人脐带间充质干细胞来源外泌体提取方法的比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0468

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (9): 1382-1388.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0468

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人脐带间充质干细胞来源外泌体提取方法的比较

郭莹¹，王秀伟²，牛玉虎³，王莉¹，周楠⁴，李佰一¹，王振东¹，张蘋¹，高亚杰¹，牛勃³

¹山西医科大学基础医学院，山西省太原市 030001；²首都儿科研究所，北京市 100020；山西医科大学，³生物化学与分子生物学教研室，⁴解剖教研室，山西省太原市 030001

修回日期:2017-10-13 出版日期:2018-03-28 发布日期:2018-04-03
通讯作者: 牛勃，教授，博士生导师，山西医科大学生物化学与分子生物学教研室，山西省太原市 030001
作者简介:郭莹，女，1993年生，山西省临汾市人，汉族，山西医科大学在读硕士，主要从事干细胞治疗研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81370312)；海南省自然科学基金(812180)；三亚市医疗卫生科技创新项目(2014 YW01)

Comparison of exosome extracting methods from human umbilical cord mesenchymal stem cells

Guo Ying¹, Wang Xiu-wei², Niu Yu-hu³, Wang Li¹, Zhou Nan⁴, Li Bai-yi¹, Wang Zhen-dong¹, Zhang Pin¹, Gao Ya-jie¹, Niu Bo³

¹School of Basic Medicine, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China; ²Capital Institute of Pediatrics, Beijing 100020, China; ³Department of Biochemistry and Molecular Biology, ⁴Department of Anatomy, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China

Revised:2017-10-13 Online:2018-03-28 Published:2018-04-03
Contact: Niu Bo, Professor, Doctoral supervisor, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
About author:Guo Ying, Master candidate, School of Basic Medicine, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81370312; the Natural Science Foundation of Hainan Province, No. 812180; the Scientific Innovation Project for Medical Treatment and Public Health in Sanya City, No. 2014 YW01

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
外泌体：是由多种细胞分泌的直径在30-100 nm的亚细胞微泡结构，具有其来源细胞的基本生物学特性。较干细胞而言，外泌体具有易于保存、生物学特性稳定等优点，其在干细胞替代疗法中起到了很重要的作用。现阶段关于外泌体的提取方法有超速离心法、试剂盒法、密度梯度离心法等，但仍没有统一的标准，因此筛选出最优的提取方法是目前急需解决的问题。
外泌体的生物学特性：①异质性，主要表现在物理性质上，因其粒径、密度、沉降系数不同于其他细胞分泌的囊泡而得以分离与鉴定；②靶向性，外泌体的分泌方式是由内吞小体出泡排出体外，此分泌方式也决定了其在细胞信息传递中的作用，目前国内外研究发现其较易与邻近细胞的细胞膜发生融合，被认为是一种介导细胞间信息传递的重要“内分泌”机制，而且其通路是特定的；③稳定性，主要依靠其表面的脂质层，可以保护其不被破坏。

摘要
背景：近年来“无细胞”的干细胞治疗方法备受关注，但对于提取高质量外泌体的方法尚无确切定论。
目的：采用3种方法提取人脐带间充质干细胞中的外泌体，筛选最佳提取外泌体的方法。
方法：分别用Total Exosome Isolation试剂盒、Exo Quick试剂盒及差速超速离心法提取人脐带间充质干细胞来源的外泌体。使用透射电镜观察外泌体形态，BCA法进行蛋白质定量，western blot检测外泌体表面标志物CD9、CD81、CD63的表达。
结果与结论：①3种方法均可以从培养基中提取到间充质干细胞来源的外泌体，并且在透射电镜下观察到圆形或椭圆形的膜性小囊泡；②差速超速离心法提取的外泌体中的蛋白浓度和纯度最高，Exo Quick试剂盒法其次，Total Exosome Isolation试剂盒法得到的蛋白浓度最低，且3者比较差异有显著性意义(P < 0.05)；③3种方法提取的外泌体均表达其表面特异性标志物 CD81、CD63和CD9，且在含有相同蛋白浓度的情况下，差速超速离心法提取的外泌体的表面标志物含量最高，Exo Quick试剂盒法其次，Total Exosome Isolation试剂盒法提取的外泌体表面标志物含量较低；④差速超速离心法和Total Exosome Isolation试剂盒法的操作时间明显多于Exo Quick试剂盒法，差异有显著性意义(P < 0.05)；⑤结果表明，尽管差速超速离心法耗时稍长，但是纯度相对较高，满足实验的基本需求，可作为一种合理的分离方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-1837-3521(郭莹)

关键词: 外泌体, 提取方法, 培养基, 干细胞, Exo Quic-TC试剂盒法, 差速超速离心法, Total Exosome Isolation试剂盒法, 人脐带间充质干细胞, 干细胞治疗, “无细胞”替代疗法, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Cell-free stem cell therapy has been an issue of concern, but there is no conclusion on how to extract high-quality exosomes.
OBJECTIVE: To extract exosomes from human umbilical cord mesenchymal stem cells by using three different methods, and then to screen the optimal method.
METHODS: Exosomes were extracted from human umbilical cord mesenchymal stem cells by using the Total Exosome Isolation test kit, Exo Quick test kit and differential ultracentrifugation method, respectively. Then, transmission electron microscopy was used for morphological observations, BCA was utilized to quantify the protein, and western blot assay was applied to detect surface markers CD9, CD81 and CD63.
RESULTS AND CONCLUSION: Extraction of exosomes was completed by all the three methods, and round or oval membranous vesicles were observed under the transmission electron microscope. The protein content and purity of exosomes was highest in the differential ultracentrifugation group, followed by the Exobiology Quick kit group, and lowest in the Total Exosome Isolation kit group, and there were significant differences among the three groups (P < 0.05). Under the same protein concentration, surface specific markers, CD81, CD63 and CD9, were expressed highest in the differential ultracentrifugation group, followed by the Exobiology Quick kit group, and lowest in the Total Exosome Isolation kit group. The operating time was significantly lower in the Exobiology Quick kit group compared with the other two groups (P < 0.05). To conclude, despite a longer operating time, the differential ultracentrifugation method is a rational method to extract enough exosomes with relative high purity.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Exosomes, Umbilical Cord, Mesenchymal Stem Cells, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

郭莹，王秀伟，牛玉虎，王莉，周楠，李佰一，王振东，张蘋，高亚杰，牛勃. 人脐带间充质干细胞来源外泌体提取方法的比较[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(9): 1382-1388.

Guo Ying, Wang Xiu-wei, Niu Yu-hu, Wang Li, Zhou Nan, Li Bai-yi, Wang Zhen-dong, Zhang Pin, Gao Ya-jie, Niu Bo. Comparison of exosome extracting methods from human umbilical cord mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(9): 1382-1388.

图/表（结果） 1

2.1 脐带间充质干细胞的形态 培养7-12 d时，倒置显微镜下可以看到贴壁细胞，呈梭形，较肥大。待细胞融合率达80%，进行第1次传代，传代培养至第4代，细胞形态均匀一致，排列紧密，集落中心呈漩涡状，见图1。

2.2 细胞表面标志的表达 流式细胞仪检测结果显示，细胞高表达CD29、CD44和CD105(> 95%)，极低表达CD34与CD45，符合间充质干细胞的特性，见图2。

2.3 人脐带间充质干细胞的成骨成脂分化能力 第4代人脐带间充质干细胞加入成骨诱导培养基后，细胞生长缓慢，培养到第20天经茜素红染色，显微镜下可见有明显的红色钙结节(图3A)。加入成脂诱导培养基后，培养到第15天经油红O染色，镜下可见胞浆内有红色圆形脂滴(图3B)。

2.4 外泌体的形态 透射电镜观察发现经3种方法提取到的外泌体均呈椭圆形囊泡，可见外周分界清楚的膜性结构，可单个分布，也可聚集成群。差速超速离心法获得的外泌体直径多分布于30-100 nm，较为均一，Exo Quick试剂盒法获得的外泌体不够均匀，Isolation试剂盒法获得的外泌体背景污染较严重，可能存在蛋白质污染，见图4。

2.5 外泌体蛋白浓度 绘制标准曲线，根据标准曲线得出的公式y=0.388x+0.029 4(相关系数R²=0.994 7)分别算出相应的蛋白量，经计算得出差速超速离心法所得的外泌体蛋白浓度为2.0-3.0 g/L，Exo Quick试剂盒提取方法获得的外泌体蛋白浓度为1.5-2.5 g/L，Total Exosome Isolation试剂盒法获得的外泌体蛋白浓度为1.0-2.0 g/L。差速超速离心法获得的外泌体蛋白浓度较其他两种方法高，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.6 SDS-PAGE电泳及凝胶图像 3种方法所得的外泌体中含有多种蛋白成分，而在上样量以及条件相同的情况下，不同方法得到的外泌体的蛋白表达强度不同，在M_r35 000-49 000之间及M_r19 000以下较为富集。差速超速离心法和Exo Quick试剂盒提取的外泌体在M_r40 000-49 000的蛋白含量明显高于Total Exosome Isolation试剂盒法。在M_r19 000以下，差速超速离心法提取的外泌体蛋白含量明显高于其他两种方法，见图5。

2.7 Western blot检测外泌体标志蛋白表达 利用Western blot方法检测3种方法提取的外泌体中的CD9、CD63、CD81表达。结果显示3种方法提取的外泌体都可以表达特异性表面标志物CD9、CD63和CD81(图6)。差速超速离心法提取到的外泌体特异性标志物CD9与CD63在表达强度上远高于其他两种方法；其次，Exo Quick试剂盒法和Total Exosome Isolation试剂盒法提取到的外泌体特异性标志物仅在CD81的表达上略高于差速超速离心法(图7)，说明差速超速离心法提取到的样本较其他两种纯。

2.8 操作时间比较 差速超速离心法平均耗时(160.0± 8.0) min；Exo Quick试剂盒法平均耗时(40.0±4.5) min；Total Exosome Isolation试剂盒法平均耗时(111.5±5.0) min。传统差速超速离心法和Total Exosome Isolation试剂盒法的操作时间明显多于Exo Quick试剂盒法，差异有显著性意义 (P < 0.05)。

参考文献

[1] Johnstone RM, Adam M, Hammond JR, et al. Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes). J Biol Chem. 1987;262(19):9412-9420.

[2] Ho DH, Yi S, Seo H, et al. Increased DJ-1 in urine exosome of Korean males with Parkinson's disease. Biomed Res Int. 2014;2014:704678.

[3] Pironti G, Strachan RT, Abraham D, et al. Circulating Exosomes Induced by Cardiac Pressure Overload Contain Functional Angiotensin II Type 1 Receptors. Circulation. 2015;131(24):2120-2130.

[4] Yang J, Wei F, Schafer C, et al. Detection of tumor cell-specific mRNA and protein in exosome-like microvesicles from blood and saliva. PLoS One. 2014;9(11):e110641.

[5] 张顺华. 猪不同泌乳期乳汁Exosome中microRNA转录组的鉴定和表达谱分析[D].雅安:四川农业大学,2013.

[6] Lässer C. Identification and analysis of circulating exosomal microRNA in human body fluids. Methods Mol Biol. 2013; 1024:109-128.

[7] Vlassov AV, Magdaleno S, Setterquist R, et al. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim Biophys Acta. 2012;1820(7):940-948.

[8] Simons M, Raposo G. Exosomes--vesicular carriers for intercellular communication. Curr Opin Cell Biol. 2009;21(4): 575-581.

[9] Eggenhofer E, Steinmann JF, Renner P, et al. Mesenchymal stem cells together with mycophenolate mofetil inhibit antigen presenting cell and T cell infiltration into allogeneic heart grafts. Transpl Immunol. 2011;24(3):157-163.

[10] Tian LL, Yue W, Zhu F, et al. Human mesenchymal stem cells play a dual role on tumor cell growth in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 2011;226(7):1860-1867.

[11] Roura S, Bagó JR, Soler-Botija C, et al. Human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells promote vascular growth in vivo. PLoS One. 2012;7(11):e49447.

[12] Bagno LL, Werneck-de-Castro JP, Oliveira PF, et al. Adipose-derived stromal cell therapy improves cardiac function after coronary occlusion in rats. Cell Transplant. 2012; 21(9):1985-1996.

[13] Meyer GP, Wollert KC, Lotz J, et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: eighteen months' follow-up data from the randomized, controlled BOOST (BOne marrOw transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial. Circulation. 2006;113(10):1287-1294.

[14] Wubbolts R, Leckie RS, Veenhuizen PT, et al. Proteomic and biochemical analyses of human B cell-derived exosomes. Potential implications for their function and multivesicular body formation. J Biol Chem. 2003;278(13):10963-10972.

[15] Théry C, Ostrowski M, Segura E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 2009; 9(8):581-593.

[16] Théry C, Boussac M, Véron P, et al. Proteomic analysis of dendritic cell-derived exosomes: a secreted subcellular compartment distinct from apoptotic vesicles. J Immunol. 2001;166(12):7309-7318.

[17] Lai RC, Arslan F, Lee MM, et al. Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury. Stem Cell Res. 2010;4(3):214-222.

[18] 赵晓琦,程敏.外泌体相关微小RNA的生物学特性及其在多种心血管疾病中的诊断价值[J].临床心血管病杂志,2015,31(9): 924-928.

[19] Ciravolo V, Huber V, Ghedini GC, et al. Potential role of HER2-overexpressing exosomes in countering trastuzumab-based therapy. J Cell Physiol. 2012;227(2): 658-667.

[20] Sheldon H, Heikamp E, Turley H, et al. New mechanism for Notch signaling to endothelium at a distance by Delta-like 4 incorporation into exosomes. Blood. 2010;116(13): 2385-2394.

[21] Trajkovic K, Hsu C, Chiantia S, et al. Ceramide triggers budding of exosome vesicles into multivesicular endosomes. Science. 2008;319(5867):1244-1247.

[22] Jansen FH, Krijgsveld J, van Rijswijk A, et al. Exosomal secretion of cytoplasmic prostate cancer xenograft-derived proteins. Mol Cell Proteomics. 2009;8(6):1192-1205.

[23] Chen TS, Arslan F, Yin Y, et al. Enabling a robust scalable manufacturing process for therapeutic exosomes through oncogenic immortalization of human ESC-derived MSCs. J Transl Med. 2011;9:47.

[24] Chang SH, Hla T. Post-transcriptional gene regulation by HuR and microRNAs in angiogenesis. Curr Opin Hematol. 2014; 21(3):235-240.

[25] Jakob P, Doerries C, Briand S, et al. Loss of angiomiR-126 and 130a in angiogenic early outgrowth cells from patients with chronic heart failure: role for impaired in vivo neovascularization and cardiac repair capacity. Circulation. 2012;126(25):2962-2975.

[26] 胡国文,李青,牛鑫,等. 旋转超滤:一种提取细胞外泌体的新方法[J]. 第二军医大学学报,2014,35(6):598-602.

[27] Qiao C, Xu W, Zhu W, et al. Human mesenchymal stem cells isolated from the umbilical cord. Cell Biol Int. 2008;32(1):8-15.

[28] 周楠. 脐带间充质干细胞来源Exosomes的制备及其与源细胞体内治疗效果的比较研究[D].太原:山西医科大学,2014.

[29] Zhang L, Wu X, Luo C, et al. The 786-0 renal cancer cell-derived exosomes promote angiogenesis by downregulating the expression of hepatocyte cell adhesion molecule. Mol Med Rep. 2013;8(1):272-276.

[30] Simari RD, Pepine CJ, Traverse JH, et al. Bone marrow mononuclear cell therapy for acute myocardial infarction: a perspective from the cardiovascular cell therapy research network. Circ Res. 2014;114(10):1564-1568.

[31] Quyyumi AA, Vasquez A, Kereiakes DJ, et al. PreSERVE-AMI: A Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled Clinical Trial of Intracoronary Administration of Autologous CD34+ Cells in Patients With Left Ventricular Dysfunction Post STEMI. Circ Res. 2017;120(2):324-331.

[32] Bruno S, Grange C, Collino F, et al. Microvesicles derived from mesenchymal stem cells enhance survival in a lethal model of acute kidney injury. PLoS One. 2012;7(3):e33115.

[33] Li T, Yan Y, Wang B, et al. Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis. Stem Cells Dev. 2013;22(6):845-854.

[34] Caradec J, Kharmate G, Hosseini-Beheshti E, et al. Reproducibility and efficiency of serum-derived exosome extraction methods. Clin Biochem. 2014;47(13-14): 1286-1292.

[35] Diamandis EP. Mass spectrometry as a diagnostic and a cancer biomarker discovery tool: opportunities and potential limitations. Mol Cell Proteomics. 2004;3(4):367-378.

[36] Yamada T, Inoshima Y, Matsuda T, et al. Comparison of methods for isolating exosomes from bovine milk. J Vet Med Sci. 2012;74(11):1523-1525.

[37] Arslan F, Lai RC, Smeets MB, et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes increase ATP levels, decrease oxidative stress and activate PI3K/Akt pathway to enhance myocardial viability and prevent adverse remodeling after myocardial ischemia/reperfusion injury. Stem Cell Res. 2013;10(3):301-312.

[38] Xu R, Greening DW, Zhu HJ, et al. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. J Clin Invest. 2016;126(4):1152-1162.

[39] Witwer KW, Buzás EI, Bemis LT, et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2013;2: 1-25.

[40] Tauro BJ, Greening DW, Mathias RA, et al. Comparison of ultracentrifugation, density gradient separation, and immunoaffinity capture methods for isolating human colon cancer cell line LIM1863-derived exosomes. Methods. 2012;56(2):293-304.

[41] Chen TS, Arslan F, Yin Y, et al. Enabling a robust scalable manufacturing process for therapeutic exosomes through oncogenic immortalization of human ESC-derived MSCs. J Transl Med. 2011;9:47.

[42] Théry C, Amigorena S, Raposo G, et al. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 2006;Chapter 3: Unit 3.22.

[43] Fong MY, Zhou W, Liu L, et al. Breast-cancer-secreted miR-122 reprograms glucose metabolism in premetastatic niche to promote metastasis. Nat Cell Biol. 2015;17(2): 183-194.

[44] Escudier B, Dorval T, Chaput N, et al. Vaccination of metastatic melanoma patients with autologous dendritic cell (DC) derived-exosomes: results of thefirst phase I clinical trial. J Transl Med. 2005;3(1):10.

[45] Kukielka GL, Hawkins HK, Michael L, et al. Regulation of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) in ischemic and reperfused canine myocardium. J Clin Invest. 1993;92(3): 1504-1516.

[46] Rieu S, Géminard C, Rabesandratana H, et al. Exosomes released during reticulocyte maturation bind to fibronectin via integrin alpha4beta1. Eur J Biochem. 2000;267(2):583-590.

[47] Taylor DD, Zacharias W, Gercel-Taylor C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods Mol Biol. 2011;728:235-246.

引言

1987年Pan和Johnstone提出外泌体是一种由多种细胞分泌的^[1]，存在于多种体液(如尿液^[2]、血液^[3]、唾液^[4]、乳汁等^[5])中的膜性复合信息体，首先是从网织红细胞中发现，其直径多介于40-100 nm之间^[6]，在蔗糖中的密度为1.13-1.19 g/mL。外泌体是一种具有5-核酸酶活性的膜性小囊泡，表面含有丰富的生物学分子，更重要的是其包裹着源细胞内特殊的DNA片段、RNAs(如mRNAs和microRNAs)、蛋白质、多肽等活性信息分子^[7]。因而，外泌体具有源细胞的生物学特性。此外，外泌体还具有其他一些特性：①异质性，主要表现在物理性质上，因其粒径、密度、沉降系数不同于其他细胞分泌的囊泡而得以分离与鉴定；②靶向性，外泌体的分泌方式是由内吞小体出泡排出体外，此分泌方式也决定了其在细胞信息传递中的作用，目前国内外研究发现其较易与邻近细胞的细胞膜发生融合，被认为是一种介导细胞间信息传递的重要“内分泌”机制，而且其通路是特定的^[8]；③稳定性，主要依靠其表面的脂质层，可以保护其不被破坏。

近来，干细胞治疗受到越来越多研究者的关注。干细胞不同于其他细胞的特殊之处即具有强大的自我复制功能和多向分化潜能^[9-10]。研究表明，间充质干细胞可以治疗心肌梗死，随机临床试验已经证明间充质干细胞植入心肌梗死的受损区域可以使血管重塑，抑制心肌纤维化，防止心室重构，修复心脏节律细胞^[11-13]。然而，应用干细胞存在很多不可忽视的问题，如生物安全问题、长期保存与运输问题、非治疗目的分化等。

基于以上亟待解决的问题，寻找替代干细胞的治疗途径显得尤为重要。外泌体具有源细胞的生物学特性，逐渐进入人们的视线。

外泌体携带的酶以及化学物质可长期不被降解^[14]，无潜在毒性；PBS重悬后可于-80 ℃保存6个月，且生物化学活性不受影响^[15]；用于治疗疾病具有一定的安全性^[16]。外泌体在疾病的早期预防、诊断以及预后判断方面有重要贡献^[17-20]，但暂时没有较好的提取方法。目前，可用来提取外泌体的方法有离心法^[21]、过滤离心^[22]、密度梯度离心^[23]、免疫磁珠法^[24]、色谱法、试剂盒法和最近提出的旋转超滤法等^[25-26]，其中离心法是通过物质的离心力不同而将样本分离，但是微泡和外泌体不能得到更好的分离，过滤离心法是通过过滤不同相对分子质量的分子而得，虽然简单易操作，但是所得样品不纯，密度梯度离心法虽然得到的样本较纯，但耗时久，操作复杂，不利于大规模生产，免疫磁珠法利用外泌体表面抗体的特异性，但是其对生物活性的影响未知，尚不能满足进一步实验的要求，色谱法虽然有很多优点但是对设备要求较高，尚不能普及。Exo Quick试剂盒是通过一种螯合物对外泌体捕捉的原理提取外泌体，Total Exosome Isolation试剂盒是通过将水分子聚合到一起，强行减少可溶性成分，使其从溶液中析出，之后经过低速离心即可收集外泌体。虽然方法众多，却并没有统一的标准。基于此，实验采用3种方法提取人脐带间充质干细胞中的外泌体，筛选最佳提取外泌体的方法，为后续研究提供实验证据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 人脐带间充质干细胞及其来源外泌体的形态学观察及蛋白测定。

1.2 时间及地点 2015年6月至2017年6月在山西医科大学生命科学研发中心完成。

1.3 材料 人脐带源自于无疾病的新生儿，采集过程中保证无菌，产前行传染性疾病检查均为阴性。采集标本之前已获得产妇与家属的知情同意，均由山西医科大学附属第二医院提供。

试剂与仪器：Total Exosome Isolation(Cell Culture Media)试剂盒(Invitrogen公司)；Exo Quick-TC试剂盒(System Biosciences公司)；HF100 Heal Force 三气培养箱(上海力申科学仪器有限公司)；FACS Calibur流式细胞仪(BD Biosciences公司)；TGL-16R型低温高速离心机(珠海黑马医学仪器有限公司)；CP100WX超速离心机及P70AT定角转子(日立公司)；透射电子显微镜(Philips公司)；BIO-RAD GELDOC XR凝胶成像仪(BIO-RAD公司)；WFJ7200型可见分光光度计(尤尼柯仪器有限公司)；α-MEM液体培养基、胎牛血清(Gibco公司)；青链霉素、牛血清白蛋白(Solarbio公司)；鼠抗人CD29-PE、CD34-PE、CD44-PE、CD45-PC5、CD105-PE及鼠抗人同型对照IgG-PC5、IgG-PE(Beckman Coulter公司)；抗CD81、CD63、CD9、β-Actin(R&D公司)；Goat anti-rabbit IgG-HRP、Goat anti-mouse IgG-HRP(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 人脐带间充质干细胞的培养^[27] 于超净工作台上取出脐带标本置于一次性无菌培养皿中，PBS充分洗涤，用组织剪将脐带剪为长约1 cm的小段，剔除动静脉血管，将华尔通胶剪至1 mm³大小，接种于T-25 cm²培养瓶中，加入完全培养基6 mL，于37 ℃、体积分数为5%CO₂细胞培养箱中培养。当细胞达到70%-80%融合时，传代培养，培养至第4代时，对其进行鉴定。

1.4.2 人脐带间充质干细胞表面标志物的鉴定 第4代脐带间充质干细胞融合达90%且生长状态良好时，用胰蛋白酶进行消化，细胞变圆后加入胎牛血清终止消化，反复吹打为单细胞悬液，2 000 r/min离心5 min，弃上清液，加10 mL PBS重悬，于测定管中依次加入20 μL CD29-PE、CD34-PE、CD44-PE、CD45-PC5、CD105-PE抗体荧光染料，同型对照管中加入等量IgG-PC5、IgG-PE荧光染料，于4 ℃避光孵育20 min，PBS清洗2次并重悬，终体积为500 μL，上流式细胞仪检测。

1.4.3 人脐带间充质干细胞多向分化能力鉴定

人脐带间充质干细胞成骨诱导^[28]：将生长状态良好的第4代脐带间充质干细胞用胰酶消化，制成单细胞悬液，按2×10⁴/cm²的细胞密度接种于6孔板上，每孔加入2 mL完全培养基进行培养。当细胞长至60%-70%时，吸弃完全培养基，加入2 mL人脐带间质干细胞成骨诱导分化完全培养基，每3 d换液1次，诱导2-4周(据细胞生长情况而定)后，吸弃培养基，用PBS清洗，细胞经40 g/L多聚甲醛溶液固定30 min，茜素红染色10 min，显微镜下观察胞内的钙结节形成情况。

人脐带间充质干细胞成脂诱导^[28]：将生长状态良好的第4代脐带间充质干细胞用胰酶消化，制成单细胞悬液，按2×10⁴/cm²的细胞密度接种于6孔板上，每孔加入2 mL完全培养基进行培养。当细胞长至100%融合时，吸弃完全培养基，加入2 mL OriCell^TM人脐带间质干细胞成脂诱导分化培养基A液，培养3 d后，弃A液，加入2 mL成脂诱导分化培养基B液，4 h后重换A液，如此交替换液4次，最后用B液维持培养5 d后，吸弃培养基，用PBS清洗，细胞经40 g/L多聚甲醛溶液固定30 min，油红O染色，显微镜下观察成脂效果。

1.4.4 人脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备 选择生长状态良好的第4代脐带间充质干细胞60瓶(T-75 cm²)，用含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基培养，待细胞融合至70%-80%时换无血清培养基培养，48-72 h后收集条件培养基共600 mL，随后所得上清液经过0.22 μm 一次性滤器，收集上清。将条件培养基平均分成3份，每份200 mL，分别用Exo Quick Pre-cipitation试剂盒法、Total Exosome Isolation试剂盒法、传统差速超速离心法提取外泌体。

差速超速离心提取法(Ⅰ法)^[29]：第1份条件培养基以300×g离心10 min去除完整细胞；再经2 000×g离心20 min进一步去除死细胞和杂质；再经10 000×g离心30 min去除细胞碎片；最后以100 000×g离心70 min，弃上清，将沉淀用50 μL PBS重悬后，保存至-80 ℃，该方法得到的外泌体标记为Ⅰ号。

Exo Quick试剂盒提取方法(Ⅱ法)：第2份条件培养基以3 000 r/min离心20 min以去除漂浮的死细胞；随后经10 000×g离心30 min，严格按照说明书，按5∶1加入沉淀剂，混合均匀后，4 ℃过夜；最后以1 500×g离心5 min，弃上清，将沉淀用50 μL PBS重悬后，保存至-80 ℃，该方法得到的外泌体标记为Ⅱ号。

Total Exosome Isolation试剂盒法(Ⅲ法)：第3份条件培养基以2 000×g离心30 min，转移无细胞的上层清液到一个新的离心管中加入样本量1/2的试剂，混匀，4 ℃过夜，以10 000×g离心1 h，弃上清，将沉淀用50 μL PBS重悬后，保存至-80 ℃，该方法得到的外泌体标记为Ⅲ号。

1.4.5 透射电镜下观察外泌体形态 取不同方法提取的外泌体悬液，置于载样铜网表面，置温静置30 min，滴加磷钨酸溶液(pH 6.8)于室温下复染7 min，静待其晾干，透射电镜下观察并选取角度拍照。

1.4.6 BCA法测定蛋白质浓度 将牛血清白蛋白(2 g/L)梯度稀释成0.125，0.25，0.5，1.0，2.0 g/L，制作标准曲线；将待测蛋白样本进行稀释，使其浓度处于标准曲线范围内；将试剂盒中的Solution A和Solution B按体积为50︰1混合，配制BCA工作液；分别将2 μL各稀释浓度的牛血清白蛋白标准溶液和待测样本依次加入至96孔板中；按照蛋白质溶液与工作液比例为1︰20，加入40 μL BCA工作液。每个样品设置3个复孔；将加好液体的孔板恒温孵育0.5 h，待其冷却达室温水平；选择波长为562 nm处测吸光度值，空白对照为不含BSA的样本；根据吸光度值绘制标准曲线，计算样本中的蛋白浓度。

1.4.7 SDS-PAGE分离蛋白及凝胶图像分析 取10 μL外泌体悬液，加入10 μL 2×上样缓冲液，置于EP管中，混合均匀，离心，煮沸5-10 min，上样20 μL，marker上样5 μL；设置4%浓缩胶80 V，40 min；12%分离胶100 V，100 min；待蓝色跑到胶底部时停止，考马斯亮蓝染液染色30 min-1 h，冲洗，摇床脱色2 h后，使用Biorad图像扫描仪拍照。

1.4.8 Western blot检测 如前所述进行SDS-PAGE电泳，将蛋白质电转印至PVDF膜(230 mA，150 min)，然后将PVDF膜置于0.5%脱脂奶粉封闭60 min，加入一抗(β-actin和CD9按照1∶1 000稀释，CD63和CD81按照 1∶1 500稀释)，于4 ℃孵育12 h，TBS洗膜，加入二抗室温孵育45 min，洗膜，用ECL化学发光试剂盒显色，利用 ImageQuant LAS4000 mini超灵敏化学发光成像仪观察结果。

1.5 主要观察指标 ①流式细胞仪检测人脐带间充质干细胞表面标记物，成脂成骨诱导结果；②透射电镜观察外泌体形态；③BCA法对外泌体进行蛋白质定量，SDS-PAGE半定量分析蛋白表达差异；④Western blot检测外泌体表面标志物CD9、CD81、CD63的表达。

1.6 统计学分析 结果数据采用x(_)±s表示，应用SPSS 16.0统计学软件进行单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

人脐带间充质干细胞具有来源广泛、免疫原性低等优点，展现出较好的应用前景。临床研究表明，在急性心肌梗死^[30-31]、急性肾损伤^[32]、肝纤维化等疾病中^[33]，间充质干细胞来源的外泌体均显示出较好的治疗效果，但其发挥治疗作用的机制尚不清晰。外泌体的纯度和浓度在其发挥治疗作用中尤为重要^[34]，然而应用目前所报道的外泌体的提取方法，在分离外泌体的过程中必然受到高丰度蛋白的影响，高丰度蛋白会掩盖很多小分子蛋白^[35]，进而干扰实验结果。因此，需要寻找一种尽可能得到高质量的外泌体，同时还具有操作简便、成本低等因素的方法。

目前，密度梯度离心法提取外泌体被认为是相对经典的方法^[36]，但其操作繁杂，耗时长，不便于临床应用，有研究表明，将外泌体悬浮于30%蔗糖/重水垫中进行纯化，然而密度梯度离心法属于等密度离心范围，没有密度梯度差^[37]，因而容易混有其他密度的杂质，同时，重水对人体是否有影响尚不能评定；有机溶剂法是相对较原始的方法^[38]，虽然操作比较简单、成本较低，但是专一性不高，不仅能沉淀高丰度的蛋白质，也会连同部分低丰度的蛋白质一起沉淀；免疫亲和层析法的特异性强、效率高，但是操作过程比较复杂；免疫磁珠法与液相色谱分离法成本较高^[39-40]，不能普及；差速超速离心法的原理是样本中各物质沉降所需离心力的不同；Exo Quick试剂盒法的原理依据各物质的直径不同；Total Exosome Isolation试剂盒法的原理是可溶性及离心力的不同。

实验对人脐带间充质干细胞进行体外原代培养，然后通过Exo Quick试剂盒法、差速超速离心法和Total Exosome Isolation试剂盒法分别成功提取了间充质干细胞来源的外泌体，且边界清晰，形态符合国际公认水平^[41-42]，为了避免胎牛血清中的蛋白对实验结果有影响，而且无法知道胎牛血清中的蛋白量，所以在使用培养基提取外泌体之前需要用PBS冲洗2次，换上无血清培养基培养48-72 h。特殊之处在于之后的上清液需要经过220 nm的“奶嘴型”滤网过滤，除去大于0.22 μm的杂质(包括非所需的蛋白)。差速超速离心法用不同强度的离心力使不同质量级的物质分离，但与此同时也伴随着一些沉降系数相差不大的组分无法得到完全的分离，纯度达不到理论值，同时在实际离心过程中在收取沉淀时可能污染导致提取样本不纯，但是可以人为避免，一部分文章报道认为将外泌体离心到管底部需要70 000×g的离心力^[43]，为了使浓度更高一些，破坏一些耐受不了高离心力的杂质，课题组采用100 000×g来离心^[44]，并且离心持续了更长时间^[45-46]，使大部分的非外泌体的细胞外囊泡得以去除，如高尔基体、内质网、很小的质膜碎片等，本方法适用于大量提取外泌体，并且得到的外泌体形态均匀、纯度较高，基本可以达到后续实验的要求；从理论上讲，试剂盒法提取的外泌体纯度较高^[47]，同时具有操作简单、用时较短的优点，所以成为近来研究的热点，实验采用的Exo Quick试剂盒法应用多聚体的网状结构将一定直径的微泡捕获出来。Total Exosome Isolation试剂盒法是通过强行析出所需物，从理论上来讲差速超速离心法没有试剂盒法所得样本纯，但是试剂盒中的成分并不明确，在进行疾病治疗时，无法保证其安全性，尤其是Total Exosome Isolation试剂盒法所得样本中有大量直径过小的物质无法解释，可能存在潜在的蛋白污染，无法为后续实验所用。

总之，尽管差速超速离心法耗时稍长，但是不存在未知的潜在杂质污染，并且纯度相对较高，成本也比较低，可以大量地提取，满足实验的基本需求，利于后续的实验研究。在实际应用中，重复性高，可作为一种合理的分离方法。

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外泌体是一种通过细胞胞吐作用分泌的膜性囊泡样小体，直径通常为30-100nm，其内包被着多种蛋白质、小分子RNA及DNA碎片等活性物质[1]。研究表明，干细胞源外泌体对心血管疾病有一定疗效，能够有效减小心梗区域面积，改善心脏功能。研究涉及间充质干细胞源性外泌体、心肌干细胞源性外泌体以及胚胎干细胞源性外泌体等[2-3]，均得到了良性结果。目前，对于外泌体治疗心肌梗死的机制，人们普遍认为与其包含的miRNA有关，并在具体研究中取得了一定进展[4-8]。

外泌体的提取至关重要，目前除了传统的超速、过滤、密度梯度离心法以外，还出现了一些沉降试剂盒。胡国文等[9]在传统离心法基础上开发出了旋转超滤法，较传统离心法更为便捷高效，但仍有进一步纯化的空间；刘高米杨等[10]对超速离心法和101bio试剂盒沉淀法进行了对比，发现超速离心法的纯度较高，但产量较低；王鑫伟等[11]对差速超速离心法和Total Exosome Isolation试剂盒法的结果进行了形态学比较，同时尝试了二者共同作用，结果发现经差速超速离心法提取的外泌体形态更优；晏芾等[12]发现相比超速离心法， ExoQuick-TC提取法和Ribo提取法速度更快、效率更高、浓度也较高，更适合研究应用；孙祯等[13]则认为，相比差速离心法和Exo-Quick Precipitation提取法，超滤密度梯度离心法具有效果好和成本低的优势；王仁峰等[14]对Exo Quick试剂盒法进行了改良，并证实其能够更有效地去除杂蛋白。本实验选取了差速超速离心法与Exo Quick试剂盒法和Total Exosome Isolation试剂盒法进行对比，对已有文献记载的相关研究进行了补充，同时由于本实验室长期进行外泌体相关研究，熟练掌握传统离心法，其结果可信，重复性高。实验结论能够为未来外泌体研究中实验材料制备方法的选择提供有力佐证，从而使得外泌体治疗心血管等疾病的研究得到更加充分、真实的证据，减少争议，以推动外泌体相关研究的进一步发展。

[1] Ratajczak J, Wysoczynski M, Hayek F, et al. Membrane-derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication. Leukemia. 2006;20(9):1487-1495.

[2] Arslan F, Lai RC, Smeets MB, et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes increase ATP levels, decrease oxidative stress and activate PI3K/Akt pathway to enhance myocardial viability and prevent adverse remodeling after myocardial ischemia/reperfusion injury. Stem Cell Res. 2013;10(3):301-312.

[3] Chen L, Wang Y, Pan Y, et al. Cardiac progenitor-derived exosomes protect ischemic myocardium from acute ischemia/reperfusion injury. Biochem Biophys Res Commun. 2013;431(3):566-571.

[4] Feng Y, Huang W, Wani M, et al. Ischemic preconditioning potentiates the protective effect of stem cells through secretion of exosomes by targeting Mecp2 via miR-22. PLoS One. 2014;9(2):e88685.

[5] Yu B, Gong M, Wang Y, et al. Cardiomyocyte protection by GATA-4 gene engineered mesenchymal stem cells is partially mediated by translocation of miR-221 in microvesicles. PLoS One. 2013;8(8):e73304.

[6] Sahoo S, Klychko E, Thorne T, et al. Exosomes from human CD34(+) stem cells mediate their proangiogenic paracrine activity. Circ Res. 2011;109(7):724-728.

[7] Barile L, Lionetti V, Cervio E, et al. Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction. Cardiovasc Res. 2014;103(4):530-541.

[8] Chen L, Wang Y, Pan Y, et al. Cardiac progenitor-derived exosomes protect ischemic myocardium from acute ischemia/reperfusion injury. Biochem Biophys Res Commun. 2013;431(3):566-571.

[9] 胡国文,李青,牛鑫,等. 旋转超滤:一种提取细胞外泌体的新方法[J]. 第二军医大学学报, 2014, 35(6):598-602.

[10] 刘高米洋,潘兴华,和法莲,等. 两种人脐带间充质干细胞源外泌体分离方法的比较[J]. 中华细胞与干细胞杂志:电子版, 2017, 7(2):81-86.

[11] 王鑫伟,毛建文. 试剂盒法与差速超速离心法所提血清外泌体的形态学比较[J]. 临床与病理杂志, 2016, 36(11):1837-1841.

[12] 晏芾,于韶荣,曹海霞,等. 非小细胞肺癌源性外泌体提取方法探讨[J]. 南京医科大学学报(自然科学版), 2016,36(6):726-729.

[13] 孙祯,黄赤兵,宋亚军,等. 大鼠T细胞源性exosome提取方法比较[J].重庆医学,2013,42(29):3512-3514.

[14] 王仁峰,耿振,李朝阳,等. ExoQuick 提取人血清外泌体方法改良及比较[J]. 实用医学杂志, 2015, 31(15):2458-2462.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

人脐带间充质干细胞来源外泌体提取方法的比较

Comparison of exosome extracting methods from human umbilical cord mesenchymal stem cells

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[1]	宋慧芳, 谈佳音, 康毅, 李斌, 毕志斐, 龙女, 夏仲年, 郭蕊. 低氧预处理增强老年人骨髓间充质干细胞条件培养基对H9C2细胞氧化应激损伤的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 1-6.
[2]	郭秋霞, 王吉刚. 淋巴瘤患者外周血造血干细胞动员采集过程中相关因素对首次采集结果的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 7-11.
[3]	梅运运, 张建军, 王东. 高压氧联合NgR基因沉默骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 12-19.
[4]	谢兴奇, 胡伟, 屠冠军. 骨髓间充质干细胞来源外泌体与硫酸软骨素酶ABC联合治疗大鼠脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 20-26.
[5]	张学磊, 罗干, 于圣会, 顾祖超, 彭旭, 何学令, 刘艳, 张晓梅. 脱细胞神经联合骨髓间充质干细胞及富血小板凝胶治疗股神经损伤[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 27-32.
[6]	赵来赫, 夏冰, 马腾, 高楗勃, 李胜友, 高雪, 郑毅, 胡广文, 罗卓荆, 黄景辉. 骨髓间充质干细胞诱导为类许旺细胞的细胞外基质促进周围神经损伤后轴突再生[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 33-39.
[7]	麦丽萍, 何国东, 陈少贤, 朱杰宁, 侯兴华, 张梦珍, 李晓红. 乙醛脱氢酶3B1在人骨髓间充质干细胞自然衰老过程中的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 40-44.
[8]	杨腾云, 李彦林, 刘德健, 王国梁, 郑竹君. 转化生长因子β3诱导外周血源性间充质干细胞成软骨分化的量效关系[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 45-51.
[9]	孟德峰, 李长仔, 吴春涛. LINC02532靶向miR-145影响胰腺癌干细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 52-58.
[10]	黄涛, 程志坚, 贾志强, 赵晓光, 王磊, 翟文静, 周永新. miR-146a调控脂肪间充质干细胞成骨分化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 70-75.
[11]	刘璐, 杨宇明, 商艾晨, 刘翠, 孙策, 王静. CD44⁺膀胱癌干细胞中角蛋白6B的表达和调控[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 76-83.
[12]	孙孟军, 郭建美, 周更苏, 董泽飞, 郑春贵, 曹翠丽. DNA拓扑异构酶Ⅱ在ICR小鼠神经干细胞中的表达及意义[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 84-89.
[13]	敬劲, 赵珊笛, 陈龙, 彭双麟, 唐辉, 郭代金, 曾馨仪, 肖金刚. 骨质疏松症小鼠脂肪干细胞结合双相磷酸钙陶瓷修复骨质疏松症小鼠颅骨缺损#br#[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 90-95.
[14]	胥雪玲, 刘军, 杨爱华, 王惠芳, 郭丹丹, 刘雪梅, 徐岩. 高糖诱导人肾小管上皮细胞高表达干细胞因子[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 96-100.
[15]	崔帅帅, 杨晓红. miRNA在骨髓间充质干细胞自我更新、多向分化及命运和功能调控中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 101-106.