2.1   脱细胞基质生物墨水制备   生物墨水是生物3D打印的材料基础。不同物种、不同组织或器官来源的脱细胞基质生物墨水制备方法有所差异[11，13-32]，见表1，但大致过程分以下几步：①将新鲜的动物组织与器官经过特定的脱细胞处理方法去除细胞，获得脱细胞基质；②将上述脱细胞基质进行冷冻干燥，进一步利用研磨仪研磨成细小颗粒或粉末，可增加脱细胞基质表面积，利于后续酶解；③使用含酶的酸性溶液消化脱细胞基质，降解胶原纤维三螺旋结构的端肽，获得可溶性胶原蛋白单体结构，此步骤常使用胃蛋白酶处理两三天，该酶可溶解99%的酸不溶性胶原蛋白[33]；④为了后续负载细胞，使用碱液调节酸性消化液的pH值约至7.4，灭活胃蛋白酶。同时，利用10×培养基或10×磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS)[11]调节液体渗透压，获得预制胶，此时预制胶具备一定黏度和流动性，可进行打印。保证低温制备、储存与打印预制胶，防止其提前凝胶化；⑤预制胶与细胞混合，获得脱细胞基质生物墨水，细胞浓度一般为(1-5)×109 L-1。该墨水打印后利用37 ℃孵育可促进成胶，形成具有特定结构的仿真组织或器官，见图4。"

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2.1.1   脱细胞方法   脱细胞过程，去除组织或器官中的细胞成分，保留ECM组分和微观组织结构。不同组织或器官的细胞数量、细胞外基质的紧密度、厚度和脂质含量等各有差异。特定组织或器官来源的脱细胞基质制备，需使用不同的脱细胞方法。脱细胞方法主要包括物理法、化学法和酶处理法，见图5。"

物理方法：如表2所示，常用物理脱细胞方法有高静水压法、超临界CO2法、反复冻融法以及超声破碎法等，其基本原理为通过物理方法破坏细胞膜，释放细胞内容物[34-36]。①高静水压法，当液体静水压超过600 MPa时[34]，细胞破碎。②CO2的临界点为：31 ℃，7.38 MPa，超临界CO2是温度和压力处于临界温度和临界压力以上的CO2，可破坏组织的极性基团，并制备干态的脱细胞基质材料[35]。③反复冻融方法通常需对材料进行循环低温冷冻(-20 ℃，-80 ℃或-196 ℃)与室温/生理温度解冻，从而破坏细胞膜，并在膜内形成冰晶导致细胞裂解[36]。整体上，物理脱细胞法可保持更好的ECM结构完整性，但细胞清除效率较低。"

化学方法：通过洗脱试剂破坏细胞膜，从而达到去除细胞的目的。如表3所示，常用的化学试剂为洗涤剂[37-41]，主要包括离子型洗涤剂、非离子型洗涤剂和两性离子洗涤剂。离子型洗涤剂如十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)和脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate，SDC)可破坏脂质-脂质、脂质-蛋白质、DNA-蛋白质和蛋白质-蛋白质的相互作用，释放细胞成分和DNA，被广泛用于各种组织如软骨和心肌等[37]。聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)是常用的非离子型洗涤剂，可温和破坏脂质-脂质、脂质-蛋白质和DNA-蛋白质的相互作用，但不影响蛋白质-蛋白质相互作用[38]。3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(3-[(3-Cholanidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate，Chaps)是一种非变性两性离子洗涤剂，可破坏蛋白质之间的非共价键并溶解膜蛋白[39]。整体上，化学脱细胞法细胞去除率高，但对细胞外基质结构破坏较大。不同的脱细胞试剂的效果也不尽相同，需根据所处理组织/器官的大小、厚度、紧密度以及所保留物质的组分不同，选取不同的脱细胞配方。"

酶处理方法：作为物理法与化学法的后处理方法，酶处理可去除DNA、RNA以及其他引起免疫原性的抗原物质，常用酶包括蛋白酶和核酸酶等。经化学试剂处理后，组织孔隙率会增大，进一步利用酶处理可去除残余的核酸成分。蛋白酶如胰酶可破坏蛋白质肽链，导致蛋白质水解并破坏细胞与细胞外基质的黏附。核酸酶如DNase与RNase能分别催化DNA和RNA发生裂解。研究显示长时间使用酶处理可能降低组织的胶原蛋白和糖胺聚糖含量，影响细胞外基质结构稳定性[42]。  2.1.2   灌注洗脱与浸泡搅拌法   对于较大尺寸的组织/器官，如心脏、肺和肝脏等，简单的组织浸泡洗脱，难以让洗脱液浸入组织器官的深部，脱细胞去除效果较差，此类组织器官脱细胞基质的制备，更适合利用灌注洗脱法制备。灌注方法通过注射泵向脏器内注入液体，脏器的血管网络作为液体流通的管道，并通过压力传感器控制流速，主要针对大型脏器如心脏、肾脏等该方法可提高大型脏器的脱细胞效率并保留血管网络结构，但需额外的注射/抽吸泵等装置，对流速控制要求较高[43]。浸泡搅拌可保证材料有更大面积暴露于液体中，主要针对小型组织，其效果取决于试剂、组织大小和搅拌速率等[44]。 2.1.3   脱细胞基质材料的灭菌方法   灭菌处理对于脱细胞基质生物墨水的保存与使用至关重要，常用的灭菌方法包括：60Co辐照、紫外线灭菌、环氧乙烷和抗生素处理等。 各灭菌方法各具优缺点。60Co辐照利用强穿透性的电子束破坏微生物的核酸、蛋白质和酶[45]。紫外线灭菌是实验室材料常用的灭菌方法之一，其可引发胸腺嘧啶分子间交联，形成共价二聚体，从而破坏微生物的DNA结构[46]。环氧乙烷可导致微生物蛋白质和核酸中的氨基和羧基烷基化[45]，见表4。"

动物组织/器官的脱细胞方法发展几十年，技术已较为成熟。研究人员在具体研究工作中，应根据组织器官的不同来源、结构特点以及脱细胞基质的未来用途，针对性地选择合适的脱细胞方法。脱细胞方法选择是脱细胞基质制备的首要步骤，也是决定脱细胞基质质量的关键环节。制备过程中，除要考察细胞去除效率之外，需兼顾活性物质保留、细胞外基质天然组织结构的维持完整性以及试剂残余等问题。 2.2   脱细胞基质生物墨水性能表征   脱细胞基质生物墨水制备的质量以及组分信息、流变性能，对于其后续应用具有重要指导作用。一般利用DNA和ECM蛋白定量可判断脱细胞效果达标与否；流变性能检测可辅助判断脱细胞基质生物墨水的打印性；微观结构、生物相容性、力学强度和生物降解性测试可用于评估脱细胞基质生物墨水的功能性。 2.2.1   脱细胞基质组分   脱细胞充分与否直接决定生物墨水的免疫排斥作用，目前临床可使用标准为dsDNA含量低于50 ng/mg(干质量状态)[42]；同时可辅助DNA凝胶电泳实验，DNA残余片段长度低于200 bp；组织切片苏木精-伊红染色，验证无明显可见的细胞核残余。除猿类和人类外，哺乳动物细胞的细胞膜上存在α-gal抗原表位[47]，该表位是造成异种器官移植时出现免疫排斥的主要原因，需进行去除和检测。为掌握特定组织来源的脱细胞基质理化特性与生物活性，对其组成成分如胶原蛋白和弹性蛋白等含量进行测定。利用SDS-PAGE可分析肽链信息[48]，液相二级质谱(LC-MS/MS)定量分析蛋白质组成信息[40]。VISSCHER等[49]利用LC-MS/MS方法比较了猪软骨脱细胞前后的蛋白质组成，发现683种蛋白质仅存在于新鲜猪软骨中，21种蛋白质仅存在于脱细胞猪软骨中，412种蛋白质在猪软骨脱细胞前后均存在。 2.2.2   流变性能   流变性能指示材料的可成胶性能，决定材料的可打印性，测试方法包括黏度-剪切速率测试、温度扫描测试和频率振动测试等。挤出式打印的生物墨水黏度通常要求为30-6×107 mPa s-1，其精度范围为200-1 000 μm[50]。黏度-剪切速率测试可确定材料的黏度及其是否具有剪切变稀性，保证打印细胞的活力大于90%。研究发现，在剪切速率为2 s-1时，软骨、脂肪和心脏来源的墨水的黏度分别为2.8 Pa s-1，6.13 Pa s-1和23.6 Pa s-1[11]。温度扫描测试可检测在固定振动频率下，墨水在升温过程中储能模量G’与损耗模量G’’的大小变化，这种变化源于胶原蛋白单体的自组装，从而分析脱细胞基质生物墨水由预凝胶(G’ < G’’)转变为凝胶(G’ > G’’)的过程，判断最佳成胶温度与成胶时间。频率振动测试可测试不同的振动频率范围内G’与G’’的大小关系。 2.2.3   微观结构   生物墨水的微观结构，包括拓扑结构、支架纤维的直径、孔径大小和纤维取向等会影响细胞排列和成熟分化[48]。扫描电镜可用于观察凝胶的纤维结构，脱细胞基质水凝胶浓度越高，其内部孔径大小会逐渐降低[51]。不同动物或者组织来源的脱细胞基质纤维直径各有不同，例如猪膀胱脱细胞基质凝胶的纤维直径约为74 nm[52]，而猪心肌、猪小肠和人脂肪组织脱细胞基质凝胶的纤维直径约为100 nm[53-55]。 2.2.4   生物活性   脱细胞基质生物墨水因其在组织来源等方面存在差异，因此对细胞活力、增殖、迁移、形貌、分化和表型等具有不同影响。WOLF等[52]发现在猪真皮脱细胞基质凝胶表面培养的C2C12成肌细胞会融合形成大直径的多核肌管状结构，而在猪膀胱脱细胞基质凝胶表面细胞融合的程度较小。AGUADO等[56]对比了具有不同储能模量(0.33-58.10 Pa)的脱细胞基质凝胶对于其负载的细胞影响，发现G’为29.6 Pa的脱细胞基质凝胶的细胞活力最高。 2.2.5   力学强度   生物墨水的力学强度对于其后续应用至关重要，对其基本的机械特性进行研究有助于后续材料的优化。力学性能主要包括压缩模量、软硬度、弹性模量等。压缩测试用于获得材料的压缩模量；超声波法、磁共振弹性成像法和原子力显微镜用于检测硬度[57-58]；纳米压痕仪则用于纳米尺度上测量力学性质和硬度[59]。研究发现软骨和椎间盘脱细胞基质凝胶的压缩模量强度基本低于20 kPa[60]。 2.2.6   生物降解性   将冻干的材料放入酶溶液或植入动物模型体内，通过测量材料随着时间变化的质量损失情况，可表征材料的生物降解性。植入物的降解速率由浓度、交联剂、墨水来源的组织类型及体内外环境等因素共同决定[61]。材料的降解会影响其力学性能以及细胞的伸展和迁移[62]，理想植入物的降解速率应匹配组织细胞外基质再生速率，且降解产物无副作用。GILBERT等[63]发现猪小肠黏膜脱细胞基质植入体内后在1个月内降解了50%，在3个月内完全降解。  脱细胞基质生物墨水的性能表征，是判断脱细胞基质生物墨水3D打印性、以及3D打印条件参数设置的重要前提。因此，在具体研究中，对所制备的脱细胞基质的组分信息、流变性能、降解特性、形貌结构以及生物降解性等基本理化性能进行全面详细评估，是必不可少的环节。 2.3   脱细胞基质生物墨水在心血管领域中的应用   在20世纪80年代，VACANTI和LANGER提出组织工程概念，即通过结合生物学、材料学和工程学等方法用以修复及再造组织或器官[64]。之后，由SHINOKA，ZIMMERMANN和NEREM分别率先开展了工程化心脏瓣膜、心肌组织和血管的研究[65-67]。但至今为止，仅有少量进入临床试验的心血管组织工程产品，比如源于猪小肠黏膜下层脱细胞基质的CorMatrix、源于猪心肌脱细胞基质的VentriGel和海藻酸钠凝胶材料Algisyl-LVR?，其中CorMatrix作为心肌补片已进入临床试验阶段。3D生物打印技术具有设计自由度高和制造灵活的特点，其通过计算机辅助技术有望构建具有复杂几何功能结构的心血管组织器官。 2.3.1   脱细胞基质生物墨水在组织工程血管中的应用   天然血管主要由3层结构构成，包括内膜、中膜和外膜，分别由内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞组成。内皮层在血管抗凝过程起关键作用，而平滑肌细胞构成的中膜层可起到收缩舒张作用。 组织工程策略构建血管作为人工血管开发的前沿性技术。随着生物3D打印技术的发展，通过生物墨水负载内皮细胞或内皮祖细胞、以及平滑肌细胞，体外仿生构建由内皮细胞与平滑肌细胞构成的功能血管成为可能。GAO等[16]利用同轴打印，将负载人内皮祖细胞的猪降主动脉脱细胞基质生物墨水与海藻酸钠溶液作为外壳，泊洛沙姆 (Pluronic F-127)溶液作为内部牺牲层，构建了人工血管。这种3D打印血管治疗裸鼠下肢缺血模型，植入28 d后，其3D打印血管内腔形成了内皮层，并且缺血部位的血流灌注率获得显著提升，该研究证明了3D打印血管的可行性，但该血管力学强度较弱，手术吻合性较差，需进一步优化改进。 针对上述脱细胞基质生物墨水打印结构力学强度弱的问题，YELESWARAPU等[68]使用立体光刻3D打印技术，先打印出同心圆柱模具，再向模具内部灌注羊食管肌肉脱细胞基质生物墨水得到由脱细胞基质组成的管状结构，该结构可承受14.5 N的纵向压力和13.3 N的横向压力。此外，XU等[69]使用F127溶液和一种有机硅溶液(SE1700)构建了中空管状结构，并向中空部位灌注负载人主动脉平滑肌细胞的猪软骨脱细胞基质墨水，再向内层灌注负载人脐静脉内皮细胞的猪软骨脱细胞基质墨水，最后将上述结构浸入负载人皮肤成纤维细胞的猪软骨脱细胞基质墨水池中，得到了三层小口径血管，这种血管的力学性能与人天然主动脉相似，在体外培养48 h后仍能维持完整结构，见图6。"

此外，有研究团队通过将脱细胞基质与其他材料混合，从而增强打印结构的力学性能。例如，POTERE等[70]将猪主动脉脱细胞基质、明胶和海藻酸混合，打印出高度为9 mm的大血管，该血管在承受外界压力变形后仍能回复原状。 脱细胞基质生物墨水在组织工程血管构建中的应用总结见表5。通过使用先进打印技术与材料复合，脱细胞基质血管的力学性能可得到提升，然而现有研究工作打印过程较为复杂，且缺乏动物实验验证。再者，对于多层血管培养条件优化，以及各层之间的相互作用尚缺乏考虑。更为重要的，脱细胞基质生物墨水构造血管的缝合强度、爆破压等重要性能还需进行详细测试，为其作为医疗器械应用于临床治疗提供充分证据。因此，现有脱细胞基质生物墨水打印的血管主要用于基础研究，如病理学、药理学和毒理学研究。"

由“蓝光英诺”公司开发的首款干细胞3D生物打印产品REVOVAS在恒河猴和五指山小型猪身上进行了实验，结果表明植入的血管在短期内可实现完整血管组织再生，具备正常血管的功能，目前该产品已获得临床试验批准，临床试验结果还有待验证。 2.3.2   脱细胞基质生物墨水在组织工程心肌中的应用   心室壁由3层结构组成，由外到内分别是心外膜、心肌层和心内膜，其中心肌层是构成心室壁的主要成分，由各向异性心肌细胞和胶原纤维组成[71]。心肌梗死发生时，冠状动脉被部分或全部阻塞，导致局部心肌缺血缺氧，造成大量心肌细胞死亡并被成纤维细胞替代，形成瘢痕组织。组织工程心肌通过负载细胞或活性分子构建具有天然心肌组织结构的仿生支架，使其具有诱导修复损伤心肌组织的能力，最终恢复心肌功能。  研究表明，利用脱细胞基质构建心肌补片可促进缺血部位的血管新生、提升心肌细胞的活力及改善心肌的收缩功能等。例如，PATI等[11]首次使用猪心脏脱细胞基质生物墨水进行打印，与胶原蛋白组相比，含脱细胞基质的打印组织结构中的小鼠心肌细胞的心肌特异性基因Myh6(Myosin Heavy Chain 6)和Actn1(Alpha-Sarcomeric Actinin)表达水平更高。DAS等[72]先打印聚乙烯-醋酸乙烯酯支架，再将猪心脏脱细胞基质墨水打印至支架上，结果表明与胶原蛋白组相比，含有猪心脏脱细胞基质的结构更能促进心肌细胞成熟和分化。有研究将猪左心室脱细胞基质与GelMA混合，并负载心肌细胞，通过控制紫外光照的路径打印出具有平行线条微图案的心肌结构[73]。体外培养1 d后，脱细胞基质-GelMA心肌结构中的心肌细胞与微图案的线条相平行；体外培养3 d后，在无外部刺激的情况下，脱细胞基质-GelMA心肌结构中的心肌细胞可观察到搏动现象；体外培养7 d后，与胶原蛋白-GelMA组相比，脱细胞基质-GelMA组中在平行于线条的区域中可观察到更密集的细胞，同时该组出现更多同步收缩区。BEJLERI等[74]将GelMA与猪心室脱细胞基质混合打印出心脏补片，与GelMA组相比，该补片内的心脏祖细胞的心源性基因表达量提升了30倍；GelMA-脱细胞基质补片贴附在小鼠心外膜表面14 d后出现明显的血管化。之后该团队利用小鼠右心室衰竭模型发现该补片可促进血管形成、降低心肌肥大程度和提高右心室的功能性，表明加入脱细胞基质可提升治疗效果[75]。由此可见，与胶原和GelMA等相比，脱细胞基质生物墨水在心肌修复中更有优势。 组织工程心肌修复材料的设计，主要集中于提升材料力学强度、导电性能以及构建微血管网络3个方面。其中为了打印出力学性能与心脏组织相匹配的结构，JANG等[51]将维生素B2加入猪心脏脱细胞基质生物墨水中，所打印的结构经过紫外交联后再进行热孵育，其硬度提高了33倍，力学性能接近于天然心脏组织，且能促进心脏祖细胞分化。进一步地，JANG等[12]利用猪心脏脱细胞基质分别负载人间充质干细胞和心脏祖细胞，同时加入血管内皮生长因子，构建出预血管化的心肌补片，该补片可增强心肌功能、降低心肌肥大和纤维化程度，促进了心肌组织的修复效果。 心脏通过传导系统将电信号传导到心脏的各个部位而产生收缩舒张功能，心肌电活动的紊乱是心肌梗死后心肌功能受损的主要原因之一。构建导电性组织工程心肌对于心功能恢复具有至关重要的意义。ASULIN等[76]将猪视网膜脱细胞基质、导电石墨桨和表面活性剂混合，打印出嵌含柔性、可伸展的电子器件的心肌补片，该补片可经受类似于心肌收缩的持续形变，并且电子器件可用于观察组织功能，还可通过电刺激控制起搏。  心肌存活需要充足的血供进行氧气扩散和营养物质运输，如何打印具有微血管网络的结构是该心肌组织打印的难题之一。预血管化是一个重要的策略。基于此，NOOR等[77]利用负载心肌细胞的脱细胞基质生物墨水打印出2层网格结构，而在第三层利用不负载细胞的脱细胞基质生物墨水打印出支撑壁结构，同时在该层内部打印负载内皮细胞的明胶墨水；最后，再利用负载内皮细胞的脱细胞基质生物墨水打印出2层网格结构作为顶层，从而形成心肌补片。该补片在37 ℃孵育30 min可去除液化后的明胶，形成具有血管网络的心肌补片；该补片在体外培养至第7天时，内皮细胞形成了一层连续的管状结构；植入小鼠大网膜内7 d后，补片内的心肌细胞形态更为细长且整齐，同时具有大量肌动蛋白条纹，说明该补片已具有一定的收缩性。 脱细胞基质生物墨水在组织工程心肌中的应用总结见表6。"

尽管已有研究在心肌补片和心肌组织的力学性能、心肌补片的电传导性、促血管再生、促细胞生长和收缩性等方面取得了一定进展，然而种子细胞的参数(类型、区域密度和数量等)对于心肌补片的影响问题和导电心肌补片与宿主组织之间的电耦合问题等尚未取得突破。 脱细胞基质作为生物墨水在3D打印心血管组织工程领域的应用潜力，近年来取得较大进展，但现有研究大多处于概念性验证阶段，距离临床应用还有较远的距离。从概念性验证到实现临床应用仍面临巨大挑战：①脱细胞基质材料的力学强度还有待进一步提升；②如何实现大尺寸组织或器官的组织结构稳定性以及营养代谢长期稳定性维持；③未来作为产品应用，如何保持脱细胞基质成分与批次稳定性；④以及储存与运输问题如何解决等，未来仍需要开展大量研究工作。"