Platelet gel preparation methods and relevant parameters

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.08.020

Abstract

Abstract:

BACKGROUND: The preparation methods of platelet gel are various, but there is no uniform standard.
OBJECTIVE: To conclude the methods of platelet gel preparation and to explore the relevant parameters.
METHODS: The first author searched the PubMed and Wanfang databases for relevant articles published from 1990 to 2011 using the keywords of “platelet gel, classification, parameters” in English and Chinese, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: There are two main parameters to classify the different preparation methods, which are the yield and composition of gel and the fibrin network of gel. According to the two main parameters, the preparation methods of platelet gel can be classified into four categories, namely, pure platelet-rich plasma, leukocyte- and platelet-rich plasma, pure platelet-rich fibrin, and leukocyte- and platelet-rich fibrin. According to the preparation process, the preparation methods of PRP gel also can be divided into manual protocol and automatic protocol. There are inadequacies in all the preparation methods.

Key words: biomaterials, biomaterial review, platelet gel, preparation, classification, influential factors, review

CLC Number:

R318

Wen Tian-yang, Wang Ai-hong, Xu Zhang-rong. Platelet gel preparation methods and relevant parameters[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(8): 1449-1454.

Figures/Tables 1

2.1 血小板凝胶制备方法的分类 2.1.1 纯富血小板血浆凝胶制备方法全自动制备方法：全自动血浆分离置换法和Vivostat PRP分离机。最早应用于局部治疗的血小板凝胶制备方法是使用一种特殊的血浆分离机单采血小板得到浓缩的血小板。在制备过程中，可以连续采集患者全血直至得到需要数量的血小板为止，也可以事先采集好添加了抗凝剂的全血后再输到设备中进行分离。分离机的离心力一般是3 000×g，离心后集成检测器可识别有形细胞成分，得到分离出的浓缩血小板后，将剩余绝大部分的血浆、白细胞、红细胞和少量的血小板通过回输设备重新输回患者体内。这种方法可以从450 mL的全血中得到40 mL的浓缩血小板[2]。尽管该方法工艺精良，但是制备的凝胶中还是会残留少量的红细胞和白细胞，并且这种制备方法复杂，耗费人力，需要专业人员的协助。从技术方面来看这种方法比较精确，但其在实际应用中很少，仅限于科学研究。Vivostat PRP分离机可认为是改良的全自动血浆分离机。该设备最初是用于制备富血小板纤维蛋白胶，利用该设备也可以得到乏白细胞-富血小板血浆凝胶。但该设备价格昂贵，操作繁复，并且其血小板回收率较低，在制备过程中血小板破坏也较多。虽然个别文献中报道过Vivostat PRP的使用，但在临床中并没有广泛开展[3]。手工制备法：Anitua 富生长因子血浆。该方法是由Anitua在1999年提出的，是早期用于制备浓缩血小板的方法之一，现在已用于商业开发。这种方法的基本流程是用数个试管采集含有抗凝剂的静脉血后离心，得到红细胞层、中间层以及上层血浆，上层血浆中的上1/2为乏生长因子血浆。用移液器小心去除这部分血浆后，剩余的1/2上层血浆被称为富生长因子血浆，同样在肉眼观测下，用移液器小心地将富生长因子血浆取出。向富生长因子血浆中加入10%氯化钙溶液，经15-20 min后即可形成富生长因子血浆凝胶，但这种凝胶非常不稳定，需要立即应用[4]。Anitua富生长因子血浆存在许多争议之处。虽然操作者明确指出得到的凝胶中没有白细胞[5-6]，但从操作流程中可以看出，选取的剩余1/2上层血浆与中间层，即血小板和白细胞富集层相连，仅靠肉眼观测很难完全排除吸取白细胞的可能性。操作的可重复性存在很大问题。虽然该方法的离心力较小，时间较短(460×g，8 min)，血小板破坏相对较少，形态保持较完整。但由于该方法明确指出没有取中间层，而血小板主要富集在中间层，因此其血小板的回收率势必较低[7]。该方法是一种操作简单，耗费少的纯富血小板血浆凝胶制备方法，但由于存在许多争议之处，并没有得到广泛的使用。与该方法类似的还有Nahita 富生长因子血浆[8]。 2.1.2 富白细胞-血小板血浆凝胶制备方法全自动制备法：血小板浓缩富集系统，SmartPReP，血小板重力分离系统和自体血小板分离机。血小板浓缩富集系统主要是一个含有两个相连的隔离室的特殊装置。其制备的大体流程是将采集的抗凝血放入第一小室中，经过短时间离心后得到3层(红细胞层，中间层和乏血小板血浆)。打开两隔离室的通道，利用气压原理将乏血小板血浆和中间层转移至第二小室，离心较长时间得到富白细胞-血小板血浆和乏血小板血浆。再次打开通道，同样利用气压将乏血小板血浆重新回输至第一小室而弃掉，在富白细胞-血小板血浆中加入氯化钙和牛凝血酶，即得到富含白细胞和血小板的凝胶，其结构及功能与手工制备的富白细胞-血小板血浆凝胶基本一致[3, 7]。相比之下，SmartPReP操作起来更为简单。它是利用质量及离心速度的不同，实现了物质在两室之间的自动转移。SmartPReP是一个多功能系统，不仅可以制备富白细胞-血小板血浆，还可以完成骨髓干细胞的浓缩富集[3, 9]。血小板重力分离系统与前两种方法的主要不同之处在于在第1次离心后，贫血小板血浆被直接去除，将包含红细胞的剩余部分进行第2次离心。离心结束后再利用气压原理将富白细胞-血小板血浆与红细胞层分开。虽然流程与前两者有所差别，但终产物基本相同[10]。自体血小板分离机被认为是全自动血浆分离置换法的改良方法，因其中含有大量的白细胞，所以制备的产物为富白细胞-血小板血浆凝胶。虽然该方法得到的血小板回收率较高，但血小板破坏程度并不清楚，且该方法制备能力有限，一次最多只能使用50 mL样本[11]。这几种全自动制备方法都存在一个共同的缺点，即制备费用昂贵，需要专门的仪器设备，明显限制了其在临床上的应用。手工制备法：Curasan，Friadent-Schutze，Regen 和 Plateltex。这些方法都以制备者的名字命名。Curasan和Friadent-Schutze两种方法相似。第1步是用含有抗凝剂的试管采集静脉血后，低速离心得到3层，分别是红细胞层、中间层及上层血浆(即乏血小板血浆)。在肉眼观测下小心地将中间层及乏血小板血浆转移至另一个试管中，在此过程中要尽量避免吸取红细胞层中的成分。第2步使用高速离心，得到上层的乏血小板血浆和下层的富含白细胞、血小板和纤维蛋白的成分，即富白细胞-血小板血浆，其中还含有少量的红细胞成分。在富白细胞-血小板血浆中加入氯化钙和牛凝血酶，即得到富白细胞-血小板血浆凝胶。Curasan和Friadent-Schutze的区别在于两次离心过程中采用的离心力和时间均不相同[2, 9]。Plateltex与以上两种方法的不同之处在于，在制备好的富白细胞-血小板血浆中用葡萄糖酸钙和巴曲酶替换氯化钙和牛凝血酶，目的是避免过敏反应以及缩短凝胶形成的时间[12]。而Regen的不同点是在采集的试管中加入了特殊的分离胶，其目的是提高血小板和白细胞的回收率。所有这些方法都需要较多的手工操作，耗费时间较长，并且得到富白细胞-血小板血浆凝胶的量较少。由于大部分的纤维蛋白位于乏血小板血浆中，而在制备过程中大部分又被去除，因此得到的凝胶中纤维蛋白的量很少，且纤维蛋白结构的密度较低。虽然这种结构也可以在应用中发挥作用，但很快就会发生溶解。凝胶中富集了大量血小板和白细胞，但回收率与操作者的熟练程度密切相关，因此结果的稳定性并不理想。如果操作不规范，甚至制备出的是纯富血小板血浆凝胶，而非富白细胞-血小板血浆凝胶。还有许多制备方法是基于这些方法而进行的改良，一般都是改变两次离心的离心力和时间，例如Ace PRP等[8]。富白细胞-血小板血浆凝胶对多种细胞增殖有促进作用，包括成纤维细胞、成骨细胞等[13]。但也有学者持不同观点，认为富白细胞-血小板血浆凝胶对细胞增殖并没有促进作用[14]。关于这一争论，可能的原因有几个方面：第一，制备富白细胞-血小板血浆血小板凝胶的方法较多，各种方法之间差别较大，导致制备出的凝胶特性不尽相同，进而影响实验结果。第二，体外实验中选用的细胞系往往选用动物细胞或人传代培养的细胞[15]，但由于富白细胞-血小板血浆凝胶中存在白细胞，具有很高的免疫原性，因此应采用人原代培养的细胞系作为实验用细胞系的金标准[13-14]。富白细胞-血小板血浆凝胶的另一个作用是促进多种细胞的分化[13]。但同样有学者认为富白细胞-血小板血浆凝胶对细胞分化没有促进作用，甚至有文献报道其对细胞的分化有抑制作用[14-15]。临床研究表明，富白细胞-血小板血浆凝胶在皮肤慢性溃疡、皮肤急性创伤、牙周和口腔种植、颌面外科以及骨科治疗等领域都取得了一定的治疗效果。能够促进软组织修复[16-17]，显著缩短组织重建时间[18]，并且能够减少手术带来的肿胀和疼痛[19-20]，进而缩短愈合时间。 2.1.3 纯富血小板纤维蛋白凝胶制备方法富血小板纤维蛋白基质是迄今为止惟一一种制备纯富血小板纤维蛋白凝胶的方法，其主要制备流程是用含有枸橼酸钠和特殊分离胶的试管收集少量全血，高速离心6 min。由于有特殊分离胶的存在，离心后可以很容易地得到与红细胞层隔离开的中间层及乏血小板血浆(中间层中不包含白细胞)。取出中间层和乏血小板血浆，转移至另一个含有氯化钙的试管中，并立刻离心15 min，即可得到富血小板纤维蛋白基质。制备者声称由于没有添加牛凝血酶，富血小板纤维蛋白基质是一种“天然”的血小板凝集物。但这种观点是存在争议的，因为在制备过程中添加了抗凝剂以及分离胶，因此富血小板纤维蛋白基质并非“天然”。由于制备所用的试管中存在特殊分离胶，而使第一次离心后得到的中间层中缺少白细胞，因此其终产物为纯富血小板纤维蛋白凝胶。富血小板纤维蛋白基质的优点是血小板的回收率较高，破坏较少[3]。制备过程中添加的激活剂(氯化钙)虽然与Anitua富生长因子血浆的制备相同，但由于后者的激活过程是静态的，而富血小板纤维蛋白基质的激活是在高速离心状态下完成的，因此富血小板纤维蛋白基质中纤维蛋白结构的密度以及稳定性都比Anitua富生长因子血浆中的高。但富血小板纤维蛋白基质也存在一些不足：在实际操作中很难同时大批量地处理，并且耗费钱力和物力较多。另外，富血小板纤维蛋白基质的功能及其临床应用的文献报道还很少。 2.1.4 富白细胞-血小板纤维蛋白凝胶制备方法 Choukroun 富血小板纤维蛋白是由法国科学家Choukroun在2001年首先提出的一种操作非常简单的制备富白细胞-血小板纤维蛋白凝胶的方法[21]。由于没有添加任何外源性的化学物质，Choukroun富血小板纤维蛋白被认为是天然的第2代血小板凝集方法[22]，其基本制备流程是用干燥玻璃试管采集全血，并以400×g离心力迅速离心10 min。由于没有抗凝剂的存在，血小板和纤维蛋白即刻被激活。离心结束后，全血分为3层：最底层为红细胞层，最上层为血浆层，中间凝胶状物质即为富白细胞-血小板纤维蛋白凝胶。用两层纱布将富白细胞-血小板纤维蛋白凝胶压制成薄膜后即可应用于临床[23]。富白细胞-血小板纤维蛋白凝胶具有稳定的三维纤维蛋白结构，该结构密度高，稳定性强，其中包含了全血中绝大部分的血小板和白细胞，以及两者释放的生长因子和细胞因子等活性成分。富白细胞-血小板纤维蛋白凝胶并不像其他富血小板血浆凝胶一样在制成后快速溶解，其结构溶解缓慢，类似于生理性血块的溶解过程，这就为生长因子等的缓慢释放提供了条件，较富血小板血浆凝胶有更长的作用时间[24-25]。富白细胞-血小板纤维蛋白凝胶的制备对设备和操作人员的要求低，并且可以一次性地大量制备，具有省时省力省钱的优点，更适合于临床的广泛应用。富血小板纤维蛋白凝胶的研究虽然起步较晚，但近两年来发展迅速，特别是富白细胞-血小板纤维蛋白的功能正在被人们逐步认识。成纤维细胞和成骨细胞的原代培养实验提示，富白细胞-血小板纤维蛋白有明显的促进细胞增殖和分化的作用[26]。在临床研究中，富白细胞-血小板纤维蛋白凝胶在皮肤慢性溃疡愈合、口腔科、颌面外科、整形外科以及耳鼻喉科等领域都有应用。富白细胞-血小板纤维蛋白凝胶能促进软组织的修复，缩短皮肤创面的愈合时间，增加单位时间内溃疡愈合面积[27]，并且能够减轻疼痛[28]。富白细胞-血小板纤维蛋白凝胶能够促进骨缺损愈合[29]，将抗生素导入富白细胞-血小板纤维蛋白中两者联合应用，效果更加明显[30-31]。对于必须服用抗凝剂(如心脏手术术后)但又需要进行手术治疗的患者，为防止出血等术后并发症的发生，可以在常规治疗基础上联合应用富白细胞-血小板纤维蛋白凝胶，效果较好[32]。 2.2 影响血小板凝胶制备方法分类的主要因素 2.2.1 制备流程在血小板凝胶的制备流程中选择的离心力和离心时间、制备成本、制备所需时间是3个主要因素，直接影响到凝胶的实用性及可行性。理想的血小板凝胶应具有制备时间短、成本低的特点。制备的复杂程度也是一个关键因素，程序越复杂，人为干扰的因素就越多，影响凝胶的质量和稳定性以及操作的可重复性。 2.2.2 凝胶的产量与成分凝胶的产量与多种因素有关，主要包括最初的采血量和血液成分等。在两次离心制备凝胶过程中操作者的经验以及熟练程度也是重要的影响因素，由于制备过程中会留取部分的乏血小板血浆，其保存量的多少，会直接影响到最终产物的量。凝胶中的成分主要包括血小板、白细胞、纤维蛋白以及生长因子、细胞因子等。前3者是血小板凝胶发挥作用的基础，其含量的多少以及活化程度直接影响到血小板凝胶的应用。凝胶中由血小板、白细胞所产生的生长因子以及细胞因子等是直接发挥作用的重要组分，其含量的多少是评价血小板凝胶功能的重要指标。 2.2.3 凝胶中的纤维蛋白空间结构凝胶中的纤维蛋白空间结构作为整个凝胶的基质，是影响血小板凝胶功能的重要因素，其作用已越来越受到人们的重视。纤维蛋白空间结构的密度以及类型是评价纤维蛋白的两个主要参数。其中密度主要取决于制备过程中富集的纤维蛋白原的数量。纤维蛋白的聚合过程主要取决于凝胶中纤维蛋白原与凝血酶。纤维蛋白原在凝血酶的作用下激活而形成纤维蛋白，形成的纤维蛋白空间结构有两种形式：一种是四分子结构；另一种是三分子结构，即三维的空间结构。前者一般形成于加入大量激活剂，快速激活过程中，这种结构不利于网罗血小板等成分，例如富白细胞-血小板血浆凝胶。而缓慢地类似于生理性凝集的激活过程产生的是第2种结构，这种由多纤维束交织而成的三维空间结构较四分子结构弹性更好，并且可以网罗大量的细胞成分以及因子，同时还能为细胞的迁徙提供结构基础，例如富白细胞-血小板纤维蛋白[33]。"

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