膝骨关节炎时关节滑液中炎症相关物质的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.15.008

摘要/Abstract

摘要：

背景：膝骨关节炎的主要改变是关节软骨面的退行性病变和继发性的骨质增生，病变的机制还不明确，但现已有实验证实膝骨关节炎的发病与炎症相关物质有密切的关系。
目的：分析炎症相关物质在膝骨关节炎发病机制中的作用。
方法：按美国风湿病学分会制定的诊断标准选择膝骨关节炎患者60例，来自因外伤截肢或半月板损伤性手术治疗的患者(排除膝关节内损伤)60例作为对照组，抽取两组患者膝关节液，采用酶联免疫吸附试验方法检测白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素8、白细胞介素10、肿瘤坏死因子α、碱性成纤维细胞生长因子、骨桥蛋白水平，采用一氧化氮检测试剂盒检测一氧化氮水平，按TBA荧光法测定过氧化脂质浓度。
结果与结论：膝骨关节炎患者表达高水平白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素8、白细胞介素10、肿瘤坏死因子α、碱性成纤维细胞生长因子、骨桥蛋白、一氧化氮和过氧化脂质水平均明显高于对照组；这些细胞因子及一氧化氮、过氧化脂质与膝骨关节炎的病变呈正相关。结果提示这些炎症相关物质确实参与了人膝骨关节炎的发病进程。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 骨组织工程, 炎症相关物质, 细胞因子, 膝骨关节炎, 膝关节滑液

Abstract:

BACKGROUND: The main change of knee osteoarthritis is cartilaginous degeneration and secondary bone hyperplasia. The mechanism of these pathological changes is unclear, but some experiments have proved that the onset of knees osteoarthritis is closely related to inflammatory substances.
OBJECTIVE: To discuss the role of inflammatory substances in the pathogenesis of knee osteoarthritis.
METHODS: According to diagnostic criteria set by the American College of Rheumatology, we selected 60 knee osteoarthritis patients as experimental group, and another 60 patients undergoing the operative treatment of traumatic amputation or meniscus injury (except knee injury) as control group. After extracting synovial fluid samples from two groups, ELISA assay method was used to detect the levels of interleukin-1β, interleukin-6, interleukin-8, interleukin-10, tumor necrosis factor α, basic fibroblast growth factor, and osteopontin. The nitric oxide level in the synovial fluid was detected with nitric oxide detection kit. The content of lipid peroxidase was detected using TBA fluorescence method.
RESULTS AND CONCLUSION: We found higher levels of interleukin-1β, interleukin-6, interleukin-8, interleukin-10, tumor necrosis factor α, basic fibroblast growth factor, osteopontin, nitric oxide, and lipid peroxidase in knee osteoarthritis patients, and these levels were positively correlated with knee osteoarthritis. These inflammatory substances are really involved in the inflammation process of knees osteoarthritis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: Cytokines, Knee, Osteoarthritis

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 1

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引言

膝骨关节炎是影响人类健康最常见的关节疾患之一^[1]，是由于膝关节的局部损伤、炎症或慢性劳损引起膝关节软骨变性及活动障碍的慢性、退行性骨关节病，它在女性中发生的概率为10%，男性中为13%，且常发生在60岁以上的老年人^[2-3]，主要表现是关节疼痛和活动不灵活。研究表明慢性疼痛与衰老和炎症反应密切相关^[4]。细胞因子是参与免疫和炎症反应的细胞所分泌的、能调节细胞功能的小分子蛋白和多肽^[5]。一些学者认为某些细胞因子与疼痛、焦虑和疲劳有关。

膝骨关节炎的发病随年龄增长而增加，对中老年人的健康和生活质量影响也越来越大。随着社会老龄化，膝骨关节炎的发病率越来越高，据国内统计，65岁以上的老年人发病率为75%^[6]。膝骨关节炎是一种关节软骨的退行性疾病，其病因主要由机械、生物因素所致，病理过程复杂，很多环节尚未完全研究清楚^[7]。

细胞因子广泛存在于机体各种组织中，它们从分子水平上对多种疾病的发生发展起着较为重要的调节作用。膝骨关节炎的发生和发展源于基因表达的变化和活性氧产生的刺激改变了关节组分的代谢和骨吸收，使得膝骨关节部位促炎性细胞因子水平增加^[8-10]。一些研究者发现关节功能的丧失与血清及组织中促炎性细胞因子的高浓度有关^[8^，^11-13]。一项肌肉活组织检查研究，通过比较膝骨关节炎患者和健康人的肌肉强度，发现膝骨关节炎患者具有较低的肌肉强度和较高的白细胞介素6蛋白及其受体的表达，尽管差异无统计学意义，但是膝骨关节炎患者白细胞介素1和白细胞介素8的水平也有所增加^[14]。

本研究拟通过检测膝关节滑液中细胞因子水平和表达谱，分析膝骨关节炎的炎症反应过程。

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材料方法

设计：分组对照观察。

时间及地点：2013年1月至2014年10月在天津市天津医院完成。

对象：选择2013年1月至2014年10月在天津市天津医院就诊治疗膝骨关节炎的患者60例，对照组病例60例来自因外伤截肢或半月板损伤性手术治疗的患者。

诊断标准：患者均符合美国风湿病学会2001年制定的膝骨关节炎诊断标准。

纳入标准：参照美国风湿病学会2001年制定的膝骨关节炎诊断标准：①年龄≥ 50岁。②晨僵< 30 min。③关节活动时有骨响声。④膝部检查示骨性肥大。⑤有骨压痛。⑥无明显滑膜升温。⑦血沉< 40 mm/h。⑧类风湿因子(RF)< 1：40。⑨滑膜液有骨关节炎征象。⑩Kellgren- Lawrence 分级在2-4级。

排除标准：具有慢性病、其他风湿性疾病、恶性疾病、曾做过前膝关节手术、自身免疫病或活跃期传染病者。

Kellgren-Lawrence (K-L)分级标准：0级：正常；Ⅰ级：关节间隙无变窄，可疑骨赘或微小骨赘；Ⅱ级：关节间隙可疑变窄，有明显的轻度骨赘；Ⅲ级：关节间隙明显狭窄，骨质有硬化性改变，中度多发骨赘形成；Ⅳ级：关节间隙明显狭窄，严重硬化性改变及明显关节畸形，有大量骨赘形成。

方法：

关节液采集：两组患者平卧，麻醉术中应在无菌条件下并准确定位从髌骨后面行关节穿刺，避免血管损伤，抽取关节液1 mL，在采集后1 h内13 000 r/min离心20 min，留取上清液于Eppendorf管中，分成每份100 μL，-80 ℃保存，行后续细胞因子检测。

细胞因子检测：ELISA试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司，由本院实验室专人严格按说明书要求操作，定量分析白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素8、白细胞介素10、肿瘤坏死因子α、碱性成纤维细胞生长因子、骨桥蛋白的表达水平。使用CellQuest^TM (BD Biosciences)标准曲线和CBA软件分析细胞因子质量浓度(ng/L)。

一氧化氮测定：鉴于一氧化氮的物理性质不稳定，在体内外会形成亚硝酸盐和硝酸盐，故测定关节滑液标本中NO₂^-/NO₃^-含量可作为衡量一氧化氮合成的指标。本实验采用深圳晶美生物工程有限公司的一氧化氮试剂盒，按照说明书操作，检测550 nm、0.5 cm吸光度值，然后根据公式计算标本中一氧化氮浓度。

一氧化氮浓度=(测定管A值÷标准管A值)×100 µmol/L

过氧化脂质检测法：采用八木国夫TBA荧光法用DF-510型荧光分光光度计测定标本过氧化脂质水平，反映了膝骨关节炎患者关节液中自由基的变化。

主要观察指标：①两组关节液中细胞因子水平。②两组关节液中一氧化氮、过氧化脂质水平。③两组关节液中上述检测指标水平相关性分析。

统计学分析：采用Kolmogorov-Smirnov检验来调整测试所有研究变量的正态分布。两组的数量性状使用概况性指标，如平均值、标准差、中位数、最小值、最大值。细胞因子检测结果组内比较采用配对t 检验，组间比较采用两样本均数比较的t 检验，计数资料采用卡方检验，SPSS 15.0软件进行数据分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

白细胞介素1是一种致炎细胞因子，在膝骨关节炎发病过程中起着非常关键的作用，是引起软骨功能细胞衰退的细胞因子之一。白细胞介素1可分为白细胞介素1a和白细胞介素1β两种细胞因子，以白细胞介素1β为主，二者分子量非常接近，发挥生物学特性是相似的。郑琴等^[15]通过检测类风湿关节炎组和健康对照组大鼠血清白细胞介素1和白细胞介素6水平发现，两者在类风湿关节炎组呈高水平表达。动物实验研究检测到膝骨关节炎患者膝关节腔内存在高浓度的白细胞介素6，在正常细胞中未检测出白细胞介素6，在培养的骨关节软骨组织和骨性关节炎患者的软骨细胞中发现白细胞介素6的mRNA表达^[16]。因此，白细胞介素6在软骨退变和骨关节炎症中起作用。本实验研究结果显示，膝骨关节炎患者关节滑液中白细胞介素1β、白细胞介素6质量浓度分别为(96.80±8.50) ng/L、(187.96±12.30) ng/L，均明显高于对照组，且相关性分析提示，两者含量与膝骨关节炎的病程密切相关，揭示在未来膝骨关节炎患者的治疗过程中，可通过阻断白细胞介素1β和白细胞介素6的信号通路达到改善患者关节炎症状的效果。

肿瘤坏死因子α是调节膝骨关节炎疾病进程中重要的炎症递质，可促进胶原酶的产生和前列腺素释放蛋白酶活性致软骨细胞产生过氧化反应，它与白细胞介素1共同参与促进软骨的吸收^[17]。在关节炎动物模型中，关节炎软骨免疫组化染色其基质及细胞中肿瘤坏死因子α及受体均呈现阳性反应，且强度与范围和关节炎严重程度相平行^[18]。白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α这两种细胞因子都对软骨代谢产生分解代谢的作用，同时又诱导软骨细胞产生其他的炎症递质，如：白细胞介素8、白细胞介素6、一氧化氮。本研究检测出膝骨关节炎患者关节液中白细胞介素8、肿瘤坏死因子α的质量浓度为(241.80±95.43) ng/L、(358.40± 168.54) ng/L，而对照组为(52.05±12.80) ng/L、(54.32± 13.60) ng/L，两组之间存在显著性差异，表明关节液中白细胞介素8、肿瘤坏死因子α水平可以作为膝骨关节炎的炎症指标。

白细胞介素10作为抑制性细胞因子，是近年来发现的一个重要的下调细胞因子，通过反馈性的抑制某些炎症递质如白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1的分泌，使炎症控制在一定程度内^[19]。Ma等^[20]用腺病毒载体携带白细胞介素10基因，转染胶原诱导鼠关节炎模型，结果证明关节炎明显减轻。肥胖患者减肥后发现，其体内白细胞介素10和脂联素水平显著增加，而肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、抵抗素和瘦素水平明显减少，因此白细胞介素10可能对软骨和滑膜起到保护作用^[19]。本实验研究结果与上述的结果保持一致，膝骨关节炎患者关节滑液中白细胞介素10的质量浓度(116.80±9.56) ng/L明显高于对照组(18.06±3.93) ng/L，揭示在膝骨关节炎患者关节滑液炎症环境下白细胞介素10的表达水平上调，抑制相应的炎症因子的表达。

碱性成纤维细胞生长因子又称成纤维细胞生长因子2，是一种广谱的有丝分裂源，对来源于中胚层和神经外胚层的细胞具有明显的促增殖作用，不仅能够促进软骨及骨组织的形成，并且是一种强烈的毛细血管形成刺激剂^[21-22]。骨桥蛋白是一种多功能的细胞外基质蛋白，广泛存在于细胞外液以及骨组织的细胞间质，有研究显示，骨桥蛋白在类风湿性关节炎的滑膜和关节软骨中均有高水平的表达，骨桥蛋白通过调节局部细胞因子的分泌来加重类风湿关节炎病理过程中的炎症反应^[23]。动物实验表明，骨桥蛋白可通过促进毛细血管生长和诱导软骨细胞凋亡而成为关节软骨破坏的重要因素^[24]。从本研究检测结果来看，碱性成纤维细胞生长因子(43.2±9.80) ng/L和骨桥蛋白(4 290.3±1 238.4) ng/L在膝骨关节炎患者关节液中呈现高水平的表达，均与对照组有显著性差异，二者可能对膝骨关节炎患者的软骨损伤起协同作用。

一氧化氮是一种源于内皮细胞的松弛因子，一般认为一氧化氮的产生常伴有免疫功能的抑制。有研究结果表明关节滑液内大量一氧化氮的产生与关节微环境中低氧分压、pH值降低、软骨缺血、细胞因子等多种因素有关，一氧化氮可减少蛋白多糖的合成^[25-26]，加速蛋白多糖和胶原等细胞外基质的分解^[27]。同时，一氧化氮还直接参与PG2的合成，从而引起关节疼痛和抑制软骨细胞增殖^[28]。在病理刺激持续存在时，一氧化氮浓度还会继续升高，与超氧自由基反应生成超氧亚硝酸根离子ONOO^-，从而引起严重炎症反应，加强其它炎症递质如白细胞介素1、肿瘤坏死因子α对关节软骨的降解作用^[29]。

脂质过氧化代谢产物过氧化脂质的水平，可反映自由基产生的程度，而且还可指示氧化应激反应对机体损伤的程度。正如本实验研究检测结果显示，一氧化氮和过氧化脂质在膝骨关节炎患者中的浓度量分别为(5.27±0.42) μmol/L和(17.60±5.89) μmol/L，在对照组中分别为(1.40±0.20) μmol/L和(4.80±0.40) μmol/L，一氧化氮和过氧化脂质在两组之间均存在着显著性差异。这些结果揭示在关节软骨病变的过程中一氧化氮和过氧化脂质均起到关键性作用。

Ortega等^[30]认为有规律的运动可间接控制细胞因子水平。风湿性疾病患者体育锻炼的目的是改善自身状态和整体健康^[31]。因为静止状态和衰老进程与炎症的增加有关，所以适度锻炼是非常重要的^[14]。研究显示锻炼可以提高女性关节内和滑膜周围白细胞介素10蛋白及其受体表达水平，这表明锻炼是通过软骨抗炎细胞因子来保护膝骨关节炎患者^[32]。然而，膝骨关节炎患者中白细胞介素1β的表达水平与衰老引起的肌肉损耗有关^[33]。因为慢性病患者肌肉损耗相对严重，所以建议其加强体育锻炼，原因在于体育锻炼可以影响肌肉pH值和血流量^[34]。

本研究也有一定的局限性，没有测试所有的细胞因子，如白细胞介素17或白细胞介素18，进一步的研究应该是探索这些患者的其他细胞因子在膝骨关节炎患者疾病进程中的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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