乙酰肝素酶在股骨头坏死骨组织及外周血中的表达及意义

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.20.021

摘要/Abstract

摘要：

背景：大量研究表明低分子肝素可预防和治疗早期股骨头坏死，但其作用机制尚未阐明。肝素在体内与乙酰肝素酶呈动态平衡状态，可抑制其表达水平。
目的：观察乙酰肝素酶及组织因子途径抑制剂在股骨头坏死患者的股骨头坏死骨内及外周血液中蛋白表达的变化，探讨乙酰肝素酶在股骨头坏死中的病理生理作用及意义。
方法：选取特发性股骨头坏死患者36例为实验组，按照国际骨循环研究会(ARCO)分期Ⅰ-Ⅳ期分为4组，每组9例；选取新鲜股骨颈骨折行髋关节置换患者9例做对照组；治疗前抽取患者外周静脉血，测定血浆乙酰肝素酶及组织因子途径抑制物含量；治疗中取ARCOⅡ-Ⅳ组股骨头内坏死骨组织，行Western Blot蛋白定量，行病理学苏木精-伊红染色观察。
结果与结论：股骨头坏死患者血浆中的乙酰肝素酶、组织因子途径抑制物表达含量较对照组增加，随在病程进展而呈弧形改变，其中ARCOⅢ期含量最高，Ⅳ期含量稍显下降，组间差异有显著性。坏死股骨头局部的乙酰肝素酶、组织因子途径抑制物蛋白表达较对照组增强，在ARCO Ⅲ期含量最高，Ⅱ、Ⅳ期中蛋白表达无明显差异。结果表明乙酰肝素酶及组织因子途径抑制剂在股骨头坏死患者中随着坏死程度的发展表达逐渐增高，在股骨头坏死中发挥重要作用。

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关键词: 组织构建, 骨组织工程, 股骨头缺血性坏死, 乙酰肝素酶, 组织因子途径抑制剂, 组织因子

Abstract:

BACKGROUND: Accumulating evidence shows that, low molecular heparin can prevent and treat early osteonecrosis of femoral head, but the mechanism remains unclear. The heparin exhibits a dynamic balance with heparanase in vivo, and inhibits heparanase expression.
OBJECTIVE: To observe the changes of heparanase and tissue factor pathway inhibitor expression level in plasma and femoral head of patients with idiopathic osteonecrosis of femoral head, and investigate the pathophysiological role of heparanase in the progression of idiopathic osteonecrosis of femoral head.
METHODS: A total of 36 patients with idiopathic osteonecrosis of femoral head were randomly divided into four groups according to ARCO I-IV period, with nine patients in each group. Patients with fresh femoral neck fracture for hip arthroplasty were included in the control group. Heparanase and tissue factor pathway inhibitor levels in preoperative venous plasma were measured by ELISA, and in subchondral necrosis bone of ARCO II-IV groups were observed for western blot analysis and hematoxylin-eosin staining.
RESULTS AND CONCLUSION: In plasma, heparanase and tissue factor pathway inhibitor levels were significantly increased along with the development of idiopathic osteonecrosis of femoral head compared with control group, the highest levels were found in ARCO III period, and then slightly decreased in ARCO IV period, showing significant differences. The protein levels of heparanase and tissue factor pathway inhibitor in necrosis bone were increased significantly compared with control group, the highest levels occurred in ARCO III period, no obvious difference was found between ARCO II and IV periods. Heparanase and tissue factor pathway inhibitor levels are gradually increased along with the development of the necrosis, and heparanase plays an important role in idiopathic osteonecrosis of femoral head.

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Key words: femur head necrosis, heparin lyase, femoral neck fractures, arthroplasty, replacement, hip

中图分类号:

R318

田凯旋，韩永台. 乙酰肝素酶在股骨头坏死骨组织及外周血中的表达及意义[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(20): 3230-3235.

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图/表（结果） 1

2.1 参与者数量分析纳入患者特发性股骨头坏死患者36例，股骨颈骨折患者9例，治疗过程无脱落，全部进入结果分析。

2.2 患者术前血浆中乙酰肝素酶与组织因子途径抑制物表达股骨头坏死患者术前血液中乙酰肝素酶与组织因子途径抑制物含量增高，在ARCOⅠ-Ⅲ期中逐渐增加，ARCO Ⅳ期有所降低。在ARCOⅡ、Ⅲ期中含量最多，两组之间差异无显著性意义，均与其他3组之间差异有显著性意义。ARCOⅠ期中含量高于对照组及ARCO Ⅳ期，差异有显著性意义。对照组及ARCO Ⅳ期比较差异无显著性意义，但ARCO Ⅳ期表达趋势较高。见图1。

2.3 两组患者患侧股骨头组织中乙酰肝素酶与组织因子途径抑制物表达股骨头局部中乙酰肝素酶与组织因子途径抑制物表达较对照组增加(图2A)，其表达趋势为ARCOⅡ、Ⅲ期中增高，在ARCO Ⅳ期有所降低，均较对照组高(图2B，C)。乙酰肝素酶的表达在ARCO Ⅱ-Ⅳ期中明显高于对照组，差异有显著性意义。ARCO Ⅲ期表达显著性高于ARCOⅡ期。组织因子途径抑制物表达中ARCO Ⅲ期高于ARCO Ⅱ期及对照组，差异有显著性意义。

2.4 两组患者股骨头组织病理学检查结果对照组：骨小梁完整，排列规则，骨小梁中骨细胞清晰可见，空骨陷窝少见，造血细胞丰富，脂肪细胞相对较少，形态正常。实验组：股骨头坏死组织髓腔组织中脂肪细胞直径增大，大量脂肪细胞堆积，造血组织在髓腔中的比例变小，骨小梁变稀、变细，随着坏死程度加重部分骨小梁断裂，有骨碎片出现，空骨陷窝明显增多，髓腔脂肪细胞肥大，有的相互融合成泡状，至ARCO IV期骨髓腔内造血组织明显减少，骨小梁结构紊乱，广泛地骨小梁断裂、稀疏、纤细，可见大量的空骨陷窝(图3)。

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引言

股骨头坏死是股骨头血供中断或受损，引起骨细胞及骨髓成分死亡及随后的修复，继而导致股骨头结构改变，股骨头塌陷，引起患者关节疼痛、关节功能障碍的疾病，是骨科领域常见的难治性疾病^[1-2]。可分为创伤性和非创伤性两大类，前者主要是由髋部外伤引起，如股骨颈骨折和髋关节脱位等，创伤直接破坏了股骨头的血供，导致骨细胞发生缺血、缺氧，直至骨细胞、骨髓细胞死亡^[3]；后者在主要病因为皮质类固醇激素的应用、酗酒和特发性等^[4-6]，短期内大剂量摄入激素引起全血黏度、血浆黏度及总胆固醇明显升高、血液呈高凝滞状态，形成微血栓、髓内微循环障碍，进而引起组织缺氧、水肿和骨内压升高，从而导致股骨头坏死^[7-8]。酒精可诱导骨髓基质间充质干细胞分化为脂肪细胞，使修复坏死骨的成骨细胞数量减少^[9]，造成骨髓内脂肪组织堆积，引起骨内压增高，血流减少，导致骨坏死；特发性股骨头坏死无明显诱因与基因多态性等因素密切相关^[10-11]，占非创伤性股骨头坏死的15%-20%，其发病机制与脂肪栓塞和微血栓有关^[12]。

有学者提出股骨头坏死病理生理机制中脂肪栓塞、血管内凝血和骨坏死三者往往共存，最终表现为血管内凝血^[13]，作为一个共同通路导致股骨头坏死^[14]。现阶段大量实验研究证明低分子肝素可有效预防和治疗早期股骨头坏死，减少股骨头内空骨陷窝数^[15-17]，但尚未阐明其作用机制，肝素在体内与乙酰肝素酶呈动态平衡状态，可强烈抑制其表达水平。

乙酰肝素酶是哺乳动物细胞中硫酸肝素蛋白多糖侧链-硫酸乙酰肝素的内源性糖苷酶，硫酸肝素糖蛋白是细胞外微环境的主要成分，乙酰肝素酶的天然底物。乙酰肝素酶通过降解硫酸肝素糖蛋白的硫酸乙酰肝素侧链，改变细胞外基质的结构，提高炎症和肿瘤细胞的游走转移性，增加硫酸乙酰肝素结合因子的释放，加速血管生成，从而在血管生成、炎症反应以及肿瘤转移等许过程中发挥重要作用^[18-19]，过高的表达预示炎症、肿瘤的不良预后^[20-21]。

乙酰肝素酶作为促血管生成因子和血栓前因子广泛涉及多种愈合过程^[22-23]，乙酰肝素酶在凝血系统中以非酶方式发挥作用，通过上调组织因子表达与组织因子途径抑制物在细胞表面的交互作用^[24]，增加组织因子途径抑制物从细胞内膜上解离，导致细胞内皮表面凝聚^[25]。乙酰肝素酶可增强组织因子活性，导致Xa因子释放增加从而激活凝血系统^[23]。

大量研究证实乙酰肝素酶蛋白表达水平有助于观察股骨头坏死患者血栓及血管生成状态，阐明其高凝状态的机制。本实验旨在探讨乙酰肝素酶及组织因子途径抑制物的蛋白表达水平与特发性股骨头坏死中高凝机制的相关性，阐明低分子肝素预防及治疗股骨头坏死中可能的分子机制，为临床上应用低分子肝素提供理论依据。

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材料方法

1 对象和方法 Subjects and methods

设计：分组对照观察。

时间及地点：病例来源于2012年6月至2013年6月河北医科大学第三医院收治的特发性股骨头坏死患者及股骨颈骨折患者。

对象：选取同期本院收治的特发性股骨头坏死患者36例为实验组，男25例，女11例；年龄33-61岁，平均51.4岁；按照国际骨循环研究会(theassociationresearchcircu- lationosseuse,ARCO)分期Ⅰ-Ⅳ期分为4组，每组9例。另选同期新鲜股骨颈骨折患者，符合实验组纳入标准9例为对照组，男6例，女3例；年龄55-65岁，平均59.2岁；于摔伤后于24-72 h内行髋关节置换。

诊断标准：根据X射线、CT、MRI结合临床症状及体征诊断股骨头坏死或股骨颈骨折。

纳入标准：①符合特发性股骨头坏死诊断者。②影像学检查ARCO分期Ⅰ-Ⅳ期者。③未应用抗凝及促凝等药物。④新鲜股骨颈骨折患者。⑤摔伤后于24-72 h内行髋关节置换者。⑥患者对治疗均知情同意。

排除标准：①有饮酒史，激素应用史者。②既往有肾病、高血压病、糖尿病史、肿瘤病史者。③近期有急、慢性炎症病变者。

ARCO分期：
分期	表现
0期	X射线显示正常、骨扫描有“冷区”与组织活检显示骨坏死
I期	骨扫描或/MRI阳性或两者均为阳性
ⅠA	股骨头病变范围<15%
ⅠB	股骨头病变范围15%-30%
ⅠC	股骨头病变范围>30%
Ⅱ期	股骨头硬化、囊性变、斑点状改变
ⅡA	坏死范围<15%
ⅡB	坏死范围15%-30%
ⅡC	坏死范围>30%
Ⅲ期	软骨下塌陷(新月征出现)，股骨头没有变扁
ⅢA	新月征<15%或股骨头塌陷<2 mm
ⅢB	新月征15%-30%或股骨头塌陷2-4 mm
ⅢC	新月征>30%或股骨头塌陷>4 mm
Ⅳ期	股骨头变扁，关节间隙变窄，髋臼硬化、囊性变

方法：

标本取材：实验组36例患者中，患者ARCOⅠ期行髓芯减压；ARCOⅡ期行股骨头颈灯泡式开窗减压自体髂骨植入；ARCOⅢ期中7例行全髋关节置换，1例行钻孔减压异体腓骨棒植入，1例灯泡式开窗减压自体髂骨植入；ARCOⅣ期行全髋关节置换。对照组均行全髋关节置换。

术前抽取空腹肘静脉血4 mL，加入1%总体积的EDTA，静置20 min，4 ℃离心15 min(1 000×g，3 000 r/min)，提取血浆，分装于EP管中，置于-80 ℃保存。术中取对照组及ARCOⅡ-Ⅳ组股骨头，等分为2部分，一半取等量坏死骨组织及骨髓迅速置于液氮罐中保存，用于Western blot检测；另一部分置于体积分数为10%甲醛溶液中，备用行病理学检查。

血浆中乙酰肝素酶及组织因子途径抑制物测定：将试剂盒与标本置于室温(20-25 ℃) 30 min，分别将乙酰肝素酶、组织因子途径抑制物标准品按浓度次序于酶标板空白微孔中分别加入100 μL的标准品溶液，空白对照加入 100 μL的PBS(pH 7.0-7.2)，其余空白微孔中加入100 μL血浆乙酰肝素酶样品或稀释的血浆组织因子途径抑制物样本(1∶20)；在各孔中加入50 μL的酶标记溶液(不含空白对照孔)；将酶标板用封口胶密封后，37 ℃孵育箱中恒温、恒湿孵育反应1 h；充分清洗酶标板5 次，保持各孔有充足的水压(浓缩洗涤液以1∶100的比例与蒸馏水稀释)；酶标板洗涤后用吸水纸拍干；各孔加入显色剂A 50 μL和B 50 μL；20-25 ℃下避光反应10 min；各孔加入50 μL终止液，终止反应。酶标仪测定450 nm波长的各孔吸光度值，制作标准曲线，测定样品浓度。

股骨头中乙酰肝素酶及组织因子途径抑制物含量测定：用裂解液提取蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后转至PVDF膜，常规免疫染色。乙酰肝素酶一抗工作浓度为1∶600和组织因子途径抑制物一抗工作浓度为1∶1 000；β-actin一抗工作浓度为1∶3 000，4 ℃孵育过夜。二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1∶500)，室温孵育2 h，DAB显色。结果用美国UVP分析仪进行分析，计算条带的灰度。采用目的条带与actin条带的灰度比值表示目的蛋白的表达水平。

病理学检查：大体观察所取股骨头形态，将标本置于体积分数10%中性甲醛溶液中固定，10%的EDTA-Tris缓冲液中脱钙。脱钙完全后取材，逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片行苏木精-伊红染色。光学显微镜观察骨组织、骨髓组织、骨小梁及髓内脂肪组织变化。

主要观察指标：①患者血浆中乙酰肝素酶与组织因子途径抑制物表达。②两组患者患侧股骨头组织中乙酰肝素酶与组织因子途径抑制物表达。③两组患者股骨头组织病理学检查结果。

统计学分析：实验数据以x(_)±s表示。应用SPSS 13.0统计软件，多组资料比较采用ANOVA统计方法进行分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

本组结果发现在坏死股骨头局部骨中乙酰肝素酶及组织因子途径抑制物的表达与外周血液中基本一致，在ARCOⅡ或Ⅲ期中表达较Ⅰ、Ⅳ期高，即在股骨头塌陷前随病情加重而表达增加，在股骨头塌陷后含量较之前有所下降,组间无显著性差异。

股骨头坏死的发病过程是一个非常复杂的过程，骨坏死、骨再生、纤维结缔组织增生相互交织。在ARCOⅠ期骨坏死为主，鲜见骨再生发生，血液处于高凝状态，在众多文献中均有报道^[7,26-29]，本组结果得到了进一步的印正。在ARCOⅡ，Ⅲ期中骨坏死逐渐加剧，血液中的高凝状态持续增加，骨再生开始出现并逐渐增多，乙酰肝素酶含量逐渐增加。在ARCO Ⅳ期中，乙酰肝素酶的含量明显较前

减少，与ARCOⅠ期中含量相当。

本组病理学苏木精-伊红染色中，股骨头坏死区内骨结构基本消失、骨细胞已大部分坏死，骨微细结构破坏，骨小梁断裂，吸收，脂肪细胞融合破坏，骨组织被大量纤维结缔组织所替代，骨再生基本消失，外周血液中的高凝状态明显改善。

实验观察了股骨头坏死患者乙酰肝素酶的体内变化水平与乙酰肝素酶在股骨头坏死不同分期中的变化，证实了随着股骨头坏死的分期加重，骨坏死逐渐增加再到减少过程，与乙酰肝素酶的表达趋于一致。

组织因子途径抑制物主要由微血管内皮细胞产生，正常分布于血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和外膜层的微血管内皮，在血液中以游离和与高密度脂蛋白和低密度脂蛋白结合两种形式存在^[30]。组织因子途径抑制物可正反馈调节凝血途径，乙酰肝素酶的表达升高可影响下游的组织因子途径抑制物表达增强。本组结果发现组织因子途径抑制物的表达与乙酰肝素酶基本一致，且呈正相关性。

特发性股骨头坏死其病理生理机制中脂肪栓塞、血管内凝血和骨坏死3者共存，其最终表现为血管内凝血，作为一个共同通路导致股骨头坏死。特发性股骨头坏死患者的血液处于高凝状态，可能是通过多种潜在的病原因素(骨内脂肪栓塞、内毒素、过敏反应等和其他一些前栓塞情况)激活导致血管内凝血^[26-27]。

Korompilias等^[28]对204例股骨头坏死患者研究中发现约83%患者有凝血障碍。Glueck等^[16]研究证实肝素可以预防治疗股骨头坏死，延缓疾病发展。Peleda等^[31]在股骨头坏死动物模型中发现股骨头中乙酰肝素酶及组织因子途径抑制物表达增高。本组结果进一步证实该改变在人体中的存在及其含量与疾病分期的关系，可作为早期监测的股骨头坏死中血液凝血指标。

乙酰肝素酶可明显影响凝血系统，参与血管生成、炎症反应、肿瘤转移等多种过程^[32-42]，并在股骨头坏死中发挥重要作用。乙酰肝素酶与肝素在体内呈平衡状态，肝素与血浆中的抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)结合成复合物，AT-Ⅲ是一种a2-球蛋白，是凝血酶的抑制物，它对激活的凝血因子XⅡa、激肽释放酶、Ⅺa、Ⅸa、Ⅹa、和ⅩⅢa均有抑制作用，以Ⅹa为主。肝素治疗股骨头坏死的机制是有效降低乙

酰肝素酶血浆浓度、下调由乙酰肝素酶增高的Ⅹa因子浓度，并抑制Ⅹa因子的活性，改善股骨头坏死患者的血液促凝状态，有效降低高凝状态，改善血流，达到治疗和预防股骨头坏死。从靶点方面证实了Glueck等^[16]和Norman等^[17]的肝素预防治疗股骨头坏死的研究，但详细分子学通路仍需进一步研究探讨。

本实验样本数较少，仅研究了特发性股骨头坏死患者坏死估计外周血液中的蛋白改变，肝素治疗和预防股骨头坏死是一个复杂的过程和机制，其他乙酰肝素酶抑制剂如硫酸化寡聚糖复合物(sulfated oligosacharide phosphomannopentaose sulfate，PI-88)对股骨头坏死的预防及治疗仍需研究证实。乙酰肝素酶可以用于长期应用激素、酗酒等高危人群股骨头坏死监测的指标，通过降低血浆乙酰肝素酶水平，抑制骨坏死的发展，做到真正意义上预防性治疗。

综上所述，在股骨头坏死疾病发生发展过程中，凝血系统发挥重要作用，乙酰肝素酶及组织因子途径抑制物随着坏死程度加重表达发生改变，在病情发展中发挥重要作用。

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