2.1   构建 ceRNA 调控网络相关 RNAs 分子特点和生物学功能   2.1.1   lncRNA分子特点和生物学功能   lncRNA是长度通常超过200个核苷酸的非编码RNA[17]，在人类中发现了30 000-60 000个lncRNAs[18]。lncRNA的生物发生过程类似于信使RNA，在RNA聚合酶Ⅱ酶作用下转录，并像信使RNA一样经历选择性剪接过程，最终成熟的LncRNA转录物具有5’-端7-甲基鸟甘三磷酸(m7GTP)帽子结构和3’-端多聚腺苷酸(ployA)尾巴结构，通常位于细胞核和细胞质[19-22]。 起初，lncRNA被认为是基因组转录的“噪音”，没有生物功能，其作用机制仅为原位调节，通过募集和形成染色质修饰复合物，沉默相邻基因的转录[23]。随着更多检测技术应用于RNA研究，逐渐被发现lncRNA可以与蛋白质、DNA和RNA相互作用，以调节许多生物过程[24]。基于这些功能的性质，lncRNA 可能是不同的功能分子，包括作为信号、指导、支架、诱饵和海绵，从而在染色质重塑、转录调节、RNA剪接、翻译调节、凋亡、自噬、细胞增殖、细胞分化和信号通路等基因表达调控的所有级别中发挥重要作用[25-28]，甚至一些lncRNA可被翻译成功能肽[29]。因此，lncRNA 具有多效性，可以被视为基因组的“主要调节剂”[30-31]，见图4。"

2.1.2   circRNA分子特点和生物学功能   circRNA是一类不具有5’末端m7GTP帽子和3’末端poly(A)尾巴结构，以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。是由前体mRNA(pre-mRNA)经历剪接体剪切产生线性mRNA，并在RNA聚合酶Ⅱ(RNA Pol II)反向剪接作用下生成的连续闭环结构[32] 。目前，已阐明了3种公认的外显子环状RNA形成模型：套索驱动环化(外显子跳跃)、内含子配对驱动环化(直接反向剪接)和RNA结合蛋白(RBP)驱动环化[33-35]。在形成过程中，当外显子CircRNA 从信使 RNA 前体中释放出来并保留内含子序列时，则形成包含外显子和内含子序列的外显子-内含子环状RNA，其主要位于细胞核中；若未保留内含子序列，则形成仅有外显子序列的外显子环状RNA，该种类型最为丰富，占总CircRNA的80%以上，主要位于细胞质中，可通过外泌体运输。通过规范剪接从内含子套索产生的 circRNA 被称为内含子环状RNA，主要位于细胞核中，但由于分支酶作用，它们往往会降解，所以其含量最少，因此 circRNA根据其来源可分为3类：外显子组成的外显子环状RNA、内含子组成的内含子环状RNA以及由外显子和内含子共同组成的外显子-内含子环状RNA[36-37]。 由于circRNA是闭环结构，缺少游离的5’末端m7GTP帽子和3’末端poly(A)尾巴，使得它们对核酸外切酶具有抗性，因此，与线性形式RNA相比，circRNA含量更丰富(约为线性RNA的10倍)且高度稳定[38]。除此之外 circRNA还具有细胞和组织特异性、保守性和普遍性[39-40]。目前，已发现circRNA具有多种生物学功能，circRNA可作为ceRNA，发挥miRNA海绵功能[41-43]、与 RNA 结合蛋白相互作用影响其功能和转位[44]、参与调控基因转录[45]、编码蛋白质等功能[46]。见图5。"

2.1.3   假基因分子特点和生物学功能   假基因中存在过早的终止密码子、基因缺失或插入以及移码突变，这些突变的积累导致了其功能丧失，因此，假基因曾被认为是基因“垃圾”[47]。JACQ等[48]首次提出“伪基因”一词，他们报告了非洲爪蟾中存在一组与5S DNA同源的未转录基因组序列，之后，随着分析技术的不断进步，已发现约16 000个已识别的假基因中有10%被转录，约19%的已知人类lncRNAs是假基因转录的产物[49-51]。近年来获得的实验数据也揭示了假基因在调控其相应的亲本基因和各种生物学机制中的重要性。根据来源，假基因可分为2大类：重复假基因和反转录假基因[52]。重复假基因由DNA复制和突变或缺失累积产生；反转录假基因，也被称为加工假基因，是通过将加工过的mRNA反转录到基因组中而产生的。越来越多的证据表明，假基因可以通过与蛋白质、RNA和DNA水平的分子相互作用调节基因表达。 2.2   ceRNA 调控网络在骨性关节炎中的调控作用   骨性关节炎是一种全关节疾病，以往骨性关节炎被认为是一种简单的“磨损”疾病。关节上的慢性超负荷和生物力学受损会导致关节软骨的破坏和由此产生的炎症，进而导致僵硬、肿胀疼痛和丧失活动能力[53]。然而随着研究深入，新的见解表明，骨性关节炎实际上是一个由关节损伤和修复不平衡引起的动态过程。骨性关节炎有许多可改变和不可改变的危险因素：遗传易感性、年龄增长、肥胖、损伤、性别和生活方式因素，这些危险因素的共同作用致使软骨代谢稳态失调进而关节软骨的结构完整性遭到破坏。骨性关节炎具体发展过程涉及构成骨性关节炎微环境的多个细胞和分子，关节软骨细胞(软骨的主要细胞成分)的功能障碍在骨性关节炎期间发挥不可或缺的作用。在初始阶段，细胞外基质的分子组成和结构发生改变，而软骨表面保持完整。同时，在生长因子、缺氧诱导因子1α和生长分化因子5等分子刺激下，软骨细胞开始获得活跃的增殖能力，并诱导基质分泌，修复细胞外基质。然而，增殖的软骨细胞可能产生大量的分解代谢酶和促炎递质，最终导致软骨细胞凋亡以及细胞外基质降解，进而软骨被破坏，功能失调，形成恶性循环。随后，骨赘形成、肌肉损伤和肌腱破坏也随之出现[54-55]。骨性关节炎疾病进展涉及了细胞衰老、机械负荷超载、炎症成分增加、代谢改变等病理过程，这些机制表型彼此相互重叠交叉，进而导致骨性关节炎的发生，因此骨性关节炎可被视为一种综合征，而不是一种单一疾病[2]。随着测序技术的不断发展，人们发现ceRNA 网络中分子之间的相互调控在骨性关节炎发病机制中扮演着重要的角色。lncRNA、circRNA 和假基因可作为 ceRNA，通过“海绵”作用吸附miRNA，抑制miRNA与下游靶基因的结合，进而参与骨性关节炎软骨细胞的增殖、凋亡和自噬、细胞外基质的合成与降解以及炎症事件的发生，见图6。"

2.2.1   lncRNA作为内源性竞争因子在骨性关节炎中的调控作用   随着RNA测序技术的进步，已经发现了许多潜在的调节性lncRNA，它们可能在骨性关节炎发病机制以及骨和软骨的正常发育中发挥重要作用[56]。微阵列研究表明，与健康软骨组织相比，骨性关节炎软骨组织中存在许多lncRNA异常表达，表明lncRNA将可能成为预防和治疗骨性关节炎的新诊断标记或治疗靶点[57-58]。表1列举了骨性关节炎中lncRNAs可用实例的综合分析。"

lncRNA作为ceRNA参与骨性关节炎中的许多病理过程，如细胞外基质合成与降解、细胞增殖、细胞凋亡和炎症事件。研究发现，lncRNA PVT1可作为miRNA的ceRNA，在骨性关节炎疾病进展中发挥关键作用，如细胞活力、自噬、细胞凋亡和炎症。Lu等[59]发现在骨性关节炎患者和白细胞介素1β诱导的软骨细胞中lncRNA PVT1表达增强；沉默软骨细胞中lncRNA PVT1促进细胞存活和自噬，抑制炎症反应和细胞凋亡。miR-27b-3p被确认为lncRNA PVT1的靶点，抑制其表达逆转了lncRNA PVT1敲减对白细胞介素1β诱导软骨细胞损伤的抑制作用。此外，lncRNA PVT1通过“海绵”作用吸附miR-27b-3p间接正调控TRAF3的表达。总之，lncRNA PVT1可作为ceRNA，通过“海绵”作用吸收 miR-27b-3p，减少其表达量，从而间接上调TRAF3表达，抑制细胞活力和自噬、加重白细胞介素1β处理的软骨细胞的凋亡和炎症反应。lncRNA HOTTIP是一种重要的调节性lncRNA，可作为miR-455-3p的内源性抑制剂，主要调节骨性关节炎进展中的细胞外基质破坏。MAO等[60]研究发现，在骨性关节炎软骨组织和软骨细胞以及白细胞介素1β处理软骨细胞中lncRNA HOTTIP 和 CCL3表达显著上调，miR-455-3p 表达下调，并在白细胞介素1β处理的软骨细胞中，lncRNA HOTTIP以时间和剂量依赖性方式上调。他们的研究还表明，lncRNA HOTTIP可作为ceRNA竞争结合miR-455-3p，从而提高CCL3表达水平，并且lncRNA HOTTIP过表达降低软骨寡聚基质蛋白，Ⅰ型胶原α1链和聚集蛋白聚糖的表达，增加基质金属蛋白酶和去整合素和金属蛋白酶的表达，进而促进细胞外基质降解，得出lncRNA HOTTIP/miR-455-3p/CCL3调控轴在骨性关节炎发病机制中起关键作用，提示 HOTTIP 可能是骨性关节炎的潜在治疗靶点。HU等[61]研究发现，lncRNA HOTAIR在骨性关节炎软骨组织中高度表达，并与骨性关节炎严重程度呈正相关。过表达的lncRNA HOTAIR加重了软骨细胞损伤和凋亡，抑制软骨细胞增殖，并且Western印迹分析显示，lncRNA HOTAIR的过表达提高了降解酶如基质金属蛋白酶13和ADAMS5的水平，这些酶导致细胞外基质破坏，同时降低了有助于软骨中细胞外基质形成的胶原和聚集蛋白聚糖的水平。该研究表明，lncRNA HOTAIR可作ceRNA，竞争性结合miR-17-5p，从而增加调节Wnt/β-连环蛋白途径的FUT2表达水平从而加剧骨性关节炎的发展，表明其可能作为骨性关节炎的有用生物标志物和潜在治疗靶点。ZHANG等[62]研究发现，骨性关节炎软骨组织和脂多糖诱导的软骨细胞中lncRNA ARFRP1和TLR4表达水平升高，而miR-15a-5p表达水平降低；敲除软骨细胞中的lncRNA ARFRP1抑制了炎症因子的释放，如肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和白细胞介素1β，从而抑制脂多糖诱导的软骨细胞损伤。研究还发现，抑制miR-15a-5p表达逆转了lncRNA ARFRP1敲除对脂多糖诱导的软骨细胞损伤的影响，并且其可以直接靶向抑制下游TLR4的表达水平。因此该研究表明，lncRNA ARFRP1可作为ceRNA，调节miR-15a-5p/TLR4轴参与骨性关节炎炎症事件的发生，从而诱导软骨细胞损伤，因此，lncRNA DANCR可能被视为骨性关节炎治疗的潜在治疗靶点。一项研究发现LncRNA LOXL1-AS1在骨性关节炎软骨组织中上调，其作为miR-423-5p的ceRNA参与骨性关节炎发生和进展。敲减LncRNA LOXL1-AS1的表达抑制了软骨细胞增殖和炎症反应，同时促进软骨细胞凋亡，该研究得出结论，lncRNA LOXL1-AS1可作为ceRNA，海绵吸附miR-423-5p，间接调节KDM5C的表达水平，从而参与骨性关节炎软骨细胞的增殖、凋亡和炎症事件的发生，这可能为骨性关节炎提供潜在的治疗靶点[63]。lncRNA XIST是骨性关节炎发展过程中的关键调节因子，LIU等[64]揭示了lncRNA XIST可作为miR-149-5p的ceRNA，在骨性关节炎软骨组织和白细胞介素1β处理的软骨细胞中高水平表达。此次研究的结果还表明，lncRNA XIST 的敲低可以通过 miR-149-5p/DNMT3A 轴促进细胞增殖活力，同时抑制细胞凋亡和细胞外基质降解。 综上所述，通过检测骨性关节炎患者和健康个体软骨中的lncRNA表达水平，最终可以发现多种lncRNA的表达存在差异，lncRNA 在骨性关节炎的发生发展中发挥了重要作用，主要参与骨性关节炎软骨细胞外基质的降解、软骨细胞凋亡与增殖和炎症事件。因此，lncRNA本身及其互作蛋白或靶基因有望成为骨性关节炎的早期诊断生物标志物和新的治疗靶点。 2.2.2   circRNA作为内源性竞争因子在骨性关节炎中的调控作用   随着RNA测序技术和生物信息学分析等技术的发展，越来越多的证据表明，circRNA与骨性关节炎软骨细胞增殖、凋亡、自噬、细胞外基质代谢和炎症事件发生密切相关，circRNA可以作为ceRNA，充当 miRNA 的海绵进而调控下游靶基因的活性，从而延缓或加重骨性关节炎进展。表2列举了骨性关节炎中circRNAs可用实例的综合分析。"

已有许多研究已证实circRNA在骨性关节炎患者各种组织中的异常表达并参与了骨性关节炎疾病的发生发展过程。CHEN等[65]研究发现在骨性关节炎软骨细胞和组织以及白细胞介素1β处理的软骨细胞中，circRNA-9119和PTEN显著降低，过表达circRNA-9119可抑制白细胞介素1β 诱导的软骨细胞凋亡，而过表达miR-26a可加重软骨细胞凋亡，过表达circRNA-9119结果显示miR-26表达水平下调而PTEN表达量增加。生物信息学分析显示miR-26a是circRNA-9119的靶点，PTEN是miR-26的靶点，以往研究已证实了PTEN相关途径与多种细胞的凋亡相关。所以得出结论，circRNA-9119可作为ceRNA 与miR-26结合，从而减少miR-26对下游靶基因PTEN的抑制作用，促进骨性关节炎患者软骨细胞的凋亡。 一项研究发现，在用肿瘤坏死因子α处理的软骨细胞中，hsa_circ_0045714表达显著下调，相反，miR-193b表达上调，胰岛素样生长因子1受体是miR-193b的关键靶基因，hsa_circ_0045714过表达能促进软骨细胞增殖活力、抑制细胞凋亡，并且提高聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原和胰岛素样生长因子1受体的表达水平，而所有这些效应都被miR-193b过表达所逆转。因此得出，hsa_circ_0045714可作为ceRNA，通过“海绵”作用吸附miR-193b，间接调控下游靶基因胰岛素样生长因子1受体的表达水平，参与骨性关节炎的发病过程[66]。CHEN等[67]研究发现，circRNA-UBE2G1和缺氧诱导因子1α 在骨性关节炎组织中的表达水平显著升高，circRNA-UBE2G1过表达可增加炎症因子白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的产生，敲减软骨细胞中的circRNA-UBE2G1可抑制脂多糖诱导的软骨细胞损伤的作用。miR-373抑制或缺氧诱导因子1α过表达可逆转circRNA-UBE2G1敲减效应，恢复软骨细胞增殖活力以及抑制软骨细胞凋亡。因此，circRNA-UBE2G1可作为ceRNA竞争性结合miR-373，通过 miR-373/缺氧诱导因子1α轴调控炎症因子产生以及软骨细胞的增殖和凋亡。一项研究报道hsa_circ_0005567在白细胞介素1β诱导的软骨细胞中的表达显著降低，过表达hsa_circ_0005567能够诱导软骨自噬，抑制软骨细胞凋亡，其作用机制是hsa_circ_0005567作为ceRNA，通过 hsa_circ_0005567/miR-495/ATG14轴调控软骨细胞自噬和凋亡[68]。WANG等[69]研究发现，circRNF121(has _ circ _ 0023404)在骨性关节炎软骨组织和白细胞介素1β诱导的软骨细胞中表达显著上调，circRNF121的过表达增加了基质金属蛋白酶13和ADAMS5的水平，降低了聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的合成和分泌，并且抑制软骨细胞增殖，诱导软骨细胞凋亡；而过表达miR-665可逆转这一过程，MiR-665被确定为 circRNF121和 MYD88的直接调控靶标，由此得出circRNF121可作为ceRNA竞争性结合MiR-665，解除MiR-665对抑制作用下游靶基因MYD88进而参与骨性关节炎的发生和进展。SHEN等[70]探讨了CircCDK14在骨性关节炎发生发展中的作用，结果表明CircCDK14可作为ceRNA，充当miR-125a-5p海绵而间接调控Smad2的表达水平，从而参与骨性关节炎软骨细胞细胞外基质的降解、炎症反应的发生以及软骨细胞增殖和凋亡。 综上所述circRNA在骨性关节炎进展中发挥着重要作用，因此阐明circRNA生物学对理解骨性关节炎发生的重要性变得显而易见，circRNAs的丰度、保守性、稳定性、特异性和可检测性使其成为潜在的诊断和预后生物标志物。此外，circRNAs在与骨性关节炎发生和进展中相关的各种信号通路的上游发挥着关键的调节作用，反映了其作为骨性关节炎治疗靶点的潜力。 2.2.3   假基因作为内源性竞争因子在骨性关节炎中的调控作用   目前为止已经发现假基因参与多种疾病的发生和进展， 其中假基因作为ceRNA，在基因调控中发挥重要作用，并已在多种疾病中得到证实[71]。然而，关于假基因与骨性关节炎的研究却很少。LIU 等[72]研究发现，在受损软骨中TMSB4 假基因 lncRNA-MSR的表达水平上调，lncRNA MSR的过度表达显著降低了Ⅱ型胶原α1和蛋白聚糖的表达，并促进了软骨细胞中基质金属蛋白酶13和ADAMS5的表达导致软骨细胞细胞外基质降解，miR-152可直接靶向TMSB4和lncRNA MSR，其过表达抑制了TMSB4和lncRNA MSR的表达，由此得出，lncRNA MSR可作为ceRNA，通过竞争结合miR-152来间接调节TMSB4表达水平，从而参与骨性关节炎的发生和发展，表明假基因可能在骨性关节炎发病中起到了重要的调控作用。因此，对假基因在骨性关节炎中发挥功能和作用机制进行全面和系统的研究是必要的，这将为骨性关节炎的治疗提供潜在靶点。"