2.1   激素型骨缺血坏死   糖皮质激素是临床上应用较为广泛的一类抗炎和免疫抑制药物，常被用来治疗各种疾病，如关节炎、系统性红斑狼疮、严重的过敏反应和癌症等[7]。近年来大量研究表明，过度使用糖皮质激素会导致患者发生非创伤性骨坏死，称为激素型骨缺血坏死[8-10]。激素型骨缺血坏死这一疾病极具挑战性，是骨科领域至今尚未解决的疑难疾病之一。近年来，该病的患病率呈明显上升趋势，仅在中国就有812万非创伤性骨坏死患者[11]，每年仅在美国就有一两万例新增病例，发病年龄也趋于年轻化[12]，这给社会和家庭都带来了严重的负担。 糖皮质激素诱导的骨缺血坏死是一种代谢性疾病，它是由于使用糖皮质激素类药物，从而导致骨头血液供应受损、骨细胞死亡，进而导致骨结构性变化和关节功能障碍等[3]。该病的发展可能会对骨造成不可逆性的损伤，导致骨和关节功能障碍，严重影响患者的生活质量，若治疗不及时，可能会发展为骨关节炎等严重疾病，因而早期诊断、早期治疗非常重要。因此，阐明其发病机制对于该病的防治具有重要的指导意义。已有研究表明，在糖皮质激素诱导股骨头坏死的过程中，发现骨代谢失衡与氧化应激有关[13]。抑制糖皮质激素诱导的氧化损伤，可以有效减少成骨细胞和骨细胞凋亡，保护骨组织[14]。从目前来讲，激素型骨缺血坏死的机制假说过程尚不明确，研究者们认为这是多种因素共同作用的结果，如血管假说、细胞凋亡和氧化应激等等[3]。 2.2   氧化应激   氧化应激被定义为活性氧产生和内源性抗氧化防御机制之间的失调(即氧化与非氧化作用失衡)[15]，主要表现为活性氧水平增加。活性氧包括多种活性分子和自由基，如超氧阴离子、过氧化氢和羟基自由基，在有氧呼吸过程中，其电子传递链上产生的分子可以影响细胞信号和稳态等生物功能[16]。活性氧主要来源于线粒体，具有调节细胞稳态功能和介导细胞内信号等生理作用，是调节细胞增殖、存活、代谢、凋亡、分化和迁移的必需物质[17]。过量的活性氧破坏细胞内氧化还原平衡，导致线粒体DNA突变，使细胞发生不可逆损伤，从而导致疾病发生[6，18]。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶是一种产生活性氧的酶系统。在骨骼中，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶来源的活性氧诱导成骨细胞或骨细胞的线粒体功能障碍和凋亡，从而造成成骨细胞和破骨细胞的骨稳态失衡，最终导致骨组织弱化，并可能引发骨缺血坏死[17，19-21]。氧化应激与骨稳态密切相关，活性氧过量产生导致大鼠成骨细胞凋亡，并抑制其增殖和成骨功能，最终引发骨病[22]，而使用活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸清除体内过量活性氧可逆转氧化应激诱导的成骨细胞凋亡[23-24]。 2.3   氧化应激在激素型骨缺血坏死中的作用    2.3.1   氧化应激与骨代谢   骨组织由多种细胞构成，主要包括促进骨形成的成骨细胞、促进骨吸收的破骨细胞以及成熟骨组织内的骨细胞等[25]。骨组织具有强大的自我修复能力，在正常情况下，成骨细胞和破骨细胞协同作用，共同维持骨形成和骨吸收平衡[5]。间充质干细胞可分化为成骨细胞，从而调节成骨细胞和破骨细胞之间的平衡。活性氧可以直接影响间充质干细胞、骨细胞、成骨细胞和破骨细胞的活力和功能[26-27]，见图3。 "

氧化应激对骨髓间充质干细胞的影响：骨髓间充质干细胞是一种多能性细胞，具有自我更新和多种分化潜能，它可以分化成软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞等多种细胞类型[28]。由于成骨细胞和脂肪细胞分化之间相互联系，骨髓间充质干细胞分化为一种谱系后逐渐丧失向另一种谱系分化的潜能[29]。 研究发现氧化应激诱导骨髓间充质干细胞凋亡，而使用青蒿素降低活性氧水平后，其活性得到改善[30]。此外，活性氧水平增加可诱导骨髓间充质干细胞线粒体功能障碍，促进细胞凋亡[31]。抑制活性氧生成还可促进骨髓间充质干细胞细胞周期，从而促进细胞增殖[32]。另有研究者使用白藜芦醇抑制内源性活性氧生成，发现其可促进衰老骨髓间充质干细胞的成骨分化[33]。因此，活性氧可通过诱导氧化应激，损害骨髓间充质干细胞抗氧化防御系统，对其活性、凋亡、增殖以及成骨分化产生不利影响。 氧化应激对骨细胞的影响：骨细胞是骨组织最丰富的细胞，在骨重建中发挥多种功能，包括调节成骨和破骨细胞吸收[34]。骨坏死本质上就是骨细胞的死亡，高剂量的糖皮质激素治疗增加了骨细胞凋亡[35-36]，这是骨缺血坏死的重要原因[21]。骨细胞作为一种力学传感器，在骨损伤和修复中发挥作用，其丢失会破坏骨细胞-小管网络从而破坏骨结构，糖皮质激素可以通过改变骨细胞陷窝周围骨组织的弹性模量增加骨脆性，从而影响骨细胞功能[37]。在骨重塑过程中，细胞内氧化还原状态发生变化，氧化应激抑制骨细胞活性[17]。糖皮质激素处理骨细胞可显著提高细胞活性氧水平，清除活性氧则可阻止骨细胞凋亡[26]。WANG等[38]使用特立帕肽处理骨细胞，发现其可降低糖皮质激素增加的细胞活性氧水平，促进细胞增殖。由此可见，特立帕肽通过抑制活性氧在成骨过程中发挥着重要作用。此外，KAR等[39]发现，活性氧增加导致骨细胞自噬活性下降，自噬激活为细胞抗氧化应激提供了保护，抑制自噬增加了活性氧诱导的骨细胞死亡。这些研究说明氧化应激可影响骨细胞活性、增殖及自噬等，从而介导糖皮质激素诱导的骨细胞凋亡。 氧化应激对成骨细胞的影响：成骨细胞来源于间充质干细胞，对于维持骨量和骨骼发育是不可或缺的，可分化为骨细胞并调控骨基质矿化[40-41]。在激素型骨缺血坏死中，成骨细胞凋亡且功能减退，导致骨丢失[42]。暴露在地塞米松环境下，成骨细胞内活性氧水平增加，通过抑制碱性磷酸酶、成骨特异性转录因子(Runt-related transcription factor 2，RUNX2)、Ⅰ型胶原、骨形态发生蛋白2、骨连接素和骨钙素等多种成骨标志物的表达从而导致细胞功能障碍，引起细胞死亡[18，43]。活性氧清除剂通过消除体内活性氧的产生，逆转氧化应激诱导的成骨细胞凋亡[23-24]，增加成骨细胞活性[44]，并诱导前成骨细胞的分化[45]。PENG等[46]的研究发现，地塞米松引起活性氧水平增加促进了成骨细胞凋亡，使用N-乙酰半胱氨酸消除过量活性氧显著降低细胞凋亡比例。过多生成的活性氧损伤成骨细胞的脂质和蛋白质合成，不仅导致细胞损伤和凋亡[41]，还会使得细胞周期阻滞且增殖能力下降[47]。此外，成骨细胞黏附有助于骨基质的合成和矿化[48]，活性氧过度产生会损害这一过程[49]。综上，活性氧不仅可抑制成骨细胞的增殖与分化、降低成骨活性以及增加细胞凋亡，还可影响成骨矿化能力，最终导致成骨功能障碍、骨形成降低。 氧化应激对破骨细胞的影响：破骨细胞来自造血祖细胞，是造血前体细胞衍生的多核细胞，它具有骨吸收功能。形成成熟的破骨细胞需依赖于核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL)[50]。破骨细胞的分化和活性可通过RANKL与核因子κB受体激活因子(receptor  activator of nuclear factor Kappa B，RANK)相互作用来激活，介导骨吸收[51]。破骨细胞过度活跃是糖皮质激素诱导股骨头坏死的重要原因[52]。活性氧在破骨细胞的形成和骨吸收中起着至关重要的作用，其可以控制破骨细胞的分化成熟[53]。此外，活性氧可促进破骨细胞增殖[38]。研究发现，过氧化氢可显著增加破骨细胞数量和活性[54]，而抗氧化剂则降低破骨细胞的分化和活性[17]。活性氧是骨丢失的关键要素，不管哪种活性氧清除剂都可以通过去除活性氧抑制破骨吸收。HAN等[55]使用三白草酮减少活性氧的产生，发现其显著降低与破骨相关基因如碳酸酐酶Ⅱ、基质金属蛋白酶9和抗酒石酸酸性磷酸酶表达水平，从而抑制破骨吸收。另有报道，百里醌可通过抑制活性氧生成，从而下调破骨相关基因抗酒石酸酸性磷酸酶、树突状细胞特异性跨膜蛋白等表达，抑制破骨细胞形成[56]。这些研究证实了活性氧可促进破骨细胞增殖、分化并增强其活性，从而促进破骨吸收，这可能是糖皮质激素诱导骨坏死的重要机制之一。因此，通过降低活性氧水平抑制破骨细胞增殖分化，最终起到修复坏死区骨组织的作用。 2.3.2   氧化应激对血管的影响   糖皮质激素诱导骨缺血坏死的两大基础是细胞凋亡和缺血[57]。血管作为营养提供者，它在骨组织中至关重要，并在骨重塑中发挥着重要作用。研究表明，血管异常导致血栓形成和栓塞，进而导致骨缺血坏死的发生[58]。另有研究表明，股骨头缺血坏死患者随着骨内压逐渐增高，窦道受压，静脉血管淤滞，最终引起动脉阻塞，导致骨缺血性坏死[59]。为了防止糖皮质激素诱导的骨缺血坏死，保护血管就显得非常重要。 活性氧不仅对骨代谢有调控作用，而且对血管有重要的调控作用。糖皮质激素可通过产生大量的活性氧直接作用于内皮细胞，对其造成损伤，导致骨毛细血管数量减少，凝血-纤溶系统紊乱，血栓形成，严重降低骨小梁的血供[59-60]。一氧化氮是内皮细胞衍生的舒张因子，是内皮依赖性血管舒张反应的重要血管活性物质。活性氧干扰血管内皮中的一氧化氮表达和影响血管内皮细胞合成，从而损害血管[60]。此外，缺氧诱导因子1α在血管生成中发挥着重要作用，活性氧可抑制其表达[61]。HU等[62]在高糖环境下培养骨特异性血管内皮细胞，发现细胞内活性氧水平增高，缺氧诱导因子1α和成骨调节因子均表达下降，而在使用抗氧化剂后细胞功能障碍得以改善，这表明活性氧诱导的血管内皮细胞损伤可造成血管数目减少和功能障碍，进而损害血管和骨生成的偶联机制，从而导致骨形成受损。由此可知，活性氧可通过损伤血管介导糖皮质激素诱导的骨缺血坏死。血管生成可为坏死区骨组织修复提供养料，从而在修复骨坏死过程中发挥重要作用。但由于氧化应激在联系血管生成和骨生成方面的具体机制有待进一步阐明，因此，后续研究可将其作为激素性股骨头坏死的研究重点。 2.4   活性氧通过信号通路影响骨坏死   根据相关实验研究表明，目前氧化应激在激素性骨坏死骨组织修复过程中有多条信号通路参与，其中主要以干预Wnt/β-catenin、MAPK、核转录因子κB等通路来促进骨吸收、抑制骨形成，从而降低骨量，见图4。 "

2.4.1   Wnt/β-catenin信号通路   Wnt/β-catenin信号通路又称为典型的Wnt信号通路，是一个进化保守的信号轴，参与细胞的分化、增殖和凋亡等生理过程[63]，该信号通路参与调节成骨细胞和骨细胞[64-65]。在Wnt配体缺失的情况下，胞质β-catenin被磷酸化，磷酸化的β-catenin被蛋白酶体系统进一步泛素化并迅速降解，以防止在细胞质积累；Wnt配体存在时，细胞质中蓄积β-catenin，可易位到细胞核，与相关转录因子结合启动成骨细胞分化相关基因转录[63，66-69]。升高的活性氧通过转移β-catenin池，抑制成骨分化并导致骨细胞和成骨细胞凋亡增加[20，70]。此外，活性氧还可通过增强叉头盒O表达，减弱小鼠成骨细胞祖细胞中β-catenin转录，抑制Wnt/β-catenin信号通路，从而降低成骨细胞增殖，减弱骨形成[71]。这些研究提示，活性氧可通过直接或间接作用于Wnt/β-catenin信号通路，从而参与糖皮质激素诱导的骨缺血坏死。由此可见，活性氧通过介导Wnt/β-catenin信号通路，无论在细胞增殖、凋亡方面，还是结合骨组织工程应用上，对于治疗激素性股骨头坏死都具有十分重要的研究价值。 2.4.2   MAPK信号通路   MAPKs是丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶的一个家族，其家族成员包括细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERKs)、c-JunN端激酶(c-Jun N terminal kinase，JNKs)和p38 MAPKs，参与信号转导、细胞分化、增殖、凋亡和免疫应答等[72-73]。ERK和p38 MAPKs可磷酸化成骨细胞分化的主要调控因子RUNX2，从而促进成骨分化；而JNK在破骨细胞的凋亡、形成和分化中发挥着重要作用[74-75]。此外，MAPK/EPK信号通路参与间充质干细胞的增殖、存活及分化过程，激活该信号通路可促进细胞增殖，提高细胞活力[76]，若该通路失活可阻断成骨细胞分化，促进间充质干细胞分化为脂肪细胞[77]。活性氧可以抑制MARK磷酸酶，从而提高MARK表达[41]。在原代成骨细胞和骨髓间充质干细胞中，过氧化氢通过刺激ERK1/2磷酸化，导致成骨细胞分化受损[78]。氧化应激还可通过激活JNK，p38和ERK1/2介导RANKL刺激的破骨细胞分化[79]。由此可见，氧化应激通过调节MAPK信号通路调节骨稳态，从而参与糖皮质激素诱导的骨坏死过程。 2.4.3   核转录因子κB信号通路   核转录因子κB由一系列转录因子组成，包括p65/RelA，RelB，cRel，p50和p52，在炎症、免疫、细胞增殖、分化和生存中发挥关键作用[80]。有研究发现，核转录因子κB信号通路的激活与糖皮质激素相关股骨头坏死密切相关[81]。核转录因子κB是一种重要的氧化还原敏感转录因子，可调节破骨细胞和成骨细胞，在骨形成和骨吸收中发挥重要作用[82]，抑制核转录因子κB可导致骨形成增加和骨吸收减少[83]。RANKL是核转录因子κB信号通路的重要调控因子[84]，其可通过诱导核转录因子κB活化，刺激破骨细胞标记基因的表达，从而促进破骨细胞前体细胞分化形成成熟的破骨细胞[83，85]。RANKL刺激破骨细胞产生活性氧，用抗氧化剂预处理破骨细胞可降低RANKL诱导的核转录因子κB的激活[86]，表明RANKL通过活性氧诱导核转录因子κB活化促进破骨形成。活性氧还可通过激活核转录因子κB，促进破骨细胞形成和活性[87]。有研究发现，作为一种强抗氧化剂，硫辛酸可以通过抑制活性氧产生和核转录因子κB的活化，从而抑制RANKL诱导骨髓前体细胞中破骨细胞生成[88]。核转录因子κB活性主要由核因子κB抑制蛋白调控，活性氧通过核因子κB抑制蛋白α(NF-kappa-B inhibitor alpha，IKBα)磷酸化来激活核转录因子κB[89]。已有研究表明，谷胱甘肽过氧化物酶过表达导致活性氧水平下降，通过抑制IKB-α磷酸化，破坏磷酸化IKB-α的特异性蛋白水解，从而导致核转录因子κB激活[90]。综上所述，文章认为活性氧在核转录因子κB信号交流网络中，可通过传递RANKL来调节破骨细胞的生物活动，介导破骨生成，最终可能导致骨缺血坏死等疾病发生。 2.4.4   其他信号通路   除上述通路外，活性氧还可通过磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶/蛋白激酶B(Phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)、激活转录因子(Activating transcription factor，ATF)等信号通路参与激素型骨缺血坏死的过程[20，91]。例如，PI3K/AKT信号通路参与细胞增殖、分化、侵袭和凋亡等过程[92]。PI3K的激活导致AKT的磷酸化和激活，AKT通过增强抗凋亡蛋白的表达和抑制促凋亡蛋白的活性来促进细胞存活[93]。激活PI3K/AKT信号通路是大鼠成骨细胞增殖分化的必要条件[94]，通过使用具有较强抗氧化活性的四甲基吡嗪预处理，FANG等[95]发现其促进骨髓间充质干细胞中p-AKT的表达。这证明PI3K/AKT信号通路参与了四甲基吡嗪对抗氧化应激诱导的骨髓间充质干细胞凋亡。CHEN等[96]也指出，ATF-3在刺激活性氧产生后，促进了小鼠成骨细胞中RANKL基因表达增加。由此可知，无论是体内还是体外实验，皆证实了在氧化应激的条件下，许多关键通路参与骨细胞的增殖、分化和凋亡。每种途径都代表一种潜在的治疗方法，可通过这些信号通路进一步研究设计防止骨丢失的抗氧化策略。 2.5   氧化应激与骨形成    2.5.1   活性氧对骨形成的影响   活性氧不仅可以通过诱导氧化应激直接作用于骨髓间充质干细胞、骨细胞和成骨细胞，损害其抗氧化防御系统，还可以通过介导Wnt/β-catenin、MAPK和PI3K/AKT信号通路抑制骨形成：①活性氧增加可诱导MAPK磷酸化，导致成骨细胞功能受损；②活性氧可通过减弱成骨细胞中β-catenin转录，抑制Wnt/β-catenin信号通路，从而减弱骨形成；③PI3K的激活导致AKT磷酸化和激活，AKT通过增强抗凋亡蛋白的表达和抑制促凋亡蛋白的活性来促进细胞存活。活性氧可通过介导PI3K/AKT信号通路参与骨缺血坏死的发生。氧化应激对骨形成影响汇总表，见表1。 "

2.5.2   活性氧与骨吸收的关系   活性氧可通过促进破骨细胞的形成和增加破骨细胞活性来调节骨吸收：①RANKL与RANK相互作用可刺激破骨细胞的分化及活性，过量的活性氧可通过上调RANKL的表达促进骨吸收；②RANKL是核转录因子κB信号通路的重要调控因子，其可通过活性氧诱导核转录因子κB活化，刺激破骨细胞标记基因的表达，从而促进破骨细胞分化成熟；③氧化应激通过调节MAPK信号通路调节骨代谢，其可通过激活JNK、p38 MAPKs和ERK1/2介导RANKL刺激的破骨细胞分化；④活性氧水平增高导致氧化还原失衡，破骨细胞形成及活性增加；使用抗氧化药物下调活性氧水平，可抑制破骨细胞形成，减少骨吸收。氧化应激对骨吸收影响汇总表，见表2。"

2.5.3   氧化应激在联系血管生成和骨生成方面发挥着重要作用   ①血管内皮细胞通过释放多种舒缩因子如一氧化氮来调节血管张力，而活性氧可干扰血管内皮中一氧化氮表达，影响血管内皮合成，进而损害血管；②缺氧诱导因子1α促进血管生成，而活性氧可抑制其表达，损伤血管内皮细胞，进而损害血管和骨生成的偶联机制，从而损伤骨形成。氧化应激对血管化影响汇总表，见表3。"