小檗碱对肺癌干细胞增殖和凋亡的影响及其机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.001

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
肿瘤干细胞：是指具有干细胞性质的癌细胞，也就是具有“自我复制”以及“具有多细胞分化”等能力。肿瘤干细胞被认为是造成癌症转移、复发，或是肿瘤对于化疗、放疗产生抗性的原因之一。目前针对这个理论，学者希望研究出针对肿瘤干细胞的疗法，能够专一性地杀死肿瘤干细胞，以降低肿瘤产生抗药性或是转移的现象。
Hedgehog信号通路：是胚胎发育过程中各种组织生长和图式发育及成人组织稳态必不可少的一个重要的发育信号通路。该信号功能失常与诸如先天畸形和癌症等许多人类疾病相关。hedgehog(hh)基因首先作为一种胚胎体节畸形基因在果蝇中被发现。在哺乳动物中目前已确定了3个Hh家族成员：Sonic Hedgehog (Shh)，Indian Hedgehog (Ihh)和Desert Hedgehog。Hh信号通路的关键元件包括12次跨膜受体Patched (Ptc)，功能上作为Hh受体，7次跨膜蛋白Smoothened (Smo)，功能上作为必要的Hh信号传导子，以及锌指转录因子Cubitus interruptus (Ci)/Gli。

摘要
背景：前期研究发现小檗碱对多种肿瘤和肿瘤干细胞具有抑制作用，但是对肺癌干细胞的影响报道较少。
目的：探讨小檗碱对肺癌干细胞增殖和凋亡的影响及其可能的机制。
方法：采用免疫磁珠法分离CD133⁺肺癌干细胞，MTT法和流式细胞仪分别检测不同质量浓度小檗碱(0，2.5，5，10，20，40 mg/L)对CD133⁺肺癌干细胞增殖和凋亡的影响，免疫印迹检测小檗碱(0，20 mg/L)对肺癌干细胞中Ki67、Bax、Bcl-2、PTCH1、SHH、Gli-1和SMO蛋白表达的影响。
结果与结论：①采用免疫磁珠法分选得到高比率的CD133⁺肺癌干细胞；②小檗碱抑制肺癌干细胞生长，并呈浓度依赖性；③小檗碱促进肺癌干细胞凋亡，并呈浓度依赖性；④Ki67、Bcl-2、PTCH1、SHH、Gli-1和SMO蛋白在20 mg/L小檗碱组中的表达水平明显低于未加药组，Bax蛋白的表达水平则明显高于未加药组；⑤结果表明，小檗碱可能通过调控Hedgehog信号通路抑制肺癌干细胞增殖，促进其凋亡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0001-5560-5670(孙彦珍)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 肺癌, 肺癌干细胞, 小檗碱, 增殖, 凋亡, Hedgehog信号通路

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have demonstrated that berberine represses multiple tumors and tumor stem cells, but the effect of berberine on lung cancer stem cells (LCSCs) remains unclear.
OBJECTIVE: To explore the effect of berberine on the proliferation and apoptosis of LCSCs and the possible mechanism.
METHODS: CD133⁺ LCSCs were separated from A549 cells by immunomagnetic beads. The effects of different
concentrations (0, 2.5, 5, 10, 20, 40 mg/L) of berberine on the proliferation and apoptosis of LCSCs were determined by MTT and flow cytometry analysis, respectively. In order to further affirm the effect of berberine on the proliferation and apoptosis of LCSCs, the expression levels of Ki67, Bax and Bcl-2 protein were detected by western blot. In addition, to investigate the potential mechanism by which berberine exerts regulatory effects on LCSCs, the expression levels of Hedgehog signaling pathway-associated proteins (PTCH1, SHH, Gli-1 and SMO) were determined.
RESULTS AND CONCLUSION: After magnetic cell sorting, the content of the CD133⁺ fraction was enriched up to 84.13%. MTT and flow cytometry assays showed that berberine inhibited proliferation and promoted apoptosis of LCSCs in a concentration-dependent manner. Western blot analysis showed that the expression levels of Ki67, Bcl-2, PTCH1, SHH, Gli-1 and SMO proteins of LCSCs cultured in the medium with 20 mg/L berberine were dramatically decreased compared to the control, while the expression level of Bax protein was markedly increased compared to the control. These findings suggest that berberine may inhibit proliferation and promote apoptosis for LCSCs through the Hedgehog signaling pathway.

Key words: Lung Neoplasms, Neoplastic Stem Cells, Berberine, Hedgehog Proteins, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

孙彦珍，李珍，袁征. 小檗碱对肺癌干细胞增殖和凋亡的影响及其机制[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(9): 1313-1318.

Sun Yan-zhen, Li Zhen, Yuan Zheng. Effect of berberine on the proliferation and apoptosis of lung cancer stem cells and the possible mechanism[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(9): 1313-1318.

图/表（结果） 2

2.1 免疫磁珠分选后CD133⁺肺癌干细胞表达比例明显升高 通过免疫磁珠分选技术，从人肺癌细胞株A549中分选CD133⁺肺癌干细胞。经过流式细胞仪检测，分选后的CD133⁺阳性比例为84.13%，显著高于分选前(1.7%)，分选的纯度比较高，符合后续实验要求(P < 0.001，图1)。

2.2 小檗碱抑制肺癌干细胞增殖 为了探究小檗碱对肺癌干细胞增殖的影响，将处于对数生长期的肺癌干细胞在含有不同质量浓度小檗碱的培养液中培养24 h，采用MTT法检测小檗碱对肺癌干细胞增殖的影响。结果发现含有2.5，5，10，20，40 mg/L小檗碱的培养液培养的活细胞分别为未加药组的78.5%，63.4%，52.1%，43.9%和40.7%，可见小檗碱能够抑制肺癌干细胞生长，并呈浓度依赖性。

采用免疫印迹检测未加药组和20 mg/L小檗碱组的增殖相关蛋白Ki67的表达水平，发现20 mg/L小檗碱组的Ki67表达水平显著低于未加药组，这也表明了小檗碱能够抑制肺癌干细胞增殖(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，图2)。

2.3 小檗碱促进肺癌干细胞凋亡 为了探究小檗碱对肺癌干细胞凋亡的影响，将处于对数生长期的肺癌干细胞在含有不同质量浓度小檗碱(0，2.5，5，10，20，40 mg/L)的培养液中培养24 h，用流式细胞仪检测其凋亡率，各组的凋亡率分别为0.81%，7.21%，15.8%，28.2%，38.7%，40.5%，可见小檗碱能够促进肺癌干细胞凋亡，并呈浓度依赖性。

采用免疫印迹检测未加药组和20 mg/L小檗碱组的凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达水平。结果发现20 mg/L小檗碱组细胞中Bax蛋白的表达水平显著高于未加药组，而Bcl-2蛋白的表达水平显著低于未加药组，这也表明了小檗碱能够促进肺癌干细胞凋亡(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，图3)。

2.4 小檗碱抑制肺癌干细胞中Hedgehog信号通路的活性 为了探究小檗碱是否通过调控Hedgehog信号通路对肺癌干细胞的增殖和凋亡起作用，将处于生长对数期的肺癌干细胞培养在未加药和加有20 mg/L小檗碱的培养液中培养24 h，检测两组细胞中Hedgehog信号通路中PTCH1、SHH、Gli-1和SMO蛋白的表达。结果发现这4种蛋白在加药组细胞中的表达水平明显低于未加药组，这表明小檗碱抑制了Hedgehog信号通路的活性(P < 0.05，P < 0.01，图4)。所以，作者推测小檗碱对肺癌干细胞增殖和凋亡的影响可能是通过调控Hedgehog信号通路起作用。

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引言

迄今为止，肺癌仍是全球恶性肿瘤致死的首要原因，给人类健康带来了极大的危害^[1]。按病理学角度，肺癌可分为2组病理学亚型：80%是非小细胞肺癌，另外20%具有神经内分泌特性。非小细胞肺癌包括鳞癌(20%-25%)、腺癌(50%-60%)及大细胞癌，其5年的平均生存率低于15%^[2]。非小细胞肺癌低生存率主要归因于2个方面：一是大部分患者在确诊为肺癌的时候，已处于晚期，具有脑、肝、骨等的远处转移，错失了手术和放化疗的最佳机会，而另外一部分处于早期的患者，在经历手术切除和术后治疗后，仍避免不了复发和转移^[3-5]。此外，大多数肺癌细胞对化疗耐药，或很快对治疗产生抗拒，也是导致其低生存率的一个主要原因。

肿瘤干细胞理论的提出为肿瘤的诊断和治疗带来了新的发展。该理论提出肿瘤起源于肿瘤干细胞，这群细胞具有自我更新、无限增殖和多系分化的特点，是肿瘤发生，对放、化疗抵抗，以及复发和转移的根源^[6]。因此，寻找靶向治疗肿瘤干细胞的方法显得尤为重要。通过调控肿瘤干细胞的信号通路是靶向治疗肿瘤的一个重要路径。目前已经证实Hedgehog、Wnt及Bmi-1信号通路在干细胞自我更新中发挥着重要作用^[7-15]。已有研究报道上述信号通路的失调会引发非小细胞肺癌^[13-14^，^16]。Hedgehog通路的激活已被证实是多种肿瘤及肿瘤干细胞维持和增殖的重大事件，其中包括胰腺癌、胆囊癌、肺癌、肝癌、胃癌、血液系统恶性肿瘤、未分化甲状腺癌干细胞、乳腺癌干细胞、结肠癌干细胞、人骨髓间充质干细胞、造血干细胞等^[7^，^17-20]。

小檗碱又称黄连素，是从黄连属植物的根茎中提取的一种生物碱。在中国和印度用于治疗消化道疾病的历史已有3 000余年。在胃病的治疗中也一直备受重视，常用于治疗心下痞痛、肝火犯胃等。现代药理学认为小檗碱具有止泻、抗心律失常、抗菌、抗炎、抗溃疡、抗高血压、降血脂等功效^[21]。近年来，研究发现小檗碱对包括乳腺癌、胰腺癌、肺癌、直肠癌在内的多种肿瘤具有抑制作用，且毒副作用小^[22-24]。Ma等^[25]报道了小檗碱对乳腺癌干细胞的增殖具有抑制作用，并研究了其作用机制。目前，关于小檗碱对肺癌干细胞的影响及其机制尚未有报道。肺癌干细胞表面也会表达一些特异的抗原分子如CD133，可以利用CD133免疫表型进行流式细胞分选或者免疫磁珠分选，将肺癌干细胞(CD133⁺)和非肺癌干细胞(CD133^-)分开^[26]。

实验采用免疫磁珠分选技术从肺癌细胞株A549中分离出CD133⁺肺癌干细胞。采用MTT法研究不同质量浓度小檗碱对肺癌干细胞增殖的影响，并用免疫印迹检测小檗碱处理细胞中增殖相关蛋白Ki67的表达水平。采用流式细胞仪检测不同质量浓度小檗碱对肺癌干细胞凋亡的影响，并用免疫印迹检测小檗碱处理细胞中凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达水平。此外，还研究了小檗碱对肺癌干细胞作用的可能机制，为肺癌的发生以及防治提供新的线索和理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞分子生物学体外实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年1至12月在郑州颐和医院病理科完成。

1.3 材料 A549肺癌细胞株购自美国Invitrogen公司；小檗碱购自北京生物制品检定所，将其溶解于无菌三蒸水中，用时以细胞培养液稀释。RPMI1640培养基、胎牛血清(南京三生生物技术有限公司)；0.25%胰蛋白酶、EDTA(广州市达晖生物技术有限公司)；CD133细胞分离试剂盒，Annexin V/PI双染色法凋亡试剂盒(美国Gene Copoeia公司)；PE标记CD133抗体、Ki67抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体、PTCH1抗体、SHH抗体、Gli-1抗体、SMO抗体、GAPDH抗体、辣根过氧化物酶标记二抗(英国Abcam公司)；流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)；二甲基亚砜(上海国药集团)；酶标仪(美国Molecular Devices公司)；电泳仪(北京六一仪器厂)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞的培养 将A549肺癌细胞株接种到加有RPMI1640完全培养液(含有体积分数为10%胎牛血清、100 mg/L链霉素、100 U/mL青霉素)的培养瓶中，放置37 ℃、体积分数为5%CO₂、饱和湿度的培养箱进行培养。待细胞汇合度达到90%左右时，加入0.25%胰蛋白酶消化细胞，用RPMI1640完全培养基终止消化，吹打瓶底细胞使其完全脱落，然后收集细胞1 000 r/min离心5 min，传代培养。

1.4.2 免疫磁珠法分选CD133⁺细胞并检测纯度 按照CD133细胞分离试剂盒说明进行操作，将细胞加入到EDTA消化液中4 ℃孵育0.5 h，离心收集细胞，调整其细胞浓度为1×10¹⁰ L^-¹，PBS清洗2次，加入300 μL缓冲液重悬细胞，上磁性细胞分离柱进行分选，获得CD133⁺细胞，将其浓度再次调整至1×10¹⁰ L^-¹，在100 μL细胞液中加入PE标记的CD133抗体1 μg，4 ℃孵育0.5 h，PBS清洗2次，上流式细胞仪检测阳性细胞的百分率。

1.4.3 MTT法检测小檗碱对肺癌干细胞增殖的影响 将CD133⁺细胞以每孔2×10³的密度接种于96孔细胞培养板中，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂、饱和湿度的培养箱中培养，待其生长至对数期时，加入不同质量浓度的小檗碱(0，2.5，5，10，20，40 mg/L)干预24 h。在检测前每孔先加入MTT(5 g/L) 20 μL，37 ℃继续培养4 h，然后去除培养液，每孔加入二甲基亚砜150 μL溶解MTT生成的蓝紫色产物甲臜，用酶标仪读取各孔在490 nm波长处所对应的吸光度。

1.4.4 流式细胞仪检测小檗碱对肺癌干细胞凋亡的影响 将CD133⁺细胞以每孔2×10³的密度接种于96孔细胞培养板中，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂、饱和湿度的培养箱中培养，待其生长到指数期时，加入不同质量浓度的小檗碱(0，2.5，5，10，20，40 mg/L)干预24 h后离心收集细胞(800 r/min，5 min)，PBS清洗3次，严格按照Annexin V/PI双染色法凋亡试剂盒说明书操作，样品准备好后上流式细胞仪检测凋亡率。

1.4.5 免疫印迹检测小檗碱对肺癌干细胞相关蛋白表达的影响 将CD133⁺细胞用20 mg/L小檗碱或等量二甲基亚砜干预24 h后收集细胞。用细胞裂解液提取各细胞样本的总蛋白，利用Lowry法测定总蛋白浓度。以20 μg蛋白样品上样，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，在冰浴下100 V转至聚偏氟乙烯膜上，转膜2 h，用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入相对应的一抗放置于4 ℃冰箱过夜，次日用TBST洗涤3次，每次15 min，加入二抗，37 ℃恒温水浴中孵育0.5 h，再次使用TBST清洗3次，每次15 min，于暗室中压片，然后经显影、定影处理获得蛋白条带。

1.5 主要观察指标 ①分选前后CD133⁺肺癌干细胞所占的比例；②不同质量浓度小檗碱对肺癌干细胞增殖和凋亡的影响；③小檗碱对肺癌干细胞中Hedgehog信号通路活性的影响。

1.6 统计学分析 采用SPSS 10.0统计软件进行分析处理，计量资料以x(_)±s表示，采用t 检验比较组间差异，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

目前，肺癌仍是世界上严重威胁人类健康的主要疾病之一^[27]。当前的治疗手段不能显著提高肺癌患者的生存率。近年来肿瘤干细胞的研究取得了重大进展，这为肺癌治疗提供了新思路。因此实验采用免疫磁珠法分离肺癌干细胞，然后对其进行研究。

小檗碱是中药黄连的主要生物碱和药效成分，在黄连中的含量高达5.20%-7.69%^[28]。药理学认为小檗碱具有止泻、抗心律失常、抗菌、抗炎等多种功能。近年来，研究发现小檗碱对多种肿瘤具有抑制作用，且毒副作用小，具有良好的抗肿瘤应用前景。目前已报道，小檗碱可有效抑制白血病、乳腺癌、黑素瘤、肺癌、鼻咽癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞的增殖，诱导细胞周期阻滞和凋亡，并且在一定程度上能够抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移，防止其向远处转移^[28-32]。此外，也有很多研究报道了小檗碱对肿瘤干细胞具有抑制作用^[25^，^33]。目前关于小檗碱对肺癌干细胞的影响尚未有报道。实验探究了小檗碱对肺癌干细胞增殖和凋亡的影响，发现小檗碱抑制肺癌干细胞增殖，促进其凋亡，均呈浓度依赖性，这表明小檗碱是一个潜在的抗肺癌药，为以后小檗碱用于肺癌的治疗提供了依据。邹宇辉等^[34]研究表明小檗碱对胶质瘤干细胞生长的抑制作用随剂量和时间的增加而增强。RT-PCR检测显示：随时间延长，小檗碱可使干细胞标记物CD133、Nestin基因的mRNA表达水平逐步降低，而细胞分化标记物GFAP、MAP2基因的mRNA表达水平逐渐升高。免疫荧光法检测显示：小檗碱能抑制CD133、Nestin蛋白的表达，上调GFAP、MAP2蛋白的表达。结果表明小檗碱能有效抑制胶质瘤干细胞生长，并诱导其分化。那么，小檗碱对肺癌干细胞发挥作用的具体分子机制值得进一步探究。

Hedgehog信号通路最初发现于果蝇中，该通路不仅对哺乳动物胚胎发育过程中形态的形成起着重要作用，而且与人类多种肿瘤的发生与演进密切相关^[35-40]。该通路主要有信号肽(SHH，IHH，DHH)、跨膜受体(PTCH1，SMO)和下游转录因子(Gli-1)3个部分组成。Hedgehog信号通路的异常激活是多种肿瘤及肿瘤干细胞维持和增殖中的重大事件^[7，16-20]。研究报道肺癌的侵袭和转移过程中也伴有Hedgehog信号通路的激活^[41-42]。郑晓文等^[43]报道Hedgehog信号通路的重要成分PTCH1、SHH、Gli-1和SMO在肺癌干细胞中高表达，该信号通路通过介导VEGF、MMP-2和MMP-9表达来调节肺癌干细胞的增殖、侵袭、迁移及成瘤能力。蒋艳等^[32]报道了小檗碱对高转移性人肺癌细胞增殖具有抑制作用，可能与调节细胞内活性氧自由基产生从而影响细胞周期进程有关。Wang等^[44]报道小檗碱通过抑制Hedgehog通路的活性进而抑制成神经管细胞瘤的生长。那小檗碱是否能够通过调控Hedgehog信号通路的活性对肺癌干细胞的增殖和凋亡起作用呢？实验发现小檗碱能够抑制肺癌干细胞中Hedgehog信号通路PTCH1、SHH、Gli-1和SMO蛋白的表达，这表明小檗碱抑制了肺癌干细胞中Hedgehog信号通路的活性。作者推测小檗碱对肺癌干细胞增殖和凋亡的影响可能是通过调控Hedgehog通路起作用，这些结果表明小檗碱是一个潜在的抗肺癌药，可能通过调控Hedgehog信号通路来发挥其功效，为以后小檗碱用于肺癌的治疗提供了依据，也为肺癌的发生以及防治提供了新的线索和理论依据。但是关于小檗碱对肺癌干细胞发挥功能的精确分子机制仍有待进一步研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程