，体质量  1.2 kg；20只健康日本大耳白兔，雌雄不拘，平均体质量2.7 kg，均购自沈阳军区总医院动物实验室，许可证号：SCXK(辽)2009-0002。20只健康雄性SD大鼠，平均体质量320 g，购自中国医科大学动物实验室，许可证号：

SCXK(辽)2018-0004。所有操作、饲养、处死等动物处置方式均遵循实验动物实验室实施管理条例。实验获得中国医科大学附属口腔医院伦理委员会批准。

实验用主要试剂与仪器设备：DMEM低糖培养基(Gibco公司)；胎牛血清(HyClone公司)；胰蛋白酶(Invitrogen公司)；地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、吲哚美辛、IBMX(Sigma公司)；Real-time RT-PCR试剂盒(TAKARA公司)；青霉素(哈药集团医药有限公司)；光学显微镜BX51(Olympus公司)；CO₂恒温培养箱(Heras公司)；超净工作台SW-CJ-1FD型(苏州安泰空气技术有限公司)；7900HT型定量PCR仪(ABI公司)。

1.4  实验方法

1.4.1  兔骨髓间充质干细胞的分离、培养

分离和培养：按以往文献方法分离培养^[12]。取新西兰大耳白兔，2%戊巴比妥钠静脉麻醉(30 mg/kg)，8%Na₂S双侧后肢脱毛。无菌条件下切开皮肤后分离组织达骨面，剥离肌肉组织附着，完整取下胫、股骨。取下的骨用体积分数75%乙醇浸泡20 s后，再用含10倍双抗的0.01 mol/L PBS浸泡10 min，无菌条件下剪除两端干骺端暴露骨髓腔，用无菌注射器抽取3 mL含100 U/mL肝素的PBS冲洗骨髓腔置于培养皿中。在离心管中加入1.073 g/mL等体积Percoll密度梯度分离液，再贴壁缓慢加入3 mL含细胞的PBS以2 000 r/min离心20 min(4 ℃)。吸取中间白色云雾状的单核细胞层，用0.01 mol/L PBS洗涤3次，加入5 mL DMEM培养液(含体积分数10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 IU/mL链霉素)悬浮细胞，调整细胞浓度为8×    10⁸ L^-1并接种于25 cm²培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂恒温培养箱中培养，隔天换液。原代培养12 d，细胞融合达到90%后传代。

多向分化能力鉴定：取第3代约70%融合生长旺盛的骨髓间充质干细胞，分别加入成骨诱导培养液(DMEM低糖培养基、体积分数10%胎牛血清、50 μg/L抗坏血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、10^-8 mol/L地塞米松)及成脂诱导培养液(DMEM低糖培养液、体积分数10%胎牛血清、100 nmol/L 胰岛素、1.0 μmol/L 地塞米松、0.5 mmol/L IBMX、200 μmol/L吲哚美辛)，隔天换液。成骨诱导培养液诱导2周后，倒置相差显微镜下观察细胞生长状态。当出现钙结节时，PBS冲洗3次，40 g/L多聚甲醛固定15-20 min，蒸馏水冲洗3-5次后，用预先配制的饱和茜素红溶液染色30 min，光学显微镜观察。成脂诱导培养液诱导2周后，PBS冲洗3次，用油红O溶液避光、密封染色10-15 min，体积分数60%乙醇镜下分化至间质清晰，蒸馏水洗涤，苏木精复染细胞核，再用蒸馏水洗涤，光学显微镜观察。

1.4.2  RT-PCR检测碱性磷酸酶mRNA表达  将12块无菌P17-BMP-2/nHAC(直径10 mm，厚度3 mm)样品材料置于6孔培养板上，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液预湿8 h，并设12块nHAC材料作为对照组。取生长旺盛的骨髓间充质干细胞，0.25%胰酶消化后，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞悬液浓度为1×10⁸ L^-1，分别加入含有预湿P17-BMP-2/nHAC和nHAC材料的6孔板中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂恒温培养箱中培养，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。

培养3，7 d后：①提取细胞总RNA：用PBS清洗贴壁细胞后，加入1 mL RNAiso Plus充分溶解5 min。用移液器转移到EP管中，12 000×g离心15 min(4 ℃)，吸上清于新的EP管中。加入三氯甲烷，体积至少为加入RNAiso Plus的1/5，静置10 min。12 000×g离心15 min(4 ℃)，吸上清于新的EP管中。加入吸取上清等体积的异丙醇，静置    10 min。12 000×g离心15 min(4 ℃)，倒掉上清，加入预冷体积分数75%乙醇1 mL。7 500×g离心10 min(4 ℃)，倒掉上清，加入体积分数100%乙醇1 mL。7 500×g离心    10 min(4 ℃)，倒掉上清，晾干乙醇。加入适量的无RNA酶水，水浴溶解7 min；②反转录(10 μL体系)：测定好RNA浓度后用无RNA酶水取适量稀释成60 mg/L。配制Realtime特异性反转录体系，并用水补到5 μL。离心后放入机器内，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃冷却。-20 ℃长期保存；③RT-PCR染料法(20 μL体系)：将反转好的cDNA按每孔0.2 μL稀释到5 μL水中。配制Realtime反应体系，其中加入上下游引物(表2)各0.6 μL，使其终浓度达到0.3 μmol/L。加15 μL反应体系入光学96孔板，然后加入配好的cDNA，加盖光学封口膜。离心后放入定量PCR仪按以下条件进行95 ℃ 30 s，1个循环；95 ℃ 5 s；60 ℃30 s，40个循环测定荧光信号。RT-PCR的扩增曲线和融解曲线，采用7000 system sds software软件程序进行分析，通过扩增曲线与阈值线的交点得到各组样品目的基因和参比基因(GAPDH)的Ct值，计算以参比基因为标准的相对表达量∆Ct。按照公式∆Ct=Ct_gene-Ct_reference，Ratio=2^-∆∆Ct计算碱性磷酸酶的相对表达，绘制图表。

1.4.3  材料皮下埋植生物相容性实验  20只雄性SD大鼠分笼饲养，随机分成2组，每组10只，实验组SD大鼠背部区域皮下埋植P17-BMP-2/nHAC材料(3 mm×3 mm×     3 mm)，对照组埋植nHAC。用10%水合氯醛麻醉SD大鼠，剪去背毛，在消毒后的背部皮肤上制造2个切口及皮下袋，植入两种材料。两组植入第12，35天后进行组织学检查，每组大鼠于每个时间点处死5只，取出包含植入材料区域的组织，将样品放在40 g/L多聚甲醛中固定，石蜡包埋，切成5 μm的薄片，Masson染色后进行组织学分析。

1.4.4  材料修复兔下颌骨箱状骨缺损实验^[12-13]  将20只健康日本大耳白兔随机分为2组，每组10只。用2%戊巴比妥钠(30 mg/kg)静脉麻醉后，8%Na₂S脱去兔下颌区及颈部的体毛，消毒铺巾，无菌条件下沿兔下颌骨下缘切开皮肤，分离皮下组织，直达下颌骨骨面。在无菌生理盐水冷却、冲洗条件下，通过齿科低速手机在下颌骨中央创造6 mm× 10 mm仅保留舌侧骨皮质的箱状缺损模型(图1)，实验组植入P17-BMP-2/nHAC(3 mm×3 mm×3 mm)，对照组植入nHAC，逐层缝合伤口。所有实验动物术后3 d肌注青霉素40×10⁴ U/d。术后第5，15周，两组于每个时间点处死5只，取兔下颌骨，进行大体观察及X射线片观察，评价缺损区生长情况。

1.5  主要观察指标  两组材料与骨髓间充质干细胞共培养后的成骨诱导活性，两种材料皮下埋植后的生物相容性，以及两种材料修复骨缺损的能力。

1.6  统计学分析  采用Excel 2007及SPSS 13.0软件进行统计学分析，数据以x(_)±s表示，采用t 检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。

nHAC是基于仿生观念制成的骨组织工程支架材料，具有无免疫原性、快速生物降解性、优良骨相容性、高效的骨传导性、良好的生物活性物质载体等优点而引起了学者的广泛关注。自研发以来，nHAC在骨组织工程领域展示了显著的优势，在口腔科和骨科等临床领域得到了极为广泛的重视。为进一步增强nHAC材料的骨修复性能，学者们进行大量探索性研究^[14-17]。实验中的新短肽P17-BMP-2包含了BMP-2一段特异的活性位点，具有分子量小、结构简单、稳定性良好等优点，解决了BMP-2由于复杂结构所导致的某些活性位点不易暴露问题。以往体外细胞实验证实，新短肽P17-BMP-2具有良好的生物相容性和成骨诱导生物活性，是具有良好生物活性的骨组织工程细胞因子，可以将其与骨组织工程支架材料复合做进一步的研究。实验重点探讨新短肽P17-BMP-2/nHAC材料体外诱导细胞成骨分化的性能、体内生物相容性及生物活性。

骨髓间充质干细胞容易提取，增殖能力强，通常作为评价材料生物学活性的种子细胞^[12，18-20]。实验中橙红色的钙结节和脂滴表明，骨髓间充质干细胞在成骨和成脂诱导液作用下发生了成骨和成脂分化，证实了其向成熟组织细胞分化的能力。碱性磷酸酶与骨的钙化密切相关，是成熟成骨细胞的标志性酶之一^[21]。在骨修复和再生过程中，可以通过检测碱性磷酸酶生物活性来评价骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的能力。RT-PCR检测果显示骨髓间充质干细胞在与nHAC和P17-BMP-2/nHAC材料共培养3 d后，碱性磷酸酶mRNA的相对表达得到提高；共培养7 d后，P17-BMP-2对骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶mRNA的相对表达上调作用进一步增强。研究结果表明与nHAC复合后的P17-BMP-2仍保持活性，具备促进成骨诱导能力，nHAC可以作为持续释放P17-BMP-2的有效载体，与以往研究结果一致^[11]。与nHAC材料相比，P17-BMP-2/ nHAC复合材料可以更加有效地调节相关基因的合成，对骨髓间充质干细胞的成骨分化产生刺激和增强作用。将新型的P17-BMP-2/nHAC材料植入SD大鼠皮下，组织学结果表明P17-BMP-2/nHAC在材料和组织界面未引起明显的急性炎症反应，与nHAC相比有更多的纤维细胞与材料嵌合，具有更好的组织相容性和生物活性。实验采用兔下颌骨箱状缺损动物模型评价P17-BMP-2/nHAC修复骨缺损的能力，实验标本及X射线片观察结果一致，与对照组相比，实验组缺损表面更平整，缺损区缩小趋势更明显，有更多的骨量生成，表明 P17-BMP-2/nHAC增强了缺损区骨再生能力。新短肽P17-BMP-2可以提高成骨性能的原因可能与2个方面因素有关：①复合材料中的新短肽P17-BMP-2保留了BMP序列中与诱导成骨分化有关的主要的功能部  位^[22]。通过激活BMP通路促进了骨组织再生并提高了骨组织修复能力。李佳滨等^[23]在P17-BMP2多肽促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的实验中也证实了P17-BMP2多肽的骨诱导活性和成骨作用；②P17-BMP-2/nHAC为新骨形成创造了更好的生长环境，有利于成骨细胞黏附、生长、繁殖^[21]。从复合生物材料中释放的P17-BMP-2，能够刺激细胞分泌局部细胞因子参与并调解新骨形成过程。

综上所述，nHAC是一种具有良好生物相容性的骨组织工程支架材料，可作为P17-BMP-2的良好生物载体^[24-26]。P17-BMP-2作为一种化学合成肽，可以很容易与nHAC 复合并保持其原有的生物学活性，在局部释放并发挥成骨诱导的作用^[27]。P17-BMP-2/nHAC复合材料具有良好的生物相容性和生物活性，使其在口腔及整形外科骨组织重建领域中作为理想的骨替代材料具有良好的应用前景。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

文题释义：

胶原基质矿化磷灰石：具有良好的生物相容性，不产生排斥反应，降解速度与成骨的速度相适应，其降解不会影响周围环境的pH值。该材料在微米尺度上具有互联孔洞结构，孔隙尺寸为100-500 µm，孔隙率为70%-90%，结构和成分与自体骨相似，能够更好的诱导自体骨生长，具有良好的骨修复作用，其机械耐受性、可塑性、强度接近松质骨。

新短肽P17-骨形态发生蛋白2：通过FMOC/tBu固相多肽合成法合成的具有17个氨基酸的新型活性短肽中包含磷酸化的丝氨酸及天冬氨酸，能够极好地模拟天然骨基质的促发及指导矿化的功能，在局部形成偏酸环境，促进局部的钙磷沉积、成核和生物自组装矿化。短链多肽活性位点能充分暴露并与细胞表面受体结合，生物活性更强。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

P17-骨形态发生蛋白2/胶原基质矿化磷灰石是将清华大学材料系崔福斋教授团队自主研发的新短肽P17-骨形态发生蛋白2与胶原基质矿化磷灰石进行复合制备而成的一种新的骨组织工程支架复合材料，国内外处于领先水平。本实验通过体外细胞实验和动物实验两个层面对比研究了胶原基质矿化磷灰石与P17-骨形态发生蛋白2/胶原基质矿化磷灰石复合材料的生物相容性和生物活性。证实在胶原基质矿化磷灰石加入P17-骨形态发生蛋白2能增强其诱导成骨效应。P17-骨形态发生蛋白2/胶原基质矿化磷灰石是潜在的具有良好生物学性能的骨组织工程材料，有重要的研究和临床应用价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程