树鼩脐带间充质干细胞分离、培养及成骨成脂分化的鉴定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.012

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (9): 1373-1377.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.012

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树鼩脐带间充质干细胞分离、培养及成骨成脂分化的鉴定

阮光萍，朱路，刘菊芬，李自安，王金祥，庞荣清，潘兴华

解放军成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心，云南省昆明市 650032

出版日期:2017-03-28 发布日期:2017-03-31
通讯作者: 潘兴华，博士，主任医师，解放军成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心，云南省昆明市 650032
作者简介:阮光萍，女，1974年生，云南省昆明市人，汉族，2007年南方医科大学毕业，博士，副主任医师。
基金资助:
国家科技支撑计划项目(2014BAI01B01)；云南省科技计划项目(2013CA005)

Tree shrew umbilical cord mesenchymal stem cells: isolation, cultivation and osteogenic and adipogenic differentiation

Ruan Guang-ping, Zhu Lu, Liu Ju-fen, Li Zi-an, Wang Jin-xiang, Pang Rong-qing, Pan Xing-hua

The Cell Biological Therapy Center, Kunming General Hospital of Chengdu Military Command, Kunming 650032, Yunnan Province, China

Online:2017-03-28 Published:2017-03-31
Contact: Pan Xing-hua, M.D., Chief physician, the Cell Biological Therapy Center, Kunming General Hospital of Chengdu Military Command, Kunming 650032, Yunnan Province, China
About author:Ruan Guang-ping, M.D., Associate chief physician, the Cell Biological Therapy Center, Kunming General Hospital of Chengdu Military Command, Kunming 650032, Yunnan Province, China
Supported by:
the National Support Program of China, No. 2014BAI01B01; Yunnan Provincial Science and Technology Project, No. 2013CA005

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
脐带间充质干细胞：是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。
树鼩：树鼩科树鼩属的动物，大脑较发达，多用于神经系统方面的研究，如对大脑皮质的定位，嗅神经、纹状体颞皮质，小脑核闭的形态，小树鼩的小脑发育、视觉系统、神经血管的研究，神经节细胞识别能力，口腔黏膜感觉末稍研究，神经系统的多肽、应激等研究。

摘要
背景：脐带间充质干细胞是组织工程研究中的理想种子细胞。
目的：分离、培养及鉴定树鼩脐带间充质干细胞，建立标准化的树鼩脐带间充质干细胞株。
方法：采用剖腹产分离树鼩脐带，用组织块贴壁法培养脐带间充质干细胞，用流式标记法检测脐带间充质干细胞表面标志，用成骨、成脂诱导培养基诱导脐带间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化。
结果与结论：①细胞鉴定：培养的脐带间充质干细胞CD90和CD105的阳性表达率分别为99.9%和99.8%，造血干细胞标志物CD34的表达率为0.0%，内皮细胞标志物CD31的表达率为0.7%，符合脐带间充质干细胞表面标志特征。②细胞形态：诱导后的脐带间充质干细胞茜素红染色观察到钙结节，油红O染色观察到脂滴。③结果证实，实验成功分离培养了具备成骨成脂分化能力的树鼩脐带间充质干细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0001-6805-5671(阮光萍)

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 脐带间充质干细胞, 树鼩, 成骨分化, 成脂分化, CD抗原, 表面标志物, 钙结节, 脂滴, 分离培养, 种子细胞

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that umbilical cord mesenchymal stem cells are ideal seed cells for tissue engineering research.
OBJECTIVE: To isolate, culture and identify tree shrew umbilical cord mesenchymal stem cells, in order to establish a standardized tree shrew umbilical cord mesenchymal stem cell lines.
METHODS: Caesarean-isolated tree shrew umbilical cord samples were used to isolate and culture umbilical cord mesenchymal stem cells using tissue explant adherent method. Flow cytometry assay was used to detect cell surface markers. Osteogenic and adipogenic induction media were used to induce umbilical cord mesenchymal stem cells to differentiate into osteoblasts and adipocytes.
RESULTS AND CONCLUSION: The cultured umbilical cord mesenchymal stem cells expressed CD90 and CD105 with the positive rate of 99.9% and 99.8% respectively. Hematopoietic stem cell marker CD34 expression rate was 0.0% and the endothelial cell marker CD31 expression rate was 0.7%, in line with the characteristics of umbilical cord mesenchymal stem cell surface markers. Calcium nodules by alizarin red staining and lipid droplets by oil red O staining were observed in the induced cells. These experimental findings indicated that umbilical cord mesenchymal stem cells from tree shrews capable of osteogenic and adipogenic differentiation were successfully isolated and cultured.

Key words: Stem Cells, Cell Differentiation, Tupaiidae, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

阮光萍，朱路，刘菊芬，李自安，王金祥，庞荣清，潘兴华. 树鼩脐带间充质干细胞分离、培养及成骨成脂分化的鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(9): 1373-1377.

Ruan Guang-ping, Zhu Lu, Liu Ju-fen, Li Zi-an, Wang Jin-xiang, Pang Rong-qing, Pan Xing-hua. Tree shrew umbilical cord mesenchymal stem cells: isolation, cultivation and osteogenic and adipogenic differentiation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(9): 1373-1377.

图/表（结果） 1

2.1 树鼩脐带间充质干细胞的形态 采用上述贴壁培养法分离培养的脐带间充质干细胞，原代培养24 h后即可见组织块周边有少量长梭形细胞生长(图1A)；72 h贴壁生长的细胞增多，细胞呈明显长梭形，并呈多个散在集落(图1B)；培养5 d后，非贴壁细胞经多次换液后已多数被清除，细胞铺满培养瓶底部80%左右可进行第1次传代(图1C)；第4代细胞呈长梭行、漩涡状生长，形态似皮肤成纤维细胞(图1D)。

2.2 树鼩脐带间充质干细胞的凋亡 流式细胞仪分析脐带来源贴壁生长的细胞是否表达脐带间充质干细胞表面抗原标志物。按前述方法收集第4代脐带间充质干细胞，进行流式细胞仪检测。结果显示，第4代脐带间充质干细胞 CD90和CD105的阳性表达率分别为99.9%和99.8%，造血干细胞标志物CD34的表达率为0，内皮细胞标志物CD31的表达率为0.7%；表明树鼩脐带来源贴壁生长的细胞符合间充质干细胞的表型特征(图2)。

2.3 树鼩脐带间充质干细胞的成骨诱导分化结果 诱导后的脐带间充质干细胞未染色前在形态上与未诱导的脐带间充质干细胞已有明显区别(图3A，B)；而茜素红染色后可见诱导后的细胞有明显红染的钙结节出现(图3C，D)，说明脐带间充质干细胞在体外有分化为成骨细胞的潜能。

2.4 树鼩脐带间充质干细胞的成脂诱导分化结果 未诱导的脐带间充质干细胞无明显脂肪滴出现(图4A)。诱导后的脐带间充质干细胞未染色前已可见到明显脂肪小滴(图4B)。油红O染色后的脂滴呈明显红染(图4C箭头所示)。说明脐带间充质干细胞在体外有分化为类脂肪细胞的潜能。

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引言

近年来，干细胞移植技术为临床带来了全新的治疗策略，已广泛应用于心、脑、肺、脾、肝、肾等疾病领域，取得了一定成果。间充质干细胞是来源于中胚层的成体干细胞，因具有自我更新和多向分化的潜能而日益受到人们的重视。在特定的体内外条件下，间充质干细胞可分化为脂肪、骨、肌肉、肌腱及心肌等多种组织细胞，而且在连续传代和低温保存复苏后仍具有多向分化能力，因此是目前用于修复损伤的组织器官的理想种子细胞^[1]。

间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，因具有很强的自我更新和向多种组织分化发育的潜能而日益受到人们的关注^[2-3]。目前已从骨髓、脂肪、羊膜、胎盘、脐血及脐带等组织中分离出间充质干细胞，其有向内皮细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞和神经细胞分化的能力^[4-5]。脐带来源广泛，取材方便，易于收集、保存、冷冻，属于医疗废弃物，不受伦理、道德及法律方面的限制^[6]，并且可在体外进行分离、培养，生物性能稳定，多次传代扩增仍能保持旺盛功能^[7-8]。脐带间充质干细胞在再生医学研究中具有极大潜质和广阔应用前景。

近年来关于人脐带间充质干细胞的分离、培养和鉴定有较多研究^[9]，研究显示了人脐带间充质干细胞在组织工程和再生医学中的广泛应用与安全性，可用于多种疾病的治疗，包括心肌梗死、脑出血、脊髓损伤、糖尿病和自身免疫病的治疗^[10-16]，人脐带间充质干细胞成为了组织工程与再生医学中最有潜力的种子细胞。

近年来树鼩作为动物疾病模型的应用越来越广泛，但树鼩脐带间充质干细胞的研究才刚刚起步，缺乏标准化的分离、培养和鉴定树鼩脐带间充质干细胞的方法。实验成功培养了树鼩脐带间充质干细胞，并通过流式鉴定、成骨及成脂诱导分化证实了树鼩脐带间充质干细胞获得了成功培养，为下一步组织工程的研究提供了理想的种子细胞。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学实验。

1.2 时间及地点 于2015年1月至2016年1月在解放军昆明总医院临床实验科完成。

1.3 材料 雌性足月妊娠树鼩10只，三四月龄，体质量130-150 g。实验动物生产许可证号为SCXK(滇)K2013-0005，实验动物使用许可证号为SYXK(滇)K2013-0012。所有实验步骤由成都军区昆明总医院伦理委员会批准。

1.4 方法

1.4.1 树鼩脐带间充质干细胞的分离及培养 足月妊娠树鼩，体积分数3%戊巴比妥0.5 mL肌肉注射麻醉，仰卧位固定于手术台上，手术野备皮，常规碘伏消毒、铺巾，沿腹中线纵行切口，逐层切开。沿腹部两侧打开腹腔，充分暴露树鼩子宫；剖开子宫后，再将新生树鼩与胎盘充分暴露，眼科小镊子夹住脐带中部，止血钳分别钳夹胎盘和新生树鼩两端的脐带，于止血钳下方剪断脐带两端，将剪下的脐带浸泡在含100 U/mL青霉素和链霉素的DMEM/F12基础培养基中。缝合子宫，确定无出血，腹腔无渗血后，逐层缝合肌肉、皮肤，消毒，纱布覆盖伤口。

于超净工作台内取出上述采集的脐带置于无菌培养皿内，加入适量双抗(以能湿润脐带为准)，用眼科剪剔除脐动脉、脐静脉及被膜等组织，生理盐水充分冲洗掉残存血迹。于培养皿内用眼科剪将脐带尽量剪碎，剪成体积小于1 mm×1 mm×1 mm的组织块，连同双抗转入离心管中，1 500 r/min离心5 min，弃上清。加入3 mL体积分数20%胎牛血清培养基并混匀，再次离心(转速和时间同上)，弃上清，细胞计数。加入1 mL体积分数20%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞，吹打均匀，接种于25 cm²的培养瓶内并使组织块均匀分布在瓶底，置于体积分数5%CO₂ 37 ℃培养箱中培养。经五六小时待大部分组织块贴壁后，缓慢沿培养瓶周边补加3.0-4.0 mL含体积分数20%胎牛血清的DMEM/F12培养基。在两三天后首次换液，以后每隔三四天换液1次。培养六七天待细胞生长融合达80%以上时，0.25%胰蛋白酶消化，体积分数20%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，并调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹传代于75 cm²的培养瓶内继续培养，之后视细胞生长情况按1∶2或1∶3传代培养，倒置光学显微镜下观察细胞生长情况。

1.4.2 树鼩脐带间充质干细胞的流式鉴定 当第4代脐带间充质干细胞生长至80%融合时，体积分数0.25%胰酶消化后收集细胞，准备3个EP管，每个EP管取约5×10⁵个细胞重悬于100 μL的抗体稀释液中，1管细胞中加入10 μL FITC标记的CD34和5 μL PE标记的CD105抗体，另2管细胞中分别加入10 μL FITC标记的CD90，CD31抗体，避光染色30 min，再加入鞘液400 μL/管，流式细胞仪分析。

1.4.3 树鼩脐带间充质干细胞的成骨诱导分化 当第4代细胞生长至80%-90%融合时，体积分数0.25%胰酶消化后，按照3×10³/cm²接种到放置盖玻片的六孔板中，每孔加入体积分数20%FBS的DMEM/F12培养液2 mL，培养箱内培养24 h后，吸弃培养液，生理盐水洗涤，加入诱导液(含FBS 20 mL、谷氨酰胺2 mL、地塞米松20 μL、β-磷酸甘油2 mL和抗坏血酸400 μL)连续培养，每两三天换液2次。40 g/L多聚甲醛固定后加入茜素红染色。生物显微镜下观察拍照。

1.4.4 树鼩脐带间充质干细胞的成脂诱导分化 当第4代细胞生长至80%-90%融合时，体积分数0.25%胰酶消化后，按照2×10⁴/cm²接种到放置盖玻片的6孔板中，每孔加入20%FBS的DMEM/F12培养液2 mL，每隔3 d用体积分数20%体积分数FBS的DMEM/F12完全培养液换液1次，直至细胞达到100%融合状态。吸弃体积分数20%FBS的DMEM/F12培养液，生理盐水洗涤后，加入A液(含FBS 20 mL、谷氨酰胺2 mL、胰岛素400 μL、IBMX 200 μL、吲哚镁锌200 μL和地塞米松200 μL)培养3 d后，换为B液(含FBS 20 mL、谷氨酰胺2 mL和胰岛素400 μL)继续培养24 h，再换为A液继续培养，如此循环3-5次后，换为B液连续培养7 d。40 g/L多聚甲醛固定后加入油红O染色。

1.5 主要观察指标 ①树鼩脐带间充质干细胞的形态；②树鼩脐带间充质干细胞的表面标志；③树鼩脐带间充质干细胞的成骨诱导染色结果；④树鼩脐带间充质干细胞的成脂诱导染色结果。

讨论

脐带间充质干细胞有广泛的用途^[17]。脐带间充质干细胞来源于脐带华尔通胶，因取材方便、增殖力强、分化潜能大，免疫原性低、无伦理道德限制而成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，具有广阔的应用前景。脐带间充质干细胞表达多种胚胎干细胞特有的分子标志，而且已证实，其培养基上清液中含有多种分泌的细胞因子，参与调节移植后的免疫反应^[18-21]。

脐带间充质干细胞比骨髓间充质干细胞有更多优势^[22]。间充质干细胞最早在骨髓中发现，由于间充质干细胞随着人体年龄的增长，数量及分化能力降低，因此，人们开始关注其他组织来源的间充质干细胞。脐带间充质干细胞与骨髓间充质干细胞有很多相似性，比如两者都不表达HLA-DR和D7分子，但是，脐带间充质干细胞有诸多优势，主要体现在：脐带为分娩后的废弃物，取材方便，来源广泛，无侵入性，潜在的捐献者比骨髓捐献者多；脐带间充质干细胞移植不受伦理、道德及法律方面的争论与限制；脐带间充质干细胞易于保存，需要时可立即获得，而骨髓间充质干细胞需要在移植前从捐献者体内获取，存在捐献者临时反悔的可能性；脐带间充质干细胞免疫原性比骨髓间充质干细胞低，异体移植无免疫排斥反应或反应较弱，无需经过严格配型即能使用，适宜于不同个体之间的移植；成人骨髓源间充质干细胞数量及增殖分化潜能随年龄的增大而下降，脐带间充质干细胞则无此缺点。

脐带间充质干细胞是再生医学研究中非常有潜力的种子细胞^[23]。近年来，对成体干细胞疗法的研究在不断增加^[24]。间充质干细胞是一个相当具有吸引力的种子细胞，可以用于治疗各种疾病，包括神经系统疾病，心血管疾病，自身免疫性疾病及内分泌疾病等^[25-27]。脐带来源的间充质干细胞是介于胚胎干细胞和成体干细胞之间的原始干细胞，其分化能力强，倍增时间短，具有免疫调节作用和较低的免疫原性，且无致肿瘤性^[28-29]。

实验成功获得了树鼩脐带间充质干细胞，此细胞是一种有潜力的种子细胞。实验采用组织块培养法提取脐带间充质干细胞。通常来讲组织块贴壁法是将小的组织块均匀铺于培养瓶底，原代细胞从组织块边缘爬出，方法易行，操作简单。流式检测细胞表面标志符合脐带间充质干细胞的标志表达，成骨、成脂分化实验证实获得的树鼩脐带间充质干细胞有多向分化潜能，为组织工程研究获得了理想的种子细胞，可用于树鼩动物疾病模型的治疗，有广泛的应用价值。实验通过树鼩脐带间充质干细胞的成功培养和鉴定，为今后的树鼩动物疾病模型及治疗的研究奠定了良好的基础，可为多种疾病的治疗机制的研究提供技术和方法。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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