丹酚酸B促进内皮祖细胞动员和黏附的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.21.012

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (21): 3352-3357.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.21.012

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丹酚酸B促进内皮祖细胞动员和黏附的作用

赵先锋^1，2，徐予^1，2

¹郑州大学人民医院心血管内科，河南省郑州市 450003；²河南省人民医院心血管内科，河南省郑州市 450003

修回日期:2017-06-03 出版日期:2017-07-28 发布日期:2017-08-02
作者简介:赵先锋，男，1972年生，河南省驻马店市上蔡县人，汉族，2012年新乡医学院毕业，硕士，副主任医师，主要从事高血压、终末期心力衰竭的诊治。
基金资助:
河南省重大科技攻关项目“干细胞课题研究”(122101310500)

Salveanolic acid B promotes the mobilization and adhesion of endothelial progenitor cells

Zhao Xian-feng^{1, 2}, Xu Yu^{1, 2}

¹Department of Vasculocardiology, the People’s Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450003, Henan province, China; ²Department of Vasculocardiology, the People’s Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450003, Henan province, China

Revised:2017-06-03 Online:2017-07-28 Published:2017-08-02
About author:Zhao Xian-feng, Master, Associate chief physician, Department of Vasculocardiology, the People’s Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450003, Henan province, China; Department of Vasculocardiology, the People’s Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450003, Henan province, China
Supported by:
the Key Technology Research & Development Program of “Stem Cell Research” in Henan Province, No. 122101310500

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
血管内皮祖细胞：是血管内皮细胞的前体细胞，在生理或病理因素刺激下，可从骨髓动员到外周血参与损伤血管的修复，近年来研究显示，内皮祖细胞在心脑血管疾病、外周血管疾病、肿瘤血管形成及创伤愈合等方面均发挥重要作用，并为缺血性疾病的研究治疗提供了新思路。
骨髓动员：骨髓中存在许多种类的成体干细胞，其中包括造血干细胞、血管内皮祖细胞以及间充质干/祖细胞等干细胞群和间充质细胞，将这些细胞从骨髓中动员到外周血中的过程称作骨髓动员。

摘要
背景：动脉粥样硬化、高血压和糖尿病等多种疾病都伴有血管内皮损伤，而体循环中的内皮祖细胞可以对受损内皮细胞进行有效的修复。
目的：研究丹酚酸B在小鼠体内对血管内皮祖细胞动员和黏附的作用。
方法：选取30只C57BL/6小鼠，随机分为手术组和假手术组，每组15只，手术组小鼠颈总动脉损伤后按照给药不同分为对照亚组、丹酚酸B亚组和血管内皮生长因子亚组，每组5只。对照亚组给予5%葡萄糖注射液，丹酚酸B亚组注射100 g/L丹酚酸B，血管内皮生长因子亚组注射10 μmol/L血管内皮生长因子，给药剂量均为10 mL/kg。假手术组并未进行颈总动脉损伤，分组和给药方式与手术组相同；连续给药7 d后，分离小鼠外周血中的血管内皮祖细胞，并通过流动腔实验检测内皮祖细胞黏附性；酶联免疫吸附法检测血清基质细胞衍生因子1和白细胞介素8水平。
结果与结论：①手术组中内皮祖细胞占有核细胞的比例明显增加，与假手术组相比差异有显著性意义(P < 0.05)；②给药7 d后，手术组中丹酚酸B亚组和血管内皮生长因子亚组内皮祖细胞占有核细胞的比例明显高于对照亚组，差异有显著性意义(P < 0.05)；假手术组中血管内皮生长因子亚组内皮祖细胞占有核细胞的比例明显高于对照亚组和丹酚酸B亚组，差异有显著性意义(P < 0.05)；③流动腔实验结果显示丹酚酸B组内皮祖细胞明显高于对照亚组，差异有显著性意义(P < 0.05)；④在手术组中，丹酚酸B亚组与血管内皮生长因子亚组血清中基质细胞衍生因子1和白细胞介素8水平明显高于对照亚组，差异有显著性意义(P < 0.05)；在假手术组中，血管内皮生长因子亚组血清中基质细胞衍生因子1和白细胞介素8水平明显高于对照亚组，差异有显著性意义(P < 0.05)；⑤结果表明，丹酚酸B可以在体内增加内皮祖细胞骨髓动员的效率，帮助内皮祖细胞黏附于胶原表面，同时还可以上调基质细胞衍生因子1和白细胞介素8细胞活性因子水平。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-4099-9491(赵先锋)

关键词: 干细胞, 移植, 丹酚酸B, 血管内皮祖细胞, 基质细胞衍生因子1, 白细胞介素8

Abstract:

BACKGROUND: Vascular endothelial injury usually appears following atherosclerosis, hypertension, diabetes mellitus and other diseases, which can be repaired by endothelial progenitor cells (EPCs) in the systemic circulation.

OBJECTIVE: To study the effect of salveanolic acid B on the mobilization and adhesion of EPCs in mice.

METHODS: Thirty C57BL/6 mice were selected and randomly divided into surgical and non-surgical groups, (n=15 per group). Common carotid arteries of mice in the surgical group were injured by iron wire, then were subdivided into three groups (n=5 per group), and were given the injection of 5% of glucose (control group), 100 g/L salveanolic acid B and 10 μmol/L vascular endothelial growth factor, respectively. Meanwhile, the mice in the non-surgical group received the same assignment and treatment, but the common carotid arteries were not injured. After consecutive 7-day administration, the EPCs in the peripheral blood of the mice were isolated, and the EPCs adhesion was tested by flow chamber experiment. The serum levels of stromal cell-derived factor-1 and interleukin-8 were detected by ELISA kits.
RESULTS AND CONCLUSION: The proportion of EPCs in the surgical group was significantly increased compared with the non-surgical group (P < 0.05). After 7-day administration, the proportion of EPCs in the salveanolic acid B and vascular endothelial growth factor subgroups of the surgical group was significantly higher than that in the control subgroup (P < 0.05); the proportion of EPCs in the vascular endothelial growth factor subgroup of the non-surgical group was significantly higher than that in the control and salveanolic acid B subgroups (P < 0.05). Flow chamber experiment revealed that the number of EPCs in the salveanolic acid B subgroup was significantly more than that in the control subgroup (P < 0.05). In the surgical group, the serum levels of stromal cell-derived factor-1 and interleukin-8 in the in the salveanolic acid B and vascular endothelial growth factor subgroups were significantly higher than those in the control subgroup (P < 0.05); in the non-surgical group, the serum levels of stromal cell-derived factor-1 and interleukin-8 in the in the vascular endothelial growth factor subgroup were significantly higher than those in the control subgroup (P < 0.05). To conclude, salveanolic acid B can increase the efficiency of the EPCs mobilization in bone marrow in vivo, help the EPCs adhere to the collagen surface, and upregulate the serum levels of stromal cell-derived factor-1 and interleukin-8.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Salvia miltiorrhiza, Endothelial Cells, Vascular Endothelial Growth Factors, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

赵先锋，徐予. 丹酚酸B促进内皮祖细胞动员和黏附的作用[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(21): 3352-3357.

Zhao Xian-feng, Xu Yu. Salveanolic acid B promotes the mobilization and adhesion of endothelial progenitor cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(21): 3352-3357.

图/表（结果） 2

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引言

血管内皮损伤是临床上多种疾病的共同特征，这些疾病包括动脉粥样硬化、高血压和糖尿病等^[1-3]。近年来的研究表明，存在于体循环中的血管内皮祖细胞可以修复受损伤的内皮细胞。血管内皮祖细胞是成熟的血管内皮细胞的前体，具有干细胞的功能，不但可以完成自身的分裂增殖，而且分裂后的细胞仍然具有分化为血管内皮细胞的能力^[4-6]。当疾病引起血管内皮损伤后，存在于骨髓中的内皮祖细胞可以被动员到外周血中，修复受损的内皮组织。同时，内皮祖细胞也具有一定分泌功能，可以分泌血管内皮生长因子和基质细胞衍生因子1，这些细胞因子可以帮助内皮祖细胞黏附于受损部位并改善组织血供，促进侧支循环的形成。如果能够有效动员骨髓中的内皮祖细胞，对于治疗血管内皮损伤有着重要的临床价值^[7-10]。

丹酚酸B是中国传统中药丹参的重要活性成分，其具有咖啡酰缩酚酸的结构，同时也具有新木脂素骨架的结构，这使得它易溶于水^[11-12]。目前研究显示，丹酚酸B可以在蛋白水平增加抗凋亡基因Bcl-2/Bax表达的比例，保护细胞膜的完整性，减少乳酸脱氢酶的释放等，增加细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)表达水平。也有实验证明丹酚酸B可以改善血管内皮细胞的功能，但并没有证据显示这种血管内皮细胞的功能改善是通过何种途径实现的^[13-16]。因此，实验通过建立小鼠颈动脉损伤模型，通过观察丹酚酸B在骨髓动员内皮祖细胞中的作用，分析丹酚酸B修复受损血管内皮细胞的可能途径。

材料方法

1.1 设计 细胞学体外实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年6月至2017年1月在河南医科大学实验动物中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 C57BL/6小鼠35只，SPF级，8周龄，体质量19-22 g，雌雄不限，购买于河南医科大学实验动物中心。

1.3.2 实验试剂及仪器 丹酚酸B购买于中国食品药品检定研究院；胎牛血清购买于美国Hyclone公司；M199培养基、D-Hank’s液和PBS购买于美国GE公司；血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、光交联胶原和胰酶购买于美国Sigma-Aldrich公司；血管内皮生长因子、基质细胞衍生因子1和白细胞介素8酶联免疫吸附检测试剂盒购买于美国ebioscience公司；Percoll分离液购买于美国GE公司；小鼠VEGFR-2-APC、CD31-FITC、CD34-PE、CD133-APC和CD45-FITC购买于美国BD公司；培养瓶和细胞培养板购买于美国Corning公司；倒置相差显微镜CX51购买于日本Olympus公司；细胞流动腔实验装置系统购买于美国Flexcell公司；低速离心机购买于湖南赫西仪器装备有限公司；FACSCalibur 流式细胞仪购买于美国BD公司；CO₂培养箱购买于美国Thermo公司。

1.4 实验方法

1.4.1 内皮祖细胞骨髓动员实验分组及方法 选取8周龄的C57BL/6小鼠共30只，随机分为2组：手术组和假手术组，每组15只。手术组小鼠采用1%戊巴比妥钠10 mg/kg腹腔注射麻醉后，将左侧的颈部皮肤切开，暴露左侧颈动脉鞘，钝性分离颈总动脉以及颈内动脉和颈外动脉。用血管夹夹闭颈内动脉和颈总动脉，将铁丝经颈外动脉插入颈总动脉，损伤颈总动脉3 min^[17]，使用0号手术线结扎颈外动脉，注意结扎的过程中一定要将颈外动脉刺入点部位结扎，防止出血。假手术组小鼠仅进行颈动脉皮肤切开分离术和颈外动脉结扎，不进行血管内皮损伤。

将经过铁丝损伤的手术组C57BL/6小鼠随机分为3个亚组，分别为对照亚组、丹酚酸B亚组和血管内皮生长因子亚组，每组5只。对照亚组小鼠经尾静脉注射5%葡萄糖注射液，剂量为10 mL/kg；丹酚酸B亚组小鼠经尾静脉注射5%葡萄糖溶解的质量浓度为100 g/L丹酚酸B，剂量为10 mL/kg；血管内皮生长因子亚组小鼠经尾静脉注射浓度为10 μmol/L的血管内皮生长因子，剂量为10 mL/kg。连续给药7 d后通过心脏采血的方式取各组小鼠血液0.5 mL，用等体积D-Hank’s液稀释后，加入1.5倍体积相对密度为1.090的Percoll分离液上，2 000 r/min离心30 min后取中间层细胞，再用D-Hank’s液重复洗涤1次。用50 μL M199培养基重悬，加入CD34-PE流式抗体2 μL，20 min后用PBS洗涤2遍，再加入VEGFR-2-APC流式抗体5 μL，20 min后用PBS洗涤2遍，离心后弃去培养基，加入150 μL PBS重悬细胞，流式细胞仪检测并计算内皮祖细胞的百分比。同样将假手术组C57BL/6小鼠随机分为3个亚组，分别为对照亚组、丹酚酸B亚组和血管内皮生长因子亚组，每组5只，给药方法与手术组一致。

1.4.2 小鼠外周血中内皮祖细胞的分离与鉴定 取C57BL/6小鼠5只，经心脏采血后，每个小鼠取血液1 mL加入等体积的Percoll分离液，放入50 mL离心管中1 500 r/min离心20 min，吸取液面交界处的有核细胞，使用PBS稀释后1 500 r/min离心5 min。弃去上清液，将离心后的细胞在含体积分数为10%胎牛血清、10 μg/L血管内皮生长因子和3 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的M199培养基中培养24 h后去除未贴壁细胞，将贴壁的细胞继续培养7 d。细胞消化后，1 500 r/min离心5 min，弃去上清液，PBS清洗2次，重悬细胞制备单细胞悬液并调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹，取200 μL细胞悬液，分别加入CD34-PE、CD133-APC和CD45-FITC流式抗体各5 μL，避光室温孵育20 min后流式细胞仪检测CD34、CD133和CD45的表达情况。

1.4.3 流动腔实验 将光交联胶原100 mg与丹酚酸B 10 mg充分混合后加入2 mL蒸馏水充分溶解，覆盖在玻片上并放置于紫外灯下交联4 h；同时取光交联胶原100 mg溶解2 mL蒸馏水作为对照组，覆盖在玻片上并放置于紫外灯下交联4 h。将分离培养7 d后的内皮祖细胞经过胰酶消化后，用PBS洗去漂浮的死细胞，制成细胞浓度为1×10⁸ L^-¹的细胞悬液。让含有内皮祖细胞的混悬液以0.01 mL/min流过涂层有胶原的玻片。通过倒置显微镜检测内皮祖细胞流过相同距离的时间以及最终黏附在载玻片上的内皮祖细胞数量。

1.4.4 各组小鼠血清中基质细胞衍生因子1和白细胞介素8水平 取上述各组小鼠血液0.5 mL经抗凝处理，经过1 500 r/min离心20 min后取血清10 μL，通过酶联免疫吸附法检测各组小鼠血清中基质细胞衍生因子1和白细胞介素8水平，方法参照试剂盒说明书进行。

1.5 主要观察指标 ①流式细胞仪检测血管内皮祖细胞中CD34、CD133和CD45表达；②流动腔实验检测内皮祖细胞流过涂层有胶原玻片相同距离的时间以及最终黏附在载玻片上的内皮祖细胞数量；③ELISA法检测小鼠血清中基质细胞衍生因子1和白细胞介素8的分泌水平。

1.6 统计学分析 采用SPSS 16.5统计软件。计量资料以x(_)±s表示，多组间的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK检验(q检验），P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

内皮祖细胞是一种具备分化潜能的前体细胞，具有干细胞的特性，在一定条件下可以分化为血管内皮细胞对受损的血管内皮组织进行修复。内皮祖细胞在受到机体血管内皮损伤的刺激下可以从骨髓进入到外周末梢血中，归巢至缺血损伤的血管附近，并可以分化为成熟的血管内皮细胞，参与受损内皮的修复^[18-23]。研究显示，将体外培养的内皮祖细胞回输入患者体内或者通过注射方式接种于受损组织可以取得满意的临床治疗效果^[24]，但是由于人体内的内皮祖细胞数量有限，即使从骨髓动员到外周血循环中，其转移、迁徙、进入受损组织的数量远远不能满足治疗的需求。因此，寻找促进内皮祖细胞骨髓动员的方法对于治疗以血管内皮损伤为特征的疾病具有重要的治疗价值。

丹酚酸B是传统中药丹参活性最强的水溶性成分之一，它是由三分子3，4-二羟基苯基乳酸和一分子咖啡酸缩合而成的一低聚体型化合物。近年来的研究显示丹酚酸B可以有效减少心肌梗死灶的范围、改善心肌缺血和缺血再灌注后的氧化应激损伤、修复受损的血管内皮细胞、防止血栓的形成和改善受损组织的微循环等功能。但对于丹酚酸B修复受损血管内皮细胞的原因目前尚无明确解释，有研究报道可能与促进血管上皮细胞分泌血管内皮生长因子有关。血管内皮生长因子是目前已知的诱导内皮祖细胞向成熟血管内皮细胞分化的最重要的细胞因子，血管内皮生长因子含量对于内皮祖细胞表达CD31起到重要促进作用，因此实验选取血管内皮生长因子作为阳性对照组，通过比较丹酚酸B和血管内皮生长因子对内皮祖细胞骨髓动员的影响，分析丹酚酸B修复受损血管内皮的途径^[25-27]。

目前认为血管内皮的修复有两种方式：血管内皮细胞分裂而来或者由末梢血液中具有分化功能的内皮祖细胞分化而来^[28-29]。丹酚酸B参与上述哪种方式修复细胞目前尚无明确报道。本研究在此基础上，首先建立了小鼠颈动脉内皮损伤模型，通过这种方式可以将骨髓中的内皮祖细胞动员至末梢血中，其对内皮祖细胞的动员效果与假手术组相比差异有显著性意义。在手术组和假手术组分别给药的过程中发现，在手术组中可以明确显示丹酚酸B亚组和血管内皮生长因子亚组的内皮祖细胞明显增加，而在假手术组中只有血管内皮生长因子亚组的内皮祖细胞明显增加，这说明丹酚酸B只能增加内皮祖细胞在骨髓动员过程中的效率，并不能直接动员骨髓分泌内皮祖细胞，这一点与血管内皮生长因子功能有明显区别。在流动腔实验中，丹酚酸B可以有效促进内皮祖细胞黏附在胶原表面，这一过程与机体内血管内皮受损后胶原暴露的过程相似，因此丹酚酸B除了可以有效帮助提高内皮祖细胞的骨髓动员效率之外，还能够促进内皮祖细胞黏附于胶原表面，利于内皮祖细胞归巢。此外，有大量研究报道当血管内皮发生损伤后，外周血中的内皮祖细胞数量较正常人相比明显降低，同时也伴有基质细胞衍生因子1和白细胞介素8水平下降，并且随着病情的转归外周血中基质细胞衍生因子1和白细胞介素8水平有所回升^[30-32]。内皮祖细胞具有旁分泌功能早已得到证实，可以释放血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、基质细胞衍生因子1、粒细胞集落刺激因子和白细胞介素8等活性细胞因子，这些细胞因子不仅可以动员内皮祖细胞从骨髓进入外周血，还可以促进内皮祖细胞增殖、分化、趋化和归巢^[33-35]。基质细胞衍生因子1是一种趋化因子，它对于内皮祖细胞的趋化作用是其他细胞因子的10倍以上，血液中基质细胞衍生因子1升高有利于内皮祖细胞归巢，诱发内皮祖细胞与受损内皮黏附和血小板聚集，并抑制内皮祖细胞凋亡；白细胞介素8也是一种趋化性细胞因子，它可以通过激活CXCR2受体，磷酸化Ras和MAPK信号通路中的下游蛋白而介导内皮祖细胞的迁徙和增殖^[36-37]。因此，实验选取了上述2种细胞因子，分析丹酚酸B对内皮祖细胞旁分泌功能是否有影响。结果显示，丹酚酸B注射7 d后，可以明显增加基质细胞衍生因子1和白细胞介素8在小鼠体内的含量，而内皮祖细胞的旁分泌功能早已得到证实，因此丹酚酸B可以通过增加内皮祖细胞骨髓动员的数量来上调基质细胞衍生因子1和白细胞介素8在动物模型中的含量，实现内皮祖细胞的趋化和归巢过程。

综上所述，丹酚酸B可以在体内增加内皮祖细胞骨髓动员的效率，帮助内皮祖细胞黏附于胶原表面，同时还可以通过增加内皮祖细胞数量实现上调基质细胞衍生因子1和白细胞介素8细胞活性因子的水平，对于治疗以血管内皮损伤为特点的疾病具有重要的临床治疗价值。

丹酚酸B促进内皮祖细胞动员和黏附的作用

Salveanolic acid B promotes the mobilization and adhesion of endothelial progenitor cells

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