2.1 脊髓损伤后局部神经组织病理变化及壳聚糖材料的应用基础 2.1.1 脊髓损伤后的病理改变 脊髓损伤后，神经元出现胞体反应：胞体膨胀、核与核仁偏离中心、尼氏小体消失等，神经细胞结构蛋白合成增加而神经递质及其有关酶类合成减少。伤后轴索轴浆断裂、轴旁肿胀及轴索坏死。 近年来，利用细胞移植替代治疗取得了较好疗效，在一定程度上促进了损伤神经组织再生和神经功能重建[1-2]。但由于损伤后局部神经组织神经因子生成减少，过氧化及缺血再灌注损伤对细胞的损害，组织缺血缺氧和抑制轴突生长的因子[3-4]，移植的细胞往往存活率、分化率达不到预期效果，严重影响了移植治疗效果。此外损伤局部胶质细胞形成胶质瘢痕，压迫阻碍了再生轴索通过断端。因此如何改善脊髓损伤局部微环境和维持正常神经通路解剖结构免受瘢痕压迫是脊髓损伤后神经再生研究的焦点。 2.1.2 壳聚糖材料在脊髓损伤中的运用基础 壳聚糖的亲水性：壳聚糖分子中含有氨基和羟基，是一种亲水性大分子材料，较好的亲水性能促进细胞在材料表面的吸附和铺展。另外，壳聚糖材料具有良好的吸水性能，吸水易膨胀[5-6]，构成具有多孔的人工细胞外基质，可作为细胞生长的三维支架，维持种子细胞的新成代谢和生长表型。 壳聚糖与细胞及细胞外黏附分子的亲和力：壳聚糖是一种少见的天然阳离子聚合糖，而细胞表面充满带负电荷的膜蛋白，因此壳聚糖能和细胞表面发生非特异性吸附。经过大量实验发现壳聚糖材料与再生的神经细胞有较好的亲和力。另外，壳聚糖分子与细胞基底膜和细胞外基质中的糖氨聚糖分子结构相似，可与细胞外黏附分子(纤维连接蛋白、层粘连蛋白、Ⅳ型胶原等)结合，以促进细胞黏附，迁移和分化。 壳聚糖对周围组织的影响：壳聚糖可促进平滑肌细胞再生和抑制成纤维细胞生长[7-8]，防止瘢痕形成，为近端神经向远端神经生长扫除障碍。此外，壳聚糖还能促进血管内皮细胞生长，有利于神经再生中血管再生，从而促进轴突生长和髓鞘形成。国内学者也证明了壳聚糖具有无细胞毒性、不溶血、不致敏、生物相容性好、对神经组织无毒性等特性[9-10]。此外，壳聚糖与脑组织也具有良好的生物相容性[11]。 壳聚糖的生物降解性：体内巨噬细胞能分泌溶菌酶使壳聚糖逐步降解为壳寡糖，壳寡糖是具有2-10个氨基葡萄糖构成的寡糖，具有抗氧化，清除自由基，免疫调节，抑菌和调节造骨细胞生长的作用，而对生物体无毒害作用。神经组织工程要求壳聚糖降解速度应与神经再生速度相匹配，从而解除对再生神经的慢性卡压，壳聚糖降解速度可通过对氨基进行乙酰化或己酰化来调节。 壳聚糖的神经保护特性：在急性脊髓损伤中，壳聚糖具有显著的神经保护特性[12]：①维持受损神经细胞膜的完整性。②壳聚糖对受损细胞具有很高的亲和力，它通过和脂质膜的脂质链相互作用、疏水力和静电作用靶向受损细胞。③壳聚糖阻断活性氧和脂质过氧化的产生，这种抑制过氧化物的产生是维持细胞膜和线粒体膜完整性而实现的，并非对氧自由基的直接清除作用。此外，体外实验证明壳聚糖及其衍生物具有神经保护作用，具体的保护机制有：①抑制β-淀粉样物质的生成。②具有类似乙酰胆碱酯酶抑制剂作用。③对抗神经炎性病变。④抑制神经细胞凋亡[13]。 壳聚糖材料与种子细胞的亲和性研究： 壳聚糖与嗅鞘细胞的亲和性：中国学者将嗅鞘细胞接种至壳聚糖包被的培养板上共同培养，与对照组相比，嗅鞘细胞在壳聚糖膜上不仅可以生长、增殖，而且其形态未见改变，提示壳聚糖对细胞自身特性并无明显影响，虽然发现嗅鞘细胞在壳聚糖膜上贴壁、增殖速度低于多聚赖氨酸，但不影响对其整体生物相容性的评估[14]。将壳聚糖导管和嗅鞘细胞联合植入SD大鼠脊髓损伤处，术后8周，实验组SD大鼠的BBB评分明显高于对照组和空白组，荧光追踪可发现再生的神经纤维呈条索状排列，通过损伤处并向下生长，证明壳聚糖与嗅鞘细胞联合移植对中枢神经系统的轴突再生有较为显著的促进作用。 壳聚糖与神经干细胞亲和性：Yi等[15]用鼠胚神经干细胞与壳聚糖载体进行体外培养，观察到神经干细胞能够在壳聚糖多孔支架存活，可迁移入空隙内并以集落形式贴壁生长分化成神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞。证明壳聚糖支架与神经干细胞具有良好的生物相容性，并且外源神经生长因子能促进壳聚糖支架中神经干细胞向神经元分化。 此外，将神经干细胞分别放在3种不同拓扑学形式的壳聚糖材料(壳聚糖膜、壳聚糖多孔支架和壳聚糖多微管导管)中培养，发现不同拓扑学形式的壳聚糖对神经干细胞的分化和增殖有着不同影响[16]，利用这一现象可为调控神经干细胞活动提供新的方法。将神经干细胞置于含有具有不同浓度神经营养因子3的壳聚糖材料中培养，与常规培养液培养对比发现：神经营养因子3壳聚糖载体能稳定持续地释放神经营养因子3，能满足神经干细胞生长、增殖和分化为神经元过程中对神经营养因子3的需求，并提高神经干细胞向神经元的转化。同时用在这里的壳聚糖导管为神经干细胞提供里理想的3D支架，为神经干细胞的黏附、迁移和分化提供了良好的环境[17]。 Jiao等[18]发现壳聚糖和胶原复合材料比单纯壳聚糖或胶原凝胶更适合于神经干细胞移植治疗：①壳聚糖胶原联合膜为神经球的存活、迁移、扩增和分化提供更好的环境并促进它们分化。②黏附在壳聚糖胶原联合膜上的神经球具有更高的分化率和增殖能力。 壳聚糖与骨髓间充质干细胞亲和性：研究表明，骨髓间充质干细胞能在壳聚糖材料上黏附和向外生长。将骨髓间充质干细胞置于壳聚糖载体培养5 d后，MTT观察提示细胞对壳聚糖、多聚赖氨酸对照组和空白组的亲和性无显著差异。10 d后，骨髓间充质干细胞对壳聚糖材料亲和力显著提高，其贴壁率甚至超过了多聚赖氨酸对照组，并且骨髓间充质干细胞对壳聚糖的亲和力与壳聚糖分子量和脱乙酰程度有关，1×106相对分子质量的壳聚糖具有最好亲和力[19]。 2.2 壳聚糖支架在脊髓损伤中的应用 2.2.1 壳聚糖支架运用于脊髓损伤神经再生理论基础 目前，壳聚糖支架材料修复受损神经是基于两种神经 再生假设理论——接触引导理论和基膜管理论[20-21]。 接触引导理论认为轴突延长需要黏附在合适的基质材料上，这种基质材料理论上为细胞和轴突生长提供路径，引导神经重新连接；基膜管理论认为有利于大量基膜管形成的神经导管构型将会导致具有高密度轴突的神经干形成。再生轴突在接触引导作用下沿着支架材料预制的通道轴向生长，而不会缠绕打结形成神经瘤。 脊髓损伤后，神经断端胶质和结缔组织增生形成胶质瘢痕，压迫和阻碍再生神经纤维生长，使神经纤维不能到达远端。利用壳聚糖支架材料能产生有效的机械屏障作用，阻挡胶质向神经纤维的卡压，维持脊髓再生的正常解剖结构，有利于神经纤维再生，并且壳聚糖导管在移植后能发挥桥梁支架作用，使再生的神经轴突跨越损伤区[22]。 国内外已有学者将壳聚糖导管应用于脊髓损伤的修复并取得了显著效果。Li等[23]将聚糖导管植入成年鼠脊髓缺损部分，术后12个月再生的神经组织穿过壳聚糖胶原导管，连接两个神经断端，后肢功能明显改善。通过免疫组织化学、电镜观察、荧光示踪和BBB运动行为评分等方法证实了神经再生和功能恢复。随着对神经组织工程的认识深入，单一壳聚糖材料的性能使其应用受到了限制，而壳聚糖与种子细胞、细胞因子及其他工程材料的复合材料则表现出广阔的前景。 2.2.2 壳聚糖、种子细胞及细胞因子联合运用于脊髓损伤的研究 Cheng等[5]分别制作壳聚糖导管、层粘连蛋白壳聚糖复合导管连接SD大鼠T8段5 mm脊髓横断缺损，从功能评分看，术后6周大鼠BBB评分无显著差异，而2组CBS评分都降至80分左右。免疫组化在脊髓横断区发现大量Tubulin beta Ⅲ阳 性细胞和少量巨噬细胞，通过Western blot找到生长相关蛋白43条带。 生长相关蛋白43是轴索再生时表达上调的蛋白，生长相关蛋白43的表达为受损区轴索再生提供直接证据。生长相关蛋白43在层粘连蛋白壳聚糖复合导管的数量与单纯壳聚糖相比显著增多，且大约在术后60 d，移植导管周围的生长相关蛋白43数量达到最大。Chen等[24]用骨髓间充质干细胞填充壳聚糖管桥接成年鼠脊髓横断切口，移植后12周鼠BBB评分升高，轴索生长和再生神经细胞髓鞘再生过程加快，逆向荧光示踪确认上行束再生，并且已经建立了完整解剖结构的神经通路，并穿过了脊髓横断区域，连接了两端的神经断端且壳聚糖联合骨髓间充质干细胞能明显减少脊髓空泡体积。汪大彬等[25]将壳聚糖-藻酸盐支架复合骨髓间充质干细胞植入SD大鼠受损脊髓，术后6周实验组BBB评分明显高于对比组，苏木精-伊红染色示实验组与组织工程脊髓间连接紧密，交界区相互交错，无空洞、瘢痕组织，有明显分化特征的细胞出现。免疫荧光染色检测脊髓断端与支架材料交界区和移植区有大量NSE 阳性细胞，部分细胞胞体较大，已具有典型神经元外观。证明了壳聚糖-藻酸盐支架复合骨髓间充质干细胞移植有很好促进神经细胞再生的作用，并且效果比单纯壳聚糖-藻酸盐支架更显著。 杨阳等[26]研究壳聚糖导管和不同浓度骨髓间充质干细胞(107，109，1011 L-1)联合移植物在大鼠脊髓全横断损伤模型中的修复作用，术后12周运动诱发电位表明1011 L-1组皮质潜伏期短于107 L-1组，且109，1011 L-1组皮质振幅大于107 L-1组。组织观察，各移植组能见移植导管和脊髓断端吻合良好，尼氏染色显示在再生区域中段神经元数目1011 L-1组大于107，109 L-1组；双重免疫荧光组织化学检测显示各组再生轴突能穿越胶质瘢痕界面长入损伤远端；电镜观察再生区域内有较多的有髓神经纤维，其中 1011 L-1组的有髓神经数目多于107 L-1组，髓鞘厚度大于107，109 L-1组，提示种子细胞和工程材料联合移植中高浓度种子细胞的修复效果更好。 除了用壳聚糖材料构建神经再生通路导管，中国学者还采用壳聚糖和聚乳酸-羟基乙酸共聚物/Ⅰ型胶原/壳聚糖人工复合膜的构建人工硬脊膜[27]。在使用Allen打击法建立大鼠脊髓损伤模型后植入壳聚糖、聚乳酸-羟基乙酸共聚物/Ⅰ型胶原/壳聚糖人工复合膜。脊髓损伤24 h 后，壳聚糖组和复合膜组运动功能评分均明显高于模型组，复合膜组运动功能评分高于壳聚糖组。脊髓损伤后潜伏期均明显延长，模型组、壳聚糖组、复合膜组潜伏期明显高于假手术组，在6 h各组潜伏期明显增加，在24 h 左右到达高峰，而后开始逐渐下降，脊髓损伤2 d 后模型组、壳聚糖组、复合膜组潜伏期差异无显著性意义。各组细胞凋亡率均大于假手术组，损伤后6，24 h 壳聚糖组和复合膜组细胞凋亡率均明显低于模型组。提示在脊髓损伤后移植壳聚糖人工硬脊膜和聚乳酸-羟基乙酸共聚物/Ⅰ型胶原/壳聚糖人工复合硬脊膜有利于脊髓损伤的恢复，且聚乳酸-羟基乙酸共聚物/Ⅰ型胶原/壳聚糖人工复合硬脊膜效果优于单纯壳聚糖硬脊膜。 2.2.3 当前研究热点Nogo-66受体拮抗剂与壳聚糖的复合应用 Nogo-66是脊髓损伤后抑制神经再生的重要因子，也是当前脊髓损伤轴索再生研究的热点。Nogo-66受体介导3种髓鞘相关神经再生抑制因子——Nogo-66、髓磷脂相关糖蛋白少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白，这些因子是脊髓损伤后抑制轴索再生的主要因素。在脊髓损伤后拮抗Nogo-66受体能促进脊髓传导束轴突生长，促进运动功能恢复，因此应用可溶性Nogo-66受体拮抗蛋白能有效的促进中枢神经系统轴索再生[28]。 Guo等[29]用使用壳聚糖材料、神经干细胞/前体细胞、生长因子和Nogo拮抗蛋白复合导管移植治疗大鼠脊髓损伤，移植后大鼠长期生存率增加，神经干细胞/前体细胞向少突状胶质细胞的分化率提高2倍，更有效促进了脊髓再生。"