2.1 干细胞培养及鉴定   2.1.1 股骨头坏死涉及细胞水平的发病机制 股骨头坏死的发病机制一直以来是学术界争论的焦点，过去的二三十年里，不断着有着新的学说提出，目前被广泛接受的有骨内高压学说、血管内脂肪栓塞学说、血管外骨髓脂肪细胞堆积挤压学说等[1]。但是不管具体机制如何，众多研究表明，在股骨头发生缺血坏死后，均可见骨髓内间充质干细胞的数量减少或是活性受到抑制。Lee等[2]发现酒精依赖股骨头坏死患者的骨髓间充质干细胞成骨分化能力较一般骨性关节炎患者显著降低。这种现象也同样被Suh等[3]发现，他们的研究表明骨髓间充质干细胞成骨作用的下调可能会导致股骨头坏死的发生。 随着近年来广大医学工作者对股骨头坏死发病机制的研究，以及再生医学和干细胞研究的发展，越来越多的人相信股骨头坏死的发病有着细胞水平的起源，这为干细胞治疗股骨头坏死提供了坚实的理论依据。 2.1.2 骨髓间充质干细胞的特性 骨髓间充质干细胞是存在于骨髓中的间充质干细胞，取材方便，分离较容易，其最主要的两大特性：一是有着自我更新的潜能，即大量传代后仍可保持生物学特性，研究显示骨髓间充质干细胞传代38次仍可保持定向分化潜能，染色体核型和端粒酶活性并不随着多代培养而有所改变[4]；二是具有定向或多向分化的潜能，可分化为骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞等[5]。实验证明骨髓间充质干细胞形成的骨结节在坚韧度和结构方面都比胚胎干细胞所形成的更接近原生骨结节[6]。最新研究表明，骨髓间充质干细胞还对淋巴细胞、树突细胞及其他促炎症细胞有着抗炎和免疫调节功能[7]，研究显示骨髓间充质干细胞可抑制T细胞、B细胞、自然杀伤细胞及树突细胞的增殖[8]，这使得它们在移植过程中没有免疫排斥反应的风险[9]，这些特性都决定了它可以成为骨与关节修复的理想的种子细胞。 2.2 骨髓间充质干细胞常用的载体及支架材料  早期骨髓间充质干细胞用于治疗股骨头坏死的最常用的方法是髓芯减压联合干细胞移植。然而，髓芯减压会人为地在股骨头内形成隧道，使软骨下骨的支撑力减弱，股骨头塌陷的概率增高，因此髓芯减压后的植骨支撑非常必要。为了解决这一问题，学者们通过自体髂骨植骨、脱钙骨基质等方法取得了一定的效果，而随着组织工程学的发展，作为3要素之一的支架材料及各种材料的复合物作为干细胞的载体越来越多的被研究与应用。 理想的载体和支架材料需满足以下要求：①与缺损区周围组织匹配良好，并有良好的生物学强度以提供稳定的机械支撑。②其生物降解率与周围组织生长率相匹配，保持动态平衡，其降解产物对周围组织及机体无害。③具有良好的组织相容性，有利于细胞的黏附及分化。④适宜的孔隙大小及孔隙率，以保证种子细胞的营养及代谢道路通畅。⑤易于消毒，避免病原体的传播。 2.2.1 自体松质骨 严格意义上来说，自体松质骨的移植主要发挥的是其局部支撑作用，而非组织工程学的范畴。但是自体骨移植因具有愈合快、无排斥反应等优点，国内外均有自体骨合并干细胞移植治疗股骨头坏死的临床应用，且均具有较好的疗效。由于自体松质骨的孔隙最接近正常骨组织，且生物相容性最佳，干细胞可以黏附在松质内，减少移植过程中干细胞的流失。Wang等[10]采用髓芯减压+自体松质骨及骨髓干细胞联合移植的方法治疗20例股骨头坏死，取得了较好的临床疗效(优7例，良8例，可4例，差1例)。然而，自体骨有着增加手术创伤、增加并发症发生率等缺点，且自体骨的材料来源有限，随着骨与软骨组织工程学的发展，将逐渐被其他新兴材料所取代。有研究观察在髓芯减压基础上行自体松质骨带骨髓植入的方法治疗早期股骨头坏死的临床疗效。试验采用髓芯减压并自体松质骨带髓植入治疗14例(15髋)早期股骨头坏死患者，其年龄均在23-50岁之间，均为Ficat分期Ⅰ、Ⅱ期。术前患者的目测类比评分(visual analogue scale,VAS)平均分为(5±0.62)分，髋关节Harris评分为(50.8±6.5)分，MRI所示的低信号区占股骨头体积的(32.6±6.4)%，术后对症治疗，定期拍片复查。结果显示本组全部获得随访，随访12个月时髋关节Harris评分明显优于术前，上升为(92.2±6.4)分，患者髋部疼痛明显改善，关节活动度较术前增大；MRI显示未发生股骨头表面塌陷，股骨头坏死区域明显较术前缩小(P < 0.05)。说明髓芯减压并自体松质骨带髓植入术治疗早期股骨头坏死稳定率好，可显著缓解疼痛，改善髋关节活动功能，延缓该病的继续发展，具有肯定的临床疗效。 2.2.2 异体骨 异体骨包括同种异体骨及异种异体骨，异体骨在形态、结构成分及生物力学强度上与自体骨相似，一般经过脱钙、脱细胞、脱蛋白等不同方法降低抗原性，拥有良好的组织相容性。早在2005年，李亚非   等[11] 利用组织工程化异体骨联合骨髓细胞治疗64例(共78髋)股骨头坏死，结果表明其可提供良好的机械支撑作用，其三维多孔结构使骨髓细胞容易贴附、增殖，有利于营养成分渗透，取得了较好的临床效果。 常用的异体骨以脱钙骨基质为代表，其特点是携带骨髓基质细胞，临床及实验方面均证实其具有良好的骨诱导活性，其类似自体骨的多孔三维结构有利于细胞的增殖和分化。国内章建华等[12]通过临床研究得出，髓芯减压加自体多能干细胞、脱钙骨基质植入是一种能有效阻止股骨头塌陷，延缓全髋关节置换时间的治疗方法。 有研究探讨同种异体骨打压植骨治疗股骨头缺血性坏死的效果，试验选择17例股骨头缺血性坏死患者，平均年龄34岁，男11例13髋，女6例7髋；左侧5例，右侧9例，双侧3例。按照国际骨循环研究学会(ARCO)分期，Ⅰ期5例6髋、Ⅱ期12例14髋。同种异体骨取自25-40岁健康人群，异体骨经过深低温冷冻处理，手术采用经股骨颈通道去除坏死组织并打压植入同种异体骨碎块。术前及术后随访行X射线平片及MRI检查，采用Harris评分对髋关节功能进行评价，随访6个月至2年，采用SPSS17.0统计学软件进行数据分析。结果显示术后1例2髋患者疼痛无明显缓解，其余患者的髋关节疼痛获得缓解；术前Harris评分为(74.0±6.2)分，末次随访的Harris评分平均为(89.4±7.6)分，随访结果优11髋，良5髋，优良率为89.4%。术后X射线片显示，减压植骨的通道内成骨现象日渐明显，3-6个月现新生骨柱影；1例双髋患者出现股骨头塌陷，行全髋置换；1例出现排异反应，说明同种异体骨打压植骨移植适于治疗无塌陷的早期股骨头坏死，远期效果尚需进一步观察和研究。 异体骨作为干细胞载体有一定的临床应用潜力，但是其效果受到制作工艺的影响较大，且缺乏一定的生产规范，另外其传染疾病的潜在危险及一定的抗原性制约了其使用及发展。 2.2.3 天然生物材料 天然生物材料作为支架材料在骨与软骨组织工程中被广泛应用，其种类繁多，应用广泛，天然材料具有无毒、组织相容性好、降解产物易完全吸收等优势，而其中用于骨髓间充质干细胞载体治疗股骨头坏死研究的以珊瑚及胶原两者为代表。 珊瑚是一种海生无脊椎动物的骨骼，海珊瑚的主要成分为碳酸钙，与骨的无机成分相同，其微孔结构满足干细胞对孔隙率的要求，可以促进干细胞的增殖及分化并提供营养。然而易降解的缺点使其无法被单独应用在预防股骨头塌陷的领域，往往与胶原等材料以复合物的形式应用。胶原作为骨与软骨的天然成分，其具有免疫原性低、相容性好的优势，其特有的纤维结构利于细胞的黏附生长与增殖，然而其力学性能较差。Jäger等[13]利用Ⅰ型胶原凝胶海绵作为骨髓间充质干细胞载体的研究结果表明Ⅰ型胶原凝胶可以促进干细胞的黏附及生长，并保证其分化潜能不受破坏。结合以上两者的优缺点，徐晓良等[14]使用骨形成发生蛋白/胶原/珊瑚复合人工骨用于股骨头坏死的实验研究，证明其有较强的传导成骨及诱导成骨作用，是修复股骨头骨缺损的良好移植材料。然而其难降解等缺点限制了使用。 天然生物材料虽然拥有众多优点，然而其使用有着较多局限性，如生物强度低、降解速率难控制、力学及加工性能较差等，现如今逐渐被众多新型人工材料取代。 2.2.4 人工合成材料 随着化学工业及加工工业的发展，人们可以结合人体的物质结构及代谢产物，利用合成的方法制作出仿生的一系列人工合成材料，并且可采取一定的措施使其利于细胞的黏附、分化，由于其具有物理机械性能较好、形状可人工控制、降解时间可调控等优点而被广泛关注。 有机材料类：有机材料以聚乳酸、聚乙醇酸等为代表，聚乳酸有3种异构体：右旋聚乳酸、聚左旋乳酸、消旋聚乳酸。聚左旋乳酸具有良好的可吸收性及组织相容性，实验证实骨髓间充质干细胞复合聚乳酸聚乙醇酸聚合物是良好的移植替代物[15]。例如有研究通过动物实验观察组织工程化骨在股骨头坏死治疗中的效果，为临床治疗股骨头坏死提供一种疗效确切的新技术。实验将成年新西兰大白兔随机编号，按手术方法不同随机分为3组，每组18只，空白对照组股骨头缺损内不做任何处理，自体骨移植组于髂骨取自体松质骨，修剪成骨粒后打压植入到股骨头缺损内，组织工程骨组于股骨头缺损内植入纳米羟基磷灰石/聚乳酸为支架的组织工程骨，并做好标记。手术后每日给予青霉素20万U/kg，肌肉注射1周。术后10 d切口拆线，术后动物分笼饲养，各组均于术后4，8，12周处死动物，每次各6只，取整个骨备用。行肉眼、X射线检查和显微镜下形态学观察、组织学观察。结果显示应用兔骨髓间充质干细胞与纳米羟基磷灰石/聚乳酸构建的组织工程骨在植入兔股骨头坏死骨缺损模型后12周，完成了成骨并修复了股骨头坏死骨缺损。术后12周大体肉眼观察显示，组织工程骨的周围被纤维组织紧密包裹，分离困难，新生血管明显增多，组织工程骨的表面平整、光滑，组织工程骨的质地与皮质骨相接近；自体骨移植组自体骨移植周围的纤维组织被紧密包裹，新生血管较多，移植处自体骨表面质地变硬；空白对照组股骨头坏死骨缺损处的纤维组织增生明显，骨缺损处并无修复，两端仅有少量骨质形成并硬化塌陷变形。骨密度X射线观察显示，组织工程骨组移植区X射线阻射进一步增强，移植区密度略低于周围组织；自体骨移植组移植区X射线有明显阻射，移植区与宿主骨密度相当；空白对照组组无X射线阻射，股骨头坏死骨缺损处少量骨质形成并塌陷变形。术后12周组织学观察结果显示，组织工程骨组编织骨形成，新生血管也明显增多；自体骨移植组形成编织骨，大量血管生成。因此，兔骨髓间充质干细胞与纳米羟基磷灰石/聚乳酸构建的组织工程骨修复股骨头坏死骨缺损的能力与自体骨移植类似，具有良好的骨修复作用。实验也说明纳米羟基磷灰石/聚乳酸材料有良好的组织相容性。然而，此类有机材料的致命弱点是其机械强度与可塑性较差，无法单独应用于承重部位的骨缺损，因此，较多的复合材料被广泛研究与应用，但其在股骨头坏死治疗领域应用较少，逐渐被生物陶瓷类等机械强度较高的材料所取代。 生物陶瓷类：生物陶瓷类人工材料以碳酸钙、磷酸钙、硫酸钙及他们各自的衍生物为代表，目前被广泛应用于骨替代材料，具有较好的骨传导能力及骨诱导活性。而在骨髓干细胞治疗股骨头坏死领域，应用最多的载体就是磷酸钙及其衍生物。 磷酸三钙是最常用的一种磷酸钙衍生物，医学上通常使用的是磷酸三钙的一种特殊形态—β-磷酸三钙，其成分与骨基质的无机成分相似，与骨结合好。动物或人体细胞可以在β-磷酸三钙材料上正常生长，分化和繁殖。刘勇等[16]评价了一种新型多孔β-磷酸三钙材料的理化性质及其与骨髓间充质干细胞复合后的骨诱导效果，证实该材料具有良好的细胞黏附与促增殖作用，与骨髓间充质干细胞复合后可修复骨缺损，且体内降解速率与骨形成速率一致。在此基础上，赵振德[17]利用β-磷酸三钙作为骨髓间充质干细胞的载体，对其在股骨头坏死方面的治疗作用做出了实验性评价，结果证明β-磷酸三钙复合骨髓间充质干细胞在股骨头缺损修复中的作用。孙伟等[18] 通过观察磷酸三钙多孔生物陶瓷与兔骨髓间充质干细胞复合培养体内成骨的超微结构，了解其在股骨头缺损修复中的成骨效应，验证磷酸三钙多孔生物陶瓷作为组织工程载体材料的可行性。实验将新西兰大白兔30只，随机分为3组，制作股骨头坏死缺损模型后，空白对照不作填充，磷酸三钙组填充磷酸三钙多孔生物陶瓷，磷酸三钙+骨髓间充质干细胞组填充磷酸三钙多孔生物陶瓷和骨髓间充质干细胞的复合物。回植体内6，12周后取材，结果显示磷酸三钙多孔生物陶瓷与骨髓间充质干细胞复合培养良好。空白对照组缺损区6，12周均见纤维组织结构，无骨小梁结构；磷酸三钙组6周材料和骨基质交界不清，材料开始降解，12周材料与周围组织边界模糊，材料部分降解，多孔框架结构不清；磷酸三钙+骨髓间充质干细胞组6周新生骨从宿主骨长出，12周可见成熟骨组织的连续平行纤维结构网络，材料降解，表面有较多的成骨细胞。后2组在股骨头缺损修复成骨方面优于空白对照组，磷酸三钙+骨髓间充质干细胞组成骨更佳。结果表明该材料可使骨髓间充质干细胞黏附、增殖及分化，可用于股骨头坏死修复。 目前有一种比较新的材料磷酸钙骨水泥，具有更好的可降解性、成骨性及细胞相容性，且可注射并具有缓释功能，越来越多地被组织工程领域所采用。实验证明磷酸钙骨水泥的三维多孔结构具有良好的细胞黏附与增殖作用，可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，是优良的骨组织工程学的支架材料[19]。基于磷酸钙骨水泥的优良特性，Ng等[20]提出可将磷酸钙骨水泥应用于股骨头坏死治疗的设想。然而，国内外少有磷酸钙骨水泥联合骨髓间充质干细胞治疗股骨头坏死的报道，那是因为作为一种可注射支架材料，生物力学强度的不足一直以来是限制其在骨与软骨修复领域使用的原因。然而，赵亮等[21]构建了一种新型可注射强化型磷酸钙骨水泥复合物/脐带间充质干细胞凝胶组织工程骨，其研究证实此种磷酸钙骨水泥材料的抗弯曲强度及弹性模量均已达到或超过其他可注射骨生物替代材料，而其内的间充质干细胞具有良好的成骨分化能力，这为治疗股骨头坏死提供了一种新的思路与方法。 纳米级材料：随着生物与医药技术的迅速发展，纳米级材料在生物医学领域的交叉应用也突飞猛进，将生物陶瓷类或天然材料制备成纳米级材料，其理化性质将会有质的改变，从而更好地为组织工程学服务。早有科学家已成功研制出模拟骨骼结构的纳米物质，其主要成分为与聚乙烯混合压缩后的羟基磷灰石网，有较好的靶性及一定程度的延展性，物理特性符合理想的骨骼替代   物[22]。 上述的一些支架材料都是在微米结构上模仿骨组织的结构及活性，由于骨组织本身是一种纳米复合结构，那么纳米级支架材料理论上可以更好地诱导和促进细胞的成骨作用[4]。基于纳米材料独特的组织结构、大小及形状，它们可以更好地与骨细胞及组织产生作用[23]。Zandi等[24]评价了纳米羟基磷灰石作为骨髓间充质干细胞支架材料的骨与软骨修复能力，结果表明纳米羟基磷灰石具有较好的生物相容性、较高的生物活性及足够的机械支撑力量。在国内，孙伟等[25] 利用纳米晶胶原基骨联合骨髓间充质干细胞修复兔股骨头坏死，实验中影像学和组织学研究显示，纳米晶胶原基骨具有较强的传导成骨作用， 适合骨髓间充质干细胞细胞黏附、生长、增殖和分化，有较强的组织相容性和适当的可降解性，能在降解过程中逐渐被新骨替代，在股骨头缺损修复中具有较大价值。穆晓红等[26]的类似研究同样证实了纳米材料的应用价值。然而，纳米材料作为干细胞移植载体，其细胞毒性、生物相容性及生物降解能力依然需要更多的临床及实验研究来深入探索，这些比其临床应用更加重要。"