脐血间充质干细胞移植联合紫杉醇对卵巢癌A2780细胞增殖、
凋亡及侵袭的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.20.006

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
紫杉醇：是红豆杉属植物中的一种复杂的次生代谢产物，也是惟一可以促进微管聚合和稳定已聚合微管的药物。同位素示踪表明，紫杉醇只结合到聚合的微管上，不与未聚合的微管蛋白二聚体反应。细胞接触紫杉醇后会在细胞内积累大量的微管，这些微管的积累干扰了细胞的各种功能，特别是使细胞分裂停止于有丝分裂期，阻断了细胞的正常分裂。
细胞表面黏附分子CD133：为具有独特的5个跨膜结构域和2个大的N-糖基化细胞外环的跨膜糖蛋白，其表达的一个显著特点就是随着细胞的分化迅速下调，这使得它成为一个分离和鉴定干细胞和祖细胞的独特分子标志。CD133最初被认为是造血干细胞、内皮祖细胞的标志物，后来CD133被证实其作为一种干细胞标记物在多种实体肿瘤中表达。大量研究发现，CD133+肿瘤细胞与肿瘤发生、侵袭、转移、耐药及复发有着密切的关系。

摘要
背景：深入进行卵巢癌肿瘤干细胞的研究，有助于以卵巢癌肿瘤干细胞为靶点，改进卵巢癌的治疗策略，提高卵巢癌的生存率。
目的：探讨脐血间充质干细胞联合紫杉醇对卵巢癌A2780细胞增殖、凋亡、侵袭能力的影响。
方法：将人卵巢癌 A2780细胞分为3组：空白对照组(常规培养细胞)、脐血间充质干细胞组(加入1×106个脐血间充质干细胞悬液)、联合组(加入1×106个脐血间充质干细胞悬液的同时加入1 μmol/L紫杉醇溶液250 μL)。采用免疫荧光法检测卵巢癌A2780细胞CD133+抗原表达，流式细胞仪、TUNEL染色法、Transwell小室侵袭实验检测卵巢癌A2780细胞的增殖、凋亡和侵袭能力。
结果与结论：①空白对照组CD133+阳性抗原表达量很多，明显高于脐血间充质干细胞组及联合组，差异有显著性意义(P < 0.05)；②联合组细胞增殖能力、侵袭能力明显减弱，凋亡细胞数明显增多，与其他两组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；③结果表明，脐血间充质干细胞联合紫杉醇能抑制卵巢癌A2780细胞的增殖、侵袭，并促进其凋亡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-5772-964X(陈逢振)

关键词: 组织构建, 组织工程, 脐血间充质干细胞, 紫杉醇, 卵巢癌, A2780细胞, 细胞增殖, 细胞凋亡, 细胞侵袭

Abstract:

BACKGROUND: An intensive study on ovarian cancer A2780 cells contributes to modify treatment strategies targeting ovarian cancer stem cells and enhance survival rate of ovarian cancer patients.
OBJECTIVE: To investigate the effects of umbilical cord blood mesenchymal stem cells (UC-MSCs) transplantation combined with paclitaxel on proliferation, apoptosis, and invasion of A2780 human ovarian cancer cells in vitro.
METHODS: A2780 human ovarian cancer cells were assigned into three groups: blank control group (routine cell culture), UC-MSCs group (addition of suspension containing 1×106 UC-MSCs) and combined treatment group (combined addition of suspension containing 1×106 UC-MSCs and 250 μL of 1 μmol/L paclitaxel solution). CD133+ antigen expression, proliferation, apoptosis, and invasion were determined by immunofluorescent staining, flow cytometry, TUNEL staining, and Transwell chamber invasion assay, respectively.
RESULTS AND CONCLUSON: CD133+ antigen expression in the UC-MSCs group and combined treatment group was significantly decreased compared with the blank control group (P < 0.05). Proliferation and invasion abilities were significantly decreased, while apoptosis cell number was significantly increased in the combined treatment group compared with the other two groups (P < 0.05). These findings indicate that the combined treatment of UC-MSCs transplantation and paclitaxel can inhibit proliferation and invasion and promote apoptosis of A2780 human ovarian cancer cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Fetal Blood, Mesenchymal Stem Cells, Paclitaxel, Ovarian Neoplasms

中图分类号:

R318

陈逢振，尹利荣. 脐血间充质干细胞移植联合紫杉醇对卵巢癌A2780细胞增殖、
凋亡及侵袭的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(20): 2927-2932.

Chen Feng-zhen, Yin Li-rong. Effects of combined treatment using umbilical cord blood mesenchymal stem cell transplantation and paclitaxel on proliferation, apoptosis, and invasion of A2780 ovarian cancer cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(20): 2927-2932.

图/表（结果） 5

2.1 脐血间充质干细胞的形态原代分离培养的脐血单个核细胞小而圆，呈悬浮状态，仅有极少量贴壁，散在存在。培养48-72 h后悬浮细胞逐渐坏死破碎，有较多贴壁细胞出现，形成细胞集落，细胞胞体呈梭形，体积较大，类似成纤维细胞，有粗大突起伸出。3周后形成几十到几百个细胞的克隆，进一步传代培养后，细胞体积逐步增大，为成纤维样的长梭形细胞，单个核，有较长的突起，折光性较强。流式细胞仪检测结果显示CD29、CD49、CD90及CD105阳性表达，CD34、CD45呈阴性表达。脐血间充质干细胞的均一性好，纯度达95%以上，细胞数量和质量能够满足实验要求，见图1。

2.2 卵巢癌A2780细胞的形态培养24 h可见贴壁生长的细胞，3-5 d可长满瓶底，细胞呈梭形、不规则状生长。将A2780细胞接种于无血清DMEM/F12培养基，诱导培养24 h后可见悬浮生长的单细胞开始出现，细胞形态呈圆形，大小一致，折光性强。经过数次传代培养后，悬浮的细胞球逐渐增多，体积变大，细胞球呈卵状(图2)。在无血清培养条件下，仍有许多细胞贴壁生长，传代时仅收集细胞球进行培养，次日换液，三四天传代1次。

2.3 卵巢癌A2780细胞的CD133⁺抗原表达免疫荧光法检测结果显示，卵巢癌A2780细胞的CD133⁺抗原因结合了FITC标记二抗而呈绿色荧光，细胞核因PI染色而呈蓝色荧光。从绿色荧光来观察，CD133⁺抗原的表达量在空白对照组最多，表明CD133⁺抗原是卵巢癌干细胞的特异性标记物。脐血间充质干细胞组及联合组的CD133⁺抗原表达量明显低于空白对照组，脐血间充质干细胞组又明显高于联合组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3。

2.4 卵巢癌 A2780细胞增殖能力卵巢癌A2780细胞的增殖能力在各个时间点比较，联合组<脐血间充质干细胞组<空白对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.5 卵巢癌A2780细胞凋亡能力 TUNEL染色法检测到卵巢癌A2780细胞在联合组的凋亡率为(38.57± 1.76)%，明显大于脐血间充质干细胞组(26.13±1.28)%和空白对照组(5.71±1.34)%，脐血间充质干细胞组凋亡率明显大于空白对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。各组凋亡指数比较见图4。

2.6 卵巢癌A2780细胞体外侵袭力 Transwell小室侵袭实验结果显示，卵巢癌A2780的侵袭能力在联合组得到明显抑制。与空白对照组(60.54±6.38)和脐血间充质干细胞组(58.33±6.43)穿过滤膜的细胞数量相比，联合组细胞穿膜细胞数明显减少(24.67±5.32)，差异有显著性意义(P < 0.05)。实验结果表明脐血间充质干细胞移植联合紫杉醇干预可能有效降低卵巢癌A2780细胞的侵袭能力，见图5。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点实验于2014年1月至2015年7月在天津医科大学动物实验中心完成。

1.3 材料人卵巢癌A2780细胞株购自上海拜力生物科技有限公司；脐血由天津市中心妇产医院提供；标准胎牛血清购自Hyclone公司，4 ℃下保存；DMEM、磷酸盐缓冲液购自美国Invitrogen Gibco公司，4 ℃下保存；20×TBS缓冲液等均购自杭州碧云天生物科技公司；流式细胞仪购自德国Merck公司；PVDF膜购自美国Millipore公司；碘化丙啶和RNase酶购自美国Gibco公司；Cell Invasion Assay Kit购自Chemicon International Inc. No. ECM550；凋亡试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；兔抗人CD133抗体、FITC结合的羊抗兔二抗均购自Abcam公司，-20 ℃下保存；荧光显微镜购自Olympus公司；超净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司；CO₂恒温培养箱购自美国Shell Lab公司；紫杉醇购自安徽大东方药业有限责任公司。

1.4 实验方法

1.4.1 脐血间充质干细胞的培养无菌操作条件下获得脐血50-100 mL，20 U/mL肝素抗凝，4 ℃冰箱保存，在采集后12 h内进行分离。将脐血与Hank’s液以1∶1稀释，取无菌离心管数个加入密度为1.077 g/cm³的淋巴细胞分离液，稀释后的脐血以1∶2的比例加入，保持液面分界状态，以800×g离心20 min，小心吸取中间白膜层，用磷酸盐缓冲液冲洗2遍，以彻底洗去上清。分离单个核细胞后，以1×10⁹ L^-1细胞浓度接种于含体积分数为5%胎牛血清的DMEM/F12的培养瓶中，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂饱和湿度的孵箱中培养。第1次传代后每3 d换液1次，选取生长优良的第3代细胞，用2.5 g/L胰蛋白酶消化后制成1.0×10⁶的单细胞悬液，每管 0.1 mL，加入荧光标记小鼠抗人抗体CD34-FITC、CD45-FITC、CD49-FITC、CD90-FITC、CD105-FITC及CD29-FITC各20 μL及相应对照标记，在室温下反应30 min，经PBS洗涤1遍后，1 000 r/min离心5 min，振荡混匀，流式细胞仪检测表面标记。

1.4.2 卵巢癌A2780细胞的培养及分组卵巢癌A2780细胞接种于含有体积分数为10%胎牛血清、 100 U/mL青霉素和链霉素的DMEM培养基中，置于 37 ℃体积分数为5%CO₂培养箱中培养，每一两天换液1次。随机选取处于对数生长期的卵巢癌A2780细胞以2×10⁵/孔接种于6孔板，待其融合度达到60%-70%时分为3组：空白对照组(常规培养细胞)、脐血间充质干细胞组(加入1×10⁶个脐血间充质干细胞悬液)、联合组(加入1×10⁶个脐血间充质干细胞悬液的同时加入1 μmol/L紫杉醇溶液250 μL)。

1.4.3 免疫荧光法检测卵巢癌A2780细胞的CD133⁺抗原表达随机选取处于对数期生长的卵巢癌A2780细胞，吹打制成单细胞悬液，以1 000 r/min的速度离心 5 min，以致细胞甩片至破片上；放置玻片于40 g/L冰冻多聚甲醛中固定20 min，去除固定液，冷PBS冲洗3遍；滴加0.3% Triton X-100透膜5 min，冷PBS冲洗3遍，每次5 min；用5% BSA封闭20 min后甩干；将兔抗人CD133一抗以1︰200的比例滴入，4 ℃下孵育过夜；待第2天取出后在室温中放置10 min，随后用冷PBS冲洗 3遍；将FITC标记的羊抗兔二抗以1︰500的比例滴入，于37 ℃下孵育30 min，再经冷PBS冲洗3遍；滴入即用型的DAPI染色3 min，冷PBS冲洗3遍；封固后，放置于显微镜下进行照相、观察。

1.4.4 流式细胞仪检测卵巢癌A2780细胞的增殖情况

将处于对数生长期的卵巢癌A2780细胞用0.02% EDTA-0.25%胰酶消化，制成单细胞悬液，以每孔1×10⁵的细胞密度接种于培养板，用含5%去激素的胎牛血清培养基培养24 h，换成无胎牛血清的培养液，培养24 h达到同步化，然后按实验分组处理细胞，以PBS调整细胞浓度为1×10⁸L^-1，Annexin V-FITC/PI染色20 min，离心洗涤，上流式细胞仪分析细胞的增殖情况。

1.4.5 TUNEL染色法检测卵巢癌A2780细胞的凋亡情况制作细胞爬片，取对数生长期细胞以40 g/L多聚甲醛溶液固定10 min，新鲜配制体积分数为3% H₂O₂室温处理，0.1% Triton X-100打孔，按TUNEL试剂盒说明操作，加入DAB混合液避光显色，苏木精轻度复染；梯度乙醇脱水，二甲苯透明1 min×2次，中性树胶封固，显微镜观察。每张切片观察3个视野，每个视野连续数300个细胞，计数凋亡细胞百分比即为凋亡指数。凋亡指数(%)=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.4.6 Transwell小室侵袭实验检测卵巢癌A2780的侵袭能力于Transwell小室聚碳酸酯微孔滤膜上铺Matrigel 50 μg/孔，加入体积分数为10%胎牛血清于聚合好的小室下室做为条件培养液，将上述3组卵巢癌 A2780细胞悬液100 μL(细胞浓度为3×10⁵ L^-1)加入上室，放置于培养箱中培养24 h后取出，以棉签仔细刮除滤膜上室中未穿过的卵巢癌A2780细胞，40 g/L多聚甲醛固定10 min，用PBS轻轻漂洗3遍，苏木精染色10 min，用PBS冲洗小室，待自然凉干，用手术刀片沿边缘小心取下上室的聚碳酸酯滤膜，以膜内面朝上用树脂胶固定于玻片上，封固；干燥后光镜下计数膜下表面的细胞。每张膜分别计数5个视野，计算平均数。每组平行设3个小室，重复3次。

1.5 主要观察指标 ①卵巢癌A2780细胞的CD133⁺抗原表达。②卵巢癌A2780细胞的增殖、凋亡、侵袭能力。

1.6 统计学分析应用SPSS 16.0统计软件进行分析，所有数据以x(_)±s表示，两组间比较用t 检验，多组间连续变量比较用方差分析，双侧检验水准α=0.05，P < 0.05为差异具有显著性意义。

讨论

近年来随着对肿瘤不断深入地研究发现，肿瘤干细胞与肿瘤的多药耐药、肿瘤休眠及复发密切相关，从而抵制并逃避治疗，导致肿瘤耐药及进展。研究发现卵巢癌肿瘤干细胞的无限增殖、分化、转移在卵巢癌的发生发展过程中起关键作用^[13-15]。脐血间充质干细胞是一类具有自我更新和复制能力的原始细胞，具有弱免疫原性、强大的迁移力和趋瘤性等独特的生物学特性，在抗肿瘤方面具有良好应用前景及科研价值^[16-18]。卵巢癌A2780细胞是对化疗较为敏感的肿瘤干细胞，给予正规的化疗手段及方法，可以不同程度地改善治疗效果^[19-21]。化疗药物紫杉醇作为卵巢癌治疗的一项重要辅助治疗手段，在临床上的应用也越来越广泛^[22-23]。实验将紫杉醇化疗与脐血间充质干细胞联合应用到卵巢癌A2780细胞中，对肿瘤治疗具有的重要意义。

成功分离、培养肿瘤干细胞是研究其生物学特性的基础，无血清培养法有利于肿瘤干细胞体外扩增，并可验证体外培养的肿瘤干细胞悬浮生长、自我更新、无限增殖、多向分化潜能等生物学特性^[24-26]。应用某些肿瘤标志物与干细胞标志物相结合的方法来分析肿瘤干细胞的特异性标志物，是当前肿瘤干细胞分离鉴定的主要手段之一^[27-28]。大量研究表明紫杉醇对微管系统的作用及对G₂/M期的阻滞可能是诱导细胞凋亡的机制之一，故而选用紫杉醇联合脐血干细胞，通过诱导卵巢癌A2780细胞在紫杉醇作用下发生有丝分裂阻滞增多，导致细胞对紫杉醇的敏感性增加，以期望达到较好的疗效^[29-30]。

实验以人卵巢癌A2780细胞为研究对象，在体外成功分离培养出卵巢癌A2780干细胞，通过免疫荧光法检测到卵巢癌A2780细胞的CD133⁺抗原表达显著，证明了CD133⁺抗原是卵巢癌A2780细胞的特异性标志物；通过流式细胞仪检测到联合方案干预后可以抑制A2780细胞的增殖。TUNEL染色法检测卵巢癌A2780细胞在联合组的凋亡率明显大于脐血间充质干细胞组及空白对照组，可见明显促进卵巢癌A2780细胞的凋亡。Transwell小室侵袭实验检测卵巢癌A2780细胞的侵袭能力在联合组得到明显抑制，而脐血间充质干细胞组及空白对照组则改变不明显，此结果说明了联合方案可以抑制卵巢癌A2780肿瘤干细胞的侵袭能力。

综上所述，脐血间充质干细胞与紫杉醇化疗联合应用方案可以明显抑制卵巢癌A2780肿瘤干细胞的增殖、侵袭，并可促进卵巢癌A2780肿瘤干细胞的凋亡，对卵巢癌的预防、早期诊断及预后具有重要的意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程