软骨损伤后Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.51.020

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前Ⅰ型胶原蛋白与骨关节炎间的关系尚未被完全揭示，Ⅰ型胶原蛋白的表达模式亦未知，缺乏相关的研究来探讨上述问题。
目的：观察软骨退变过程中Ⅰ型胶原蛋白表达的模式，为进一步研究Ⅰ型胶原蛋白与骨关节炎间的关系提供参考。
方法：10只新西兰大白兔，用手术刀片在兔左下肢股骨滑车凹造一约5 mm长的纵向软骨损伤制备软骨损伤模型。造模后2，6周分别处死5只动物，取软骨损伤部位后制作石蜡切片，免疫组织化学检测损伤周围Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白的表达情况，番红O-快绿染色检测损伤周围软骨的退变情况。
结果与结论：免疫组织化学示：造模后2周后即可在软骨损伤周围检测到少量Ⅰ型胶原蛋白，6周后软骨损伤周围的Ⅰ型胶原蛋白有所增加，Ⅱ型胶原蛋白则未见明显改变。番红O-快绿染色示：2，6周软骨损伤周围均未见明显退变。结果表明，Ⅰ型胶原蛋白在骨关节炎早期即有表达，在软骨退变过程中表达逐渐增加，提示与骨关节炎的发生密切相关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 关节软骨, Ⅰ型胶原蛋白, Ⅱ型胶原蛋白, 骨性关节炎v软骨损伤

Abstract:

BACKGROUND: The relationship between collagen type I and osteoarthritis is still controversial, and expression patterns of collagen type I are not yet fully understood. There is lack of relevant research addressing the above-mentioned issues.
OBJECTIVE: To investigate the patterns of expression of collagen type I, and to contribute to the roles of collagen type I in the pathogenesis of osteoarthritis.
METHODS: The articular cartilage injury model was created in 10 New Zealand white rabbits. A 5 mm longitudinal wound was made in the middle of femoral trochlear groove using a scalpel. At 2 and 6 weeks after modeling, five animals were sacrificed, respectively. The injured articular cartilage was taken to make paraffin sections. Immunohistochemistry detection was used to detect the expression of collagen type I and type II around the injury. Safranine O-fast green staining was used to detect the distribution of proteoglycan around the injury.
RESULTS AND CONCLUSION: Results from the immunohistochemistry detection showed that a small amount of collagen type I was detected around the injury at 2 weeks after modeling, and there was much more collagen type I around cartilage injury at 6 weeks after modeling, but collagen type II had no obvious changes. Under the safranine O-fast green staining, no remarkable degeneration was found around the injured cartilage. These findings indicate that collagen type I has been increased in the early period of osteoarthritis. Expression of collagen type I is increased during the degeneration of articular cartilage, indicating a close relationship between collagen type I and osteoarthritis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: collagen type I, collagen type II, knee joint, cartilage, rabbits

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 3

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2013年6月至12月在苏州大学骨科研究所完成。

材料：

实验动物：新西兰大白兔10只，兔龄16周，体质量为 2.0-2.5 kg，雌雄不拘，笼中饲养，自由饮食、喝水、活动。

实验方法：

软骨损伤模型制备：以体积分数10%的水合氯醛 (3.2 mL/kg)麻醉动物，剔除毛发，安尔碘消毒皮肤3 min，取膝关节前内侧切口，锐性分离皮下组织，沿髌韧带内侧缘切开关节囊，暴露股骨滑车凹；用刀片直视下在软骨上制作一长约5 mm深度0.3 mm的划痕，碘伏生理盐水冲洗，顺序缝合关节囊、筋膜皮肤。术后8×10⁴ U/kg青霉素肌肉注射1周，预防伤口感染。

取材及处理：于术后2，6周过量水合氯醛耳缘静脉注射法分别处死动物中的5只，取下术侧膝关节置于体积分数4%的甲醛中固定48 h，后置于10%EDTA溶液(pH 7.2-7.3)中脱钙6周。将脱钙完全的组织梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，石蜡切片机5 μm切片。

兔软骨组织中Ⅰ型胶原蛋白相对含量测定：每个标本行两张行免疫组织化学染色(Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白)，IPP图像分析软件对免疫组织化学图形进行吸光度分析，检测Ⅰ型胶原蛋白的相对含量。

番红-O染色过程： ①二甲苯脱蜡。②无水乙醇、体积分数95%乙醇各3 min。③蒸馏水浸洗冲洗3 min。④苏木精染色5 min。⑤流水冲洗。⑥快绿染色7 min。⑦0.1%番红-O染色8 min。⑧体积分数95%乙醇浸洗。⑨无水乙醇 3 min×2次。⑩二甲苯透明。?中性树胶封固。

Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白免疫组织化学： ①55 ℃恒温箱烤片20 min。②二甲苯脱蜡30 min，梯度乙醇水化。③室温下置于体积分数1% H₂O₂中30 min除去内源性过氧化氢酶。④37 ℃透明质酸酶1 h、链霉素蛋白酶20 min进行抗原修复。⑤体积分数1.5%正常马血清封闭，常温，30 min。⑥滴加一抗(1∶800) 37 ℃ 60 min。⑦PBS浸洗5 min×3。⑧滴加二抗，常温30 min。⑨PBS浸洗5 min×3。⑩滴加三抗，常温，30 min。?PBS浸洗5 min×3。?DAB显色2 min。?苏木精复染5min。?乙醇脱水。?二甲苯透明。?中性树胶封固。

主要观察指标： ①Ⅰ型胶原蛋白免疫组织化学结果。②Ⅱ型胶原蛋白免疫组织化学结果。③番红O-快绿染色结果。

统计学分析：运用IPP 6.0图像分析软件对Ⅰ型胶原蛋白免疫组织化学吸光度值进行分析，数据以x(_)±s表示。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

关节软骨是骨表面的一层间质丰富、细胞少的黏弹性物质。其主要由胶原蛋白及蛋白聚糖等成分组成，其中Ⅱ型胶原占胶原总数的80%-90%^[7-8]。在正常的软骨中Ⅰ型胶原蛋白的含量甚微，已有研究发现在骨性关节炎模型关节软骨中Ⅰ型胶原蛋白含量增加。诸多学者对Ⅰ型胶原蛋白与骨关节炎间的关系进行了研究，Goldwasser等^[9]在骨性关节炎软骨中发现Ⅰ型胶原蛋白mRNA，但是Ronziere等^[10]既未在骨关节炎软骨中检测到Ⅰ型胶原蛋白的mRNA，也未检测到蛋白。

后来的研究证明了骨关节炎软骨确实有Ⅰ型胶原蛋白，Miosge等^[11]用生物化学法在晚期骨关节炎软骨中检测到Ⅰ型胶原蛋白。本实验在兔软骨损伤周围检测到Ⅰ型胶原蛋白，与上述研究结果相符，此外还发现随着时间的增加Ⅰ型胶原蛋白有逐渐增加的趋势。

本实验运用免疫组织化学法检测Ⅰ型胶原蛋白，Ⅰ型胶原蛋白在2周组软骨损伤周围即可检测到，Ⅰ型胶原蛋白免疫组织化学结果可明确证实；6周后损伤周围的Ⅰ型胶原蛋白稍有增加，可看出随着时间的增加Ⅰ型胶原蛋白有增加的趋势，这说明表型发生改变的软骨细胞正日趋增加，软骨退变可能在表型发生改变的软骨细胞超过一定水平时发生，而Ⅰ型胶原蛋白则可能伴随整个过程。然而，Ⅱ型胶原蛋白的表达并未发生明显的改变，2周组与6周组Ⅱ型胶原蛋白的比较未见明显差异，番红-O染色稍见改变，这说明发生表型改变的软骨细胞数量所占的比重还很小，只有当表型改变的软骨细胞达到一定比例Ⅱ型胶原蛋白的表达才能显示出差异，届时软骨即发生明显的退变。实验结果显示软骨损伤2周即有Ⅰ型胶原蛋白产生，发现Ⅰ型胶原蛋白的时间有所提前，结合前人发现晚期骨关节炎软骨中检测到Ⅰ型胶原蛋白可推断出Ⅰ型胶原蛋白的产生是伴随着骨关节炎整个病程中的，这一发现更加确定了Ⅰ型胶原蛋白在骨关节炎发病机制中的作用。此外，本实验还发现Ⅰ型胶原蛋白的产生是由局部开始向其余部位逐渐蔓延，软骨损伤部位的中下段最先出现，Ⅰ型胶原蛋白产生的过程与软骨退变的过程很可能是一致的。

正常的软骨细胞分泌的胶原蛋白以Ⅱ型胶原蛋白为主，Ⅰ型胶原蛋白的分泌微乎其微^[12-13]，可见在骨性关节炎病程中软骨细胞的表型发生了变化，由以分泌Ⅱ型胶原蛋白为主转变为以Ⅰ型胶原蛋白为主，作为骨性关节炎经典的动物模型前交叉韧带切断(anteriorcruciate ligament transection，ACLT)动物模型被广泛应用于实验研究^[14-18]，然而，这种动物模型骨性关节炎进程较快，在前交叉韧带切断后2周软骨即发生改变，无法观察软骨分泌Ⅰ型胶原蛋白的变化模式。

本实验采用软骨划痕这种软骨损伤模型，来观察软骨损伤后Ⅰ型胶原蛋白表达的过程。Marijnissen等^[19]在比格犬关节软骨上造划痕的方法成功制造了骨性关节炎模型，软骨退变的过程较为缓慢，较适合于研究早期骨性关节炎及软骨退变的缓慢过程。这种模型软骨胶原的软骨机构的完整性及功能被认为主要依赖于二型胶原蛋白分子及周围基质^[20-21]。Ⅱ型胶原蛋白形成的网状结构遭到破坏被认为是骨性关节炎发生过程中的重要环节^[22-23]，软骨的这种框架结构被破坏后会引发软骨生物力学、生物化学等一系列变化^[24-26]。Ⅱ型胶原蛋白、蛋白聚糖等组织构成了软骨细胞生存的微环境，在Ⅱ型胶原蛋白构成的网状结构被破坏后，软骨细胞所生存的微环境遭到了破坏，由此引发的一些列变化^[27]，刺激了软骨细胞的表型发生了改变^[28-29]。胶原蛋白的分泌情况发生改变，Ⅰ型胶原蛋白的表达上调即是其中重要的改变之一。

Ⅰ型胶原蛋白分子可通过整合素、盘蛋白结构域受体、糖蛋白等跨膜受体向细胞传递信号，从而起到信号分子的作用^[30-31]，骨性关节炎病程中软骨细胞表型的变化很可能与Ⅰ型胶原蛋白的这种信号分子作用有着密切的关系。

在骨性关节炎早期，软骨细胞所生存的微环境正逐渐发生改变，某种条件发生改变诱导软骨细胞I 型胶原蛋白分泌增加，产生的Ⅰ型胶原蛋白不断的向周围细胞内传递、放大外界环境改变的信号，促进软骨细胞表型的变化，加速软骨的退变。

最近有报道称，转化生长因子β 能增强Ⅰ型原蛋白的生物合成，在组织修复的病理生理过程中发挥重要作用^[32]。已有研究显示转化生长因子β与骨关节炎的发生密切相关在骨关节炎病程中转化生长因子β的分泌明显增加^[33-34]，在损伤发生后Ⅰ型胶原蛋白增加试图修复损伤的软骨，在修复的同时把外界环境改变的信号传导至细胞内诱导软骨细胞发生表型的变化。

Ⅰ型胶原蛋白主要存在于骨、肌腱、韧带等组织中，这些组织的特性与关节软骨完全不同，具有抵抗高强度暴力的特性，弹性模量与关节软骨相差很大^[35]。这些组织的特性是由Ⅰ型胶原蛋白决定的，当关节软骨中Ⅰ型胶原蛋白的含量增加，关节软骨的弹性模量等参数必将发生变化^[36]，致使软骨正常的缓冲关节压力的性能发生改变，最终软骨的局部受力增加，使软骨更容易遭到破坏。

本实验发现在Ⅰ型胶原蛋白出现的部位并未见Ⅱ型胶原蛋白的明显减少，这可能是Ⅰ型胶原蛋白异常表达先于Ⅱ型胶原蛋白的表达；或者Ⅱ型胶原蛋白的表达先于或者同步于Ⅰ型胶原蛋白的表达，由于软骨中Ⅱ型胶原蛋白本身所占比重较多，故少量减少无法明显用免疫组织化学法来检测出。

本实验的研究意义在于，在软骨局部制造软骨损伤，观察软骨损伤周围Ⅰ型胶原蛋白逐步向周围蔓延的过程。通过对于这一过程的观察来验证以上的假设，从而更深一步证明Ⅰ型胶原蛋白在骨关节炎发病机制研究中的重要性。也为骨关节炎治疗的研究提供假想，更深入的研究Ⅰ型胶原蛋白产生机制，通过抑制Ⅰ型胶原蛋白的表达，达到延缓甚至消除骨关节炎的目的。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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