2.1   间充质干细胞的特征及临床应用   人间充质干细胞主要有两个主要来源：成人和围产期，成人来源指人体内可以分离间充质干细胞的特定组织，包括骨髓、脂肪组织、牙髓、外周血、月经血和肌肉等，围产期间充质干细胞的来源包括脐带成分，如脐带、华通氏胶、脐血以及胎盘结构，如胎盘膜、羊膜、绒毛膜和羊水等[11]。作为一种多能干细胞，间充质干细胞可以分化为中胚层细胞系，如肌细胞、软骨细胞、脂肪细胞和基质层成纤维细胞；还有内胚层和外胚层，如干细胞、神经元和胶质细胞，从而补充组织中丧失的细胞[12]。但越来越的研究发现旁分泌功能才是间充质干细胞治疗人类疾病的核心功能，其通过分泌生长因子、细胞因子、趋化因子、细胞外基质成分和代谢产物等在疾病治疗过程中发挥免疫调节、组织重塑和细胞稳态等功能[13]。 目前，间充质干细胞的临床试验已经涉及骨骼系统、神经系统及呼吸系统等多种系统疾病。HOANG等[11]最近通过对间充质干细胞用于临床疾病治疗的研究进行综述，发现不同来源的的间充质干细胞(主要是临床应用最广泛的来源于骨髓、脂肪和脐带的间充质干细胞[14])可能对特定器官的疾病具有倾向性，如骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)可能对脑及脊髓的疾病具有较好疗效，脐带间充质干细胞对可能对肺部疾病具有较好疗效，而脂肪间充质干细胞(adipose tissue-derived stem cells，ADSCs)可能是内分泌、生殖系统和烧伤疾病的理想种子细胞。而与不同间充质干细胞对特定器官具有倾向性相对应的是中医自古就强调中药的归经特性。归经是指中药对机体某脏腑经络的选择性作用。研究发现引经药可通过基质细胞衍生因子1/CXC族细胞因子受体4及单核细胞趋化蛋白1 / CC趋化因子受体2等信号轴促进间充质干细胞向特定器官的归巢[15]。所以，课题组认为未来根据不同疾病选择针对性的间充质干细胞种类及中药无疑具有提高间充质干细胞临床疗效的巨大潜力。"

2.2   间充质干细胞衰老的机制   有研究首次提出了细胞衰老的概念[16]，最初是观察到正常的二倍体细胞在有限的分裂次数(Hayflick 极限)后停止增殖。随后对细胞衰老的研究不断深入，2019年国际细胞衰老协会将细胞衰老定义为由应激性损伤和某些生理过程触发的一种细胞状态，其特征是长期且通常不可逆的细胞周期停滞，伴随分泌特征、大分子损伤和新陈代谢改变[17]。间充质干细胞在体外扩增主要经历复制衰老，而移植入体内的间充质干细胞主要经历应激诱导的衰老。导致间充质干细胞衰老的机制目前尚不完全清楚，但DNA损伤、端粒缩短、氧化应激、自噬障碍和线粒体功能障碍在间充质干细胞衰老中发挥了关键作用，是间充质干细胞衰老的主要公认机制[18-19]。 2.2.1   DNA损伤   DNA损伤包括端粒缩短、自发的脱氨基、水解、单链及双链断裂等[20]。由于大量的外源性和内源性基因毒素，DNA损伤在间充质干细胞生命中持续发生，DNA的完整性只有通过不断修复才能得以维持。但即使修复了大部分的DNA损伤，仍有一些逃脱了检测或者无法修复(主要是DNA双链断裂)导致细胞凋亡或衰老，而在细胞凋亡和衰老之间的抉择主要取决于DNA损伤的程度和持续时间，短期的剧烈DNA损伤常导致细胞凋亡，而长期的轻度DNA损伤常导致细胞衰老[21]。长期的DNA损伤主要通过激活p53/p21和p16通路造成细胞周期停滞和衰老[22-23]。 2.2.2   端粒缩短   每一次有丝分裂都会降低干细胞的增殖能力，导致它们复制衰老，而端粒缩短是间充质干细胞复制衰老的核心机制。哺乳动物细胞的端粒由数千个被Shelterin复合体覆盖的TTAGGG重复序列串联组成，该复合体有助于形成套索状结构(t环)以保护端粒DNA暴露的染色体末端免受DNA损伤。但由于 DNA的半不连续复制以及核酸酶和活性氧等有害因子的危害，端粒在每一次细胞分裂后都会发生缩短[24]。端粒缩短导致端粒DNA环失稳和端粒脱帽，未受保护的端粒类似于持续性DNA双链断裂，导致DNA损伤反应以及下游p53通路的激活，造成细胞周期停滞和衰老[25]，而通过促进端粒反转录酶表达等增加端粒长度可延缓间充质干细胞衰老[26]。 2.2.3   氧化应激   活性氧是导致细胞氧化损伤的主要原因，其主要由线粒体氧化磷酸化过程中的电子泄漏产生，低水平的活性氧对于维持细胞的增殖、分化和存活是必要和有利的，而且细胞可以通过产生超氧化物歧化酶、谷胱甘肽等内源性抗氧化剂清除活性氧，但在多种应激情况下，细胞活性氧产生过多或清除障碍导致细胞内活性氧的积累[27]。过多的活性氧主要通过以下两种途径造成细胞衰老[28]：①造成DNA损伤和端粒缩短，激活DNA损伤反应及其下游p53通路激活；②激活核因子κB信号通路促进白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α等衰老相关分泌表型因子分泌，造成细胞自分泌和旁分泌衰老。研究发现通过激活核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)信号通路等抑制氧化应激可抑制间充质干细胞衰老[29]。 2.2.4   自噬障碍   自噬可降解受损细胞器和蛋白质聚集体，维持细胞在饥饿和应激状态下的新陈代谢，与细胞衰老、凋亡等生理病理过程密切相关[30]。自噬主要包括巨自噬、微自噬及伴侣介导的自噬三种类型，而巨自噬(以下简称自噬)是细胞内最有效的细胞降解途径，也是目前研究最多的自噬类型。自噬包括吞噬泡的形成和延伸、自噬体的形成、自噬体与溶酶体融合以形成自噬溶酶体，最后通过溶酶体内一系列的水解酶将所包裹的细胞质底物进行降，进而实现细胞对自身代谢所需原料的再利用[31]。衰老的间充质干细胞自噬水平降低，促进自噬可通过提高细胞内蛋白质及细胞器质量控制抑制间充质干细胞衰老[32]。 2.2.5   线粒体功能障碍   线粒体作为细胞内氧化磷酸化和三磷酸腺苷合成的主要场所，是细胞的动力工厂，线粒体功能障碍是诱导细胞衰老的主要原因之一。线粒体形态及功能障碍导致细胞衰老的机制主要包括4个方面[33]：①线粒体代谢障碍导致氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸比例降低从而导致p53通路的激活；②线粒体自噬障碍导致线粒体质量控制下将，功能障碍的线粒体在体内聚集导致活性氧生成增加；③线粒体动态失调导致线粒体过度偏向融合，产生过多拉长的线粒体导致活性氧过度生成；④线粒体细胞内通讯障碍导致线粒体接纳来自内质网的钙增多，线粒体内过多的钙导致活性氧生成过多。研究发现使用光生物调节疗法等改善线粒体功能可抑制间充质干细胞衰老[34]。"

2.3   间充质干细胞衰老的表型特征   衰老的间充质干细胞具有多种表型特征，主要包括形态及结构改变、功能改变及细胞衰老相关标志物的增高等[35-40]，见表1。"

间充质干细胞衰老表型特征改善是评价中药抑制间充质干细胞衰老作用的指标，但目前并没有鉴定间充质干细胞衰老的特异性指标，在研究中常需要2个或以上的指标证明中药抑制间充质干细胞衰老的作用。"

2.4   中药抑制间充质干细胞衰老机制   中药抑制间充质干细胞衰老的具体机制见图3，4。"

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2.4.1   中药复方    健骨二仙丸：由龟板、鹿角胶、党参、枸杞子、续断及山药组成，具有补肾填精益气功效，可促进骨髓间充质干细胞成骨分[41]。郭柏铭[42]研究发现H2O2处理后的骨髓间充质干细胞出现体积增大、细胞扁平、核变大、β-半乳糖苷酶染色阳性率增高及p53、p21和p16 mRNA表达升高等一系列衰老特征，而健骨二仙丸和金匮肾气丸含药血清可抑制骨髓间充质干细胞衰老，显著改善衰老骨髓间充质干细胞代谢活力和增殖能力。 补肾化瘀生新方：由熟地黄、巴戟天、川芎、当归、石斛、肉桂和甘草组成，具有补肾活血功效。补肾化瘀生新方在体外对骨髓间充质干细胞的复制衰老及D-半乳糖和缺血缺氧微环境导致的衰老均具有抑制作用，并可促进衰老骨髓间充质干细胞增殖[43-45]。而在体内，研究发现补肾化瘀生新方联合骨髓间充质干细胞静脉移植相较于单纯骨髓间充质干细胞静脉移植可显著降低D-半乳糖诱导的衰老大鼠脑、心脏、肺脏及肝脏中p16、p53和p21 mRNA表达，说明补肾化瘀生新方可提高骨髓间充质干细胞移植的抗衰老作用[46]。 左归丸：由熟地黄、山药、枸杞、山茱萸、川牛膝、鹿角胶、龟板胶及菟丝子组成，具有补肾填精功效，是当前抑制间充质干细胞衰老的代表性中药复方。研究发现左归丸不仅可改善衰老骨髓间充质干细胞形态和结构，促进其增殖和成骨分化，而且对D-半乳糖导致的衰老骨髓间充质干细胞中β-半乳糖苷酶活性、磷酸化的组蛋白H2AX等细胞衰老相关标志的升高具有明显抑制作用，作用机制可能与抑制Wnt通路激活相关[47-50]。 补肾调肝方：由骨碎补、狗脊、白芍、柴胡、郁金、当归、玫瑰花、川楝子、川芎、白术、合欢皮、菊花、菖蒲和甘草组成。研究发现补肾调肝方水提液可改善衰老骨髓间充质干细胞形态，促进其增殖和成骨分化，降低衰老骨髓间充质干细胞中衰老相关异染色质水平，作用机制可能与抑制HIRA和ASF1a基因蛋白表达相关[51-52]。 独活寄生汤：由独活、桑寄生、杜仲、川牛膝、细辛、秦艽、茯苓、肉桂、防风、川芎、人参、甘草、当归、芍药和地黄组成，具有补益肝肾、祛风止痛的功效。WANG等[53]研究发现独活寄生汤以及其组成药物川芎不仅可通过激活Smad蛋白1/5/8和细胞外调节蛋白激酶信号通路增强骨髓间充质干细胞的成骨分化，而且可降低复制7-12代的骨髓间充质干细胞中衰老细胞数，促进衰老骨髓间充质干细胞增殖。 文章总结了抑制间充质干细胞衰老的相关中成药[42-53]，见表2。"

2.4.2   中药有效成分    白藜芦醇：是虎杖等多种中药的有效成分，具有抗炎、抗氧化和抗衰老等多种药理作用[54]。改善线粒体功能是当前白藜芦醇抑制间充质干细胞衰老和改善衰老间充质干细胞功能的主要机制。张大勇等[55]发现白藜芦醇可降低骨髓间充质干细胞线粒体活性氧产生及线粒体膜通道开放水平，通过改善线粒体功能抑制骨髓间充质干细胞衰老。LV等[56]研究发现白藜芦醇可显著改善衰老骨质疏松SAMP6小鼠的成骨能力，体外研究进一步发现来自于4月龄SAMP6小鼠的骨髓间充质干细胞表现出β-gal阳性率增高及成骨分化能力减弱等衰老特征，而白藜芦醇可通过促进骨髓间充质干细胞中线粒体内膜蛋白Mic60表达改善衰老骨髓间充质干细胞线粒体功能，促进其成骨分化，这可能是白藜芦醇防治骨质疏松的机制所在。除了改善线粒体功能，HE等[57]研究发现藜芦醇作为一种天然的沉默信息调节因子2同系物1(silent information regulator 2 homolog 1，SIRT1)激动剂可通过抑制V-Rel网状内皮增生病毒癌基因同源物A活性促进衰老骨髓间充质干细胞中SIRT1蛋白表达，通过调控V-Rel网状内皮增生病毒癌基因同源物A/SIRT1信号轴抑制骨髓间充质干细胞衰老。LEI等[58]发现白藜芦醇可通过促进Pim-1激酶的表达抑制脂肪间充质干细胞衰老并恢复衰老脂肪间充质干细胞的旁分泌作用，增强衰老脂肪间充质干细胞培养基对大鼠胰岛细胞瘤细胞胰岛素分泌的促进作用，而衰老脂肪间充质干细胞中Pim-1激酶的表达增加可能与磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)通路激活相关。ZHOU等[59]发现白藜芦醇可通过激活腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)信号通路抑制活性氧的产生从抑制骨髓间充质干细胞衰老，增强衰老骨髓间充质干细胞的细胞活力及成骨分化能力。 姜黄素：是姜黄和石菖蒲等中药的主要有效成分之一，具有抗氧化、抗炎、抗动脉粥样硬化及抗肿瘤等多种药理作用[60]。姜黄素主要通过提高端粒酶反转录酶活性抑制间充质干细胞衰老。PIRMORADI等[61]研究发现姜黄素可通过促进端粒酶反转录酶mRNA表达显著降低第5和7次传代的脂肪间充质干细胞中衰老细胞数量，促进衰老脂肪间充质干细胞增殖。但姜黄素水溶后治疗效果较差，SERATI-NOURI等[62]将负载姜黄素的介孔二氧化硅纳米颗粒集成到电纺聚己内酯/明胶纳米纤维支架中，实现姜黄素的两阶段释放相较于游离姜黄素可进一步促进脂肪间充质干细胞中端粒酶逆转录酶蛋白及mRNA表达，增加复制衰老脂肪间充质干细胞的端粒长度，抑制脂肪间充质干细胞复制衰老。除此之外，DENG等[63]研究发现姜黄素可通过促进自噬抑制间充质干细胞衰老。 甘草活性成分：甘草具有补脾益气和缓急止痛等功效，现代研究发现甘草中含有三萜类、黄酮类、多糖类及香豆素类等多种活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤和抗衰老等多种药理作用[64]。目前，至少已有7种甘草活性成分被证明具有抑制间充质干细胞衰老的作用，其中以黄酮类化合物研究较为深入。MAHARAJAN等[65]发现甘草查尔酮 D可通过上调AMPK介导的自噬激活抑制H2O2诱导的骨髓间充质干细胞衰老。WU等[66研究发现复制9代之后的脂肪间充质干细胞表现出括体积增大和p16蛋白表达增加等明显衰老特征，而甘草酮查尔A可通过促进脂肪间充质干细胞中甘油醛-3-磷酸脱氢酶和磷酸果糖激酶等糖酵解相关基因转录激活糖酵解从而抑制脂肪间充质干细胞复制衰老，促进衰老脂肪间充质干细胞增殖和成骨分化。除了黄酮类化合物，降瑞婵等[67]研究发现甘草中的5中活性成分甘草酸、甘草苷、异甘草苷、芹糖甘草苷和芹糖异甘草苷均可抑制脂肪间充质干细胞衰老，其中以甘草酸的抗衰老效果最佳，其次是甘草苷和芹糖异甘草，作用机制可能与抑制活性氧产生相关。 灵芝酸-D：是中药灵芝的主要活性成分之一，研究发现灵芝酸D可增加D-半乳糖诱导的衰老人羊膜间充质干细胞中14-3-3蛋白家族中14-3-3ε蛋白表达[68-69]，而14-3-3ε蛋白的过表达可通过激活钙调蛋白/2型钙调蛋白激酶/Nrf2信号轴抑制人羊膜间充质干细胞衰老，促进其增殖。 人参皂苷Rg1：是益气中药人参的主要活性成分之一，具有抗衰老、抗氧化和保护神经功能等多种药理作用，可促进间充质干细胞的增殖和分化[70]。汪子铃[71]发现人参皂苷Rg1可通过激活PI3K/Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路增强D-半乳糖诱导的骨髓间充质干细胞中p62依赖性细胞自噬，而自噬的增强可通过激活Nrf2通路抑制骨髓间充质干细胞衰老。王爽[72]发现人参皂苷 Rg1可通过提高p16和T-box转录因子2 mRNA表达抑制D-半乳糖导致的人脐血间充质干细胞衰老，促进衰老人脐血间充质干细胞成骨分化，抑制其向脂肪细胞分化。 淫羊藿苷：是补肾中药淫羊藿的主要活性成分之一，具有良好的促进骨髓间充质干细胞成骨分化的作用[73]。王鹏珍等[74]研究发现淫羊藿苷和碱性成纤维细胞生长因子单独应用均可降低体外培养大鼠外周血间充质干细胞中β-gal 染色阳性细胞数，促进大鼠外周血间充质干细胞增殖及干性维持，且两者联合作用显著优于单独应用。 樟脑醌：是中药樟脑的主要活性成分。MAHARAJAN等[75]研究发现樟脑醌可通过促进AMPK/SIRT1通路激活增加H2O2诱导的衰老骨髓间充质干细胞中膜型微管相关蛋白1轻链3 /胞浆型微管相关蛋白1轻链3比率和自噬相关蛋白Beclin1表达，降低p62蛋白表达，通过促进自噬抑制骨髓间充质干细胞衰老。 表没食子儿茶素没食子酸酯：主要存在于绿茶中，具有抗菌、抗肿瘤及抗炎等多种药理作用[76]。SHIN等[77]发现表没食子儿茶素没食子酸酯可通过促进Nrf2核移位逆转H2O2导致的骨髓间充质干细胞中p53和p21蛋白水平升高，抑制骨髓间充质干细胞衰老。 当归多糖：是补血活血中药当归的主要活性成分，可通过激活PI3K/Akt和Wnt/β-连环蛋白等信号通路促进间充质干细胞增殖和分化[78]。耿珊[79]研究发现来自白血病患者的骨髓间充质干细胞相较于来源于健康人骨髓间充质干细胞的集落形成能力和多向分化能力明显降低，细胞中超氧化物歧化酶及总谷胱甘肽明显降低，而β-半乳糖苷酶染色阳性率及p16、p53及p21mRNA则明显升高，表现出典型的衰老表型特征，而当归多糖不仅可显著改善来源于白血病患者骨髓间充质干细胞的上述表型特征，促进其增殖，并且可增强衰老骨髓间充质干细胞对白血病干细胞增殖的抑制作用，起到防治白血病的作用。 黄芪多糖：是益气中药黄芪的主要有效成分之一，具有修复甲醛染毒人骨髓间充质干细胞的DNA损伤的作用[80]。YANG等[81]发现黄芪多糖可通过抑制线粒体活性氧产生逆转柠檬酸铁铵导致的骨髓间充质干细胞衰老，提高衰老骨髓间充质干细胞内多能基因Nanog、Sox2和Oct4 mRNA表达，改善衰老骨髓间充质干细胞增殖能力。  柚皮素：存在于石斛及枳实等多种中药中，具有抗氧化、抗炎等多种药理作用[82]。吴雅廷等[83]发现柚皮素可降低体外培养脂肪间充质干细胞中活性氧及p16蛋白表达，降低β-gal 染色阳性细胞，抑制脂肪间充质干细胞衰老，促进脂肪间充质干细胞的增殖，这可能是柚皮素激活核苷酸结合寡聚结构域样受体信号通路上调锰超氧化物歧化酶基因的表达的结果。 蒙花苷：存在于密蒙花、野菊花及薄荷等多种中药中，具有抗氧化、抗炎及抗骨质疏松等多种药理作用[84]。崔直等[85]发现蒙花苷处理后，D-半乳糖诱导的衰老骨髓间充质干细胞中衰老相关蛋白 p16、p21的p53表达明显降低，DNA损伤相关细胞核内磷酸化组蛋白H2AX阳性细胞明显减少，说明蒙花苷具有抑制骨髓间充质干细胞衰老的作用。 大麻二酚：是药用植物大麻的活性成分之一，具有具有抗惊厥、抗焦虑、抗炎及神经保护等多种药理作用[86]。李琳等[87]发现大麻二酚可通过促进自噬相关蛋白膜型微管相关蛋白1轻链3B表达抑制D-半乳糖诱导的骨髓间充质干细胞衰老，促进衰老骨髓间充质干细胞成骨分化。 文章总结了中药有效成分抑制间充质干细胞衰老的作用及机制[55-87]，见表3。"

2.4.3   中药单体    艾叶：具有温经止血和散寒止痛等功效，现代研究发现其含有挥发油、酚酸、黄酮和多糖等多种活性成分，具有抗炎和抗肿瘤等多种药理作用[88]。HO等[89]研究发现艾叶水提物不仅可通过抑制线粒体活性氧产生抑制阿霉素诱导的脂肪间充质干细胞衰老，而且可明显改善老年大鼠的前肢握力、记忆力和心脏功能，具有良好抗衰老作用。 黄芪：具有补气升阳、益气固表及敛疮生肌等功效，现代研究发现黄芪含有多糖、黄酮类和三萜类等多种有效成分，具有抗肿瘤和神经保护等多种药理作用[90]。研究发现黄芪可通过调节维生素D/成纤维细胞生长因子23/Klotho轴抑制D半乳糖导致的骨髓间充质干细胞衰老，促进衰老骨髓间充质干细胞成骨分化，从而起到防治骨质疏松的作用[91-92]。"